Yelitza Coromoto Alcedo¹ e Isbelia Reyes²

¹ Instituto Nacional de Salud Agrícola Integral Laboratorio de Diagnóstico Fitosanitario INSAI Táchira, San Cristóbal, Venezuela. e-mail: yeli_alcedo@hotmail.com

² Universidad Nacional Experimental del Táchira, Laboratorio de Biofertilizantes. Apdo. 5001. San Cristóbal, Venezuela. e-mail: isreyes@unet.edu.ve (autor de correspondencia)

RESUMEN

Se evaluó el efecto biocontrolador en condiciones de laboratorio y umbráculo de cinco microorganismos promotores de crecimiento de plantas (MPCP): Trichoderma koningii aislado Vp, Penicillium rugulosum aislado IR, Penicillium sp. aislado 20, Enterobacter sp. cepa CR y Bacillus megaterium cepa 24B2 sobre dos aislados del patógeno identificado como Alternaria alternata (475 y 485), en el cultivo de tomate (Solanum lycopersicum L.). Para esto, se realizaron pruebas de: 1) antagonismo y germinación en laboratorio, 2) crecimiento en semillero, y 3) crecimiento en macetas utilizando un suelo natural. El efecto biocontrolador de los MPCP mostró que T. koningii Vp ejerció el mayor efecto antagónico sobre los dos aislados de A. alternata desde el inicio hasta las 72 h de medición, y asimismo incrementó significativamente (P≤0,05) el porcentaje de germinación de las semillas de tomate. En el ensayo de semillero se encontró que las plántulas de S. lycopersicum inoculadas con los MPCP, T. koningii Vp y P. rugulosum IR presentaron el menor porcentaje de infección del patógeno. En la etapa de maceta, el porcentaje de manchas de infección en la hoja de la planta del tratamiento inoculado con T. koningii Vp mostró un biocontrol significativo (P≤0,05) sobre los patógenos, seguido del aislamiento de Enterobacter sp. cepa CR. Los MPCP evaluados en los diferentes bioensayos mostraron variabilidad en sus competencias de biocontrol y de promoción del crecimiento de las plantas de tomate, en relación al aislado del patógeno A. alernata y al estado de crecimiento de la planta.

Palabras clave adicionales: Antagonismo, Enterobacter sp., MPCP, Penicillium rugulosum, Trichoderma koningii

Plant growth promoting microorganisms on biocontrol of Alternaria alternata in tomato (Solanum lycopersicum L.)

ABSTRACT

The biocontrol effect of five plant growth promoting microorganisms (PGPM): Trichoderma koningii strain Vp, Penicillium rugulosum strain IR, Penicillium sp. strain 20, Enterobacter sp. strain CR, and Bacillus megaterium strain 24B2 was evaluated in laboratory and greenhouse conditions on two isolates of the pathogen Alternaria alternate identified as 475 and 485, during the cultivation of tomato plants (Solanum lycopersicum L.). For this, it was stated the following steps: 1) antagonism and germination in laboratory conditions, 2) plantlet growth in propagation trays, and 3) plant growth in pots using a natural soil. The biocontrol effect of these PGPM showed that T. koningiiVp induced the most antagonistic effect since the beginning until 72 hours of measuring on the two isolates of A. alternata, and also the germination percentage of seeds was increased significantly (P≤0.05).Likewise, at greenhouse conditions, itwas found that plantlets inoculatedwith both PGPM, T. koningii Vp and P. rugulosum IR, showed the lowest percentage of infection for the two pathogen isolates. In the pot experiment, the percentage of leaf spot infection on the plants inoculated with T. koningii Vp showed a significant (P≤0.05) biocontrol over pathogens, followed by those inoculated with Enterobacter sp. strain CR. It is concluded that PGPR evaluated over different experiments showed variability in their biocontrol competence and plant growth promotion of tomato, related to the pathogen A. alternate and the plant growth state.

Recibido: Febrero 5, 2017 Aceptado: Noviembre 13, 2017

INTRODUCCIÓN

Una de las hortalizas más difundidas y de mayor valor económico mundial es el tomate, cuya demanda aumenta continuamente y con ella su producción y comercio. Sin embargo, dentro de los factores limitantes de la producción juegan un papel primordial aquellos de orden fitosanitario como los hongos del género Alternaria, particular-mente A. alternata que causa severas pérdidas económicas, especialmente en el producto para la industria (Mejía y Hernández, 2001).

En la agricultura convencional moderna los fungicidas son la principal herramienta empleada para el control de hongos fitopatógenos. El uso continuo y excesivo de estos productos químicos ha traído como consecuencia el desarrollo de resistencia a los fungicidas utilizados. Por otra parte, existe una gran variedad de microorganismos susceptibles de ser usados como elementos biológicos de control de enfermedades por interferir en la biología de los microorganismos patógenos de plantas, denominados agentes de biocontrol. Algunos de estos agentes son reconocidos como microorganismos promotores del crecimiento de plantas (MPCP) ya que colonizan las raíces con efectos benéficos en el desarrollo y crecimiento vegetal (Compant et al., 2005).

Diversos géneros de MPCP han sido utilizados para incrementar la producción de múltiples cultivos, bien sea por su participación en el control biológico de hongos y bacterias fitopatógenas (Carrillo et al., 2000), por su relación con la resistencia sistémica inducida (RSI) (Pieterse et al., 2014), por mejorar la salud vegetal al fijar nitrógeno atmosférico (Carrillo et al., 2000), disolver fosfatos inorgánicos (Reyes et al. 2008; Peña y Reyes, 2007). Este tipo de microorganismos benéficos ofrece una alternativa ambiental y económica al uso de fungicidas químicos, mediante la protección sistémica de los cultivos (Berg, 2009). Dada la importancia de estos microorganismos para el manejo sustentable de los cultivos, el objetivo del presente trabajo fue evaluar MPCP como agentes biocontroladores del hongo Alternaria spp. en tomate.

MATERIALES Y MÉTODOS

Aislamiento e identificación de Alternaria spp. Para aislar el hongo, se realizó un muestreo en plantas de tomate atacadas por este patógeno provenientes de los municipios Jáuregui y José María  Vargas  del  estado  Táchira.  Los  aislados de Alternaria spp. se identificaron utilizando microcultivos en PDA (Vera et al., 2005). Se sembró el patógeno en estudio y se llevó a una incubadora a una temperatura 27 ± 2 ^°C. A los 4 días de incubación se colocó una muestra en un portaobjeto, se tiñó con lactofenol azul de algodón y utilizando un microscopio compuesto se observó la formación de los conidios característicos del patógeno. Para su identificación se utilizó la clave de Actualización en los Sistemas de Clasificación e Identificación de Hongos Hifomicetos (Castañeda, 2004).

Pruebas de antagonismo. Estas pruebas se realizaron en condiciones de esterilidad utilizando una cámara de flujo laminar (Telfparbio II B) y se ejecutó el procedimiento según la metodología empleada por Vera et al. (2005). Para esto, los aislados de Alternaria spp. se evaluaron mediante pruebas de antagonismo con diferentes MPCP del banco de bacterias y hongos rizosféricos del Laboratorio de Biofertilizantes de la Universidad Nacional Experimental del Táchira (UNET), en San Cristóbal, de donde se seleccionaron tres hongos, Trichoderma koningii aislado Vp, Penicillium rugulosum aislado IR y Penicillium sp. aislado 20, y dos cepas bacterianas, Enterobacter sp. cepa CR y Bacillus megaterium cepa 24B2, como potenciales biocontroladores. La velocidad de crecimiento de los aislados seleccionados se evaluó mediante seis mediciones del crecimiento del diámetro de las colonias a intervalos de 12 h. Se realizaron comparaciones para determinar los microorganismos más eficientes como antagónicos (Vera et al., 2005). Se utilizaron como testigos los aislados de Alternaria spp. sembrados en el mismo medio sin los MPCP, a los cuales se les midió el crecimiento de manera similar a la ya descrita.

Efecto de los MPCP sobre la germinación de las semillas de tomate infectadas por los patógenos. Se utilizaron semillas certificadas de tomate (Solanum lycopersicum L.) variedad Río Grande de crecimiento determinado. Éstas se desinfectaron por inmersión en etanol al 80 % por 5 min bajo condiciones de asepsia utilizando una cámara de flujo laminar (Telfparbio II B), luego se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio comercial al 5,25 % durante 5 min y por último, se enjuagaron con abundante agua destilada desionizada. Posteriormente se les dejó escurrir bajo las mismas condiciones de esterilidad descritas anteriormente. Los aislados, tanto de los patógenos como de los MPCP, fueron masificados de acuerdo al mejor medio de cultivo para su crecimiento (Peña y Reyes, 2007), los cuales fueron el medio agar papa dextrosa (PDA) en el caso de los patógenos y el medio completo mineral (CM) (Reyes et al., 2002) para los MPCP.

Cada una de las bandejas se cubrió con una película transparente (Envoplast) y se hicieron pequeñas perforaciones a la misma para permitir la aireación; luego se mantuvieron bajo condiciones semi-estériles y de oscuridad dentro de una cámara de flujo laminar y finalmente, se realizaron observaciones de la emergencia de las plántulas cada dos días durante una semana.

Efecto de los MPCP sobre el crecimiento de las plántulas en semillero e infectadas por los patógenos. Las semillas de tomate se sembraron e inocularon con los microorganismos que presentaron los mejores resultados en las pruebas de antagonismo como MPCP. Las semillas se desinfectaron y los microorganismos patógenos y los promotores del crecimiento seleccionados se masificaron de acuerdo a la metodología explicada anteriormente. Se utilizaron bandejas de propagación y se colocaron tres semillas por celda con 100 g de sustrato constituido por turba canadiense.

Se utilizó una bandeja de 36 celdas para cada tratamiento. Los MPCP fueron inoculados en el sustrato al momento de la siembra agregando 1 mL de las diferentes suspensiones de 8-10 x 10⁸ UFC·mL^-1 por celda. Las inoculaciones de los patógenos se realizaron tanto en el sustrato como en las plántulas en forma foliar y en la emergencia de las primeras hojas verdaderas. Para la inoculación en el sustrato se agregó 1 mL de cada suspensión por celda a una densidad de 1-5 x 10⁵ UFC·mL^-1, 10 días después de la germinación. Luego, con esta misma densidad microbiana se realizó una reinoculación de los patógenos en aspersión foliar a los 21 días de crecimiento de la planta. Las bandejas fueron regadas cada 2 días y fertilizadas dos veces cada 7 días con la solución nutritiva de Hoagland al 25 % de fortaleza. A los 7 días después de la germinación se realizó un raleo dejando una plántula por celda. Se realizaron observaciones de la presencia de síntomas (manchas marrones) cada 7 días después de la inoculación. Finalmente se calculó el porcentaje de infección considerando que una planta estaba infectada al presentar los primeros síntomas de la enfermedad. Se emplearon 36 plántulas por bandeja, con 4 semanas de crecimiento, en los diferentes tratamientos.

Efecto de los MPCP en el crecimiento de plantas infectadas en condiciones de umbráculo. Se utilizaron tres plántulas de tomate, de 4 semanas de crecimiento provenientes de los semilleros, en macetas con 5 kg de sustrato. Como sustrato se utilizó un suelo natural, no tratado, sin historia de siembra del cultivo. Los aislados, tanto de los patógenos como de los microorganismos con potencial bio-controlador, fueron masificados como se señaló anteriormente. A los 7 días después del trasplante se realizó el respectivo raleo dejando una planta por maceta y a los 15 días se realizó el tutorado de las plantas. Al cabo de 40 días de crecimiento se realizó la primera fertilización y a los 45 días se inocularon los MPCP en el suelo agregando 10 mL de la dilución microbiana respectiva por maceta. Los patógenos fueron inoculados en el suelo 8 días después de haberse agregado los MPCP y se aplicó 10 mL de la suspensión de 1-5 x 10⁵ UFC·mL^-1. La inoculación de los patógenos también se realizó en forma foliar en aspersión dos veces, a 16 días después de la aplicación de los MPCP y a 69 días de crecimiento. El riego se aplicó diariamente y se fertilizó tres veces cada 5 días con la solución nutritiva de Hoagland al 100 %. Quince días después de la última inoculación con los patógenos se observaron los primeros síntomas de la enfermedad en las plantas y se realizaron las evaluaciones del nivel de infección, tal como se describió anteriormente. Se realizaron ocho réplicas por cada tratamiento y el testigo no inoculado.

Los resultados de las pruebas de antagonismo se compararon mediante estadística descriptiva, mientras que las pruebas de germinación y bio-control se analizaron mediante la prueba no paramétrica por rangos de Kruskall-Wallis empleando el programa SPSS, versión 10.

Resultados Y DISCUSIÓN

Identificación de los aislados de Alternaria spp. Se obtuvieron dos aislados de Alternaria spp., uno del municipio José María Vargas y otro del municipio Jáuregui, los cuales fueron codificados como 475 y 485, respectivamente. Dichos aislados fueron identificados mediante las siguientes características: conidios catenulados, verruculosos, elipsoides, con un rostro cilíndrico, provistos de 3-8 septos transversales y 1-5 longitudinales u oblicuos, 15-45 x 7-20 µm; con el rostro pardo pálido, correspondiendo dichos aislados ala especie Alternaria alternata. Dada las diferentes características presentadas por los dos aislados identificados como A. alternata, se presume que deben pertenecer a diferentes subespecies.

Selección de los MPCP mediante pruebas de antagonismo con A. alternata. De los tres hongos utilizados se encontró que T. koningii Vp fue el que ejerció mayor efecto antagónico entre 36 y 72 horas con ambos aislados de A. alternata, seguido de Penicillium sp. 20. En el caso de las bacterias seleccionadas, los resultados de las pruebas de antagonismo mostraron que sólo Enterobacter sp. CR ejerció un mejor efecto antagónico con los dos aislados (Cuadros 1 y 2).

Es de resaltar que los dos aislados del patógeno expresaron diferencias en su crecimiento ante la actividad biocontroladora de estos micro-organismos, encontrándose al aislado A. alternata 475 con mayor resistencia a la actividad biocontroladora de los MPCP utilizados. En general, en relación al género Trichoderma, especies como T. harzianum, T. atroviride, T virens, T. koningii, entre otras, han sido reconocidas para su uso en la agricultura porque actúan no sólo como agentes biocontroladores mediante acciones como el micoparasitismo, la antibiosis, la competición por nutrientes y la estimulación de la resistencia sistémica de las plantas ante diferentes patógenos, sino también en la tolerancia al estrés abiótico, la promoción del crecimiento y el desarrollo vegetal en la producción del cultivo; sin embargo, estas características dependen más de los aislados de Trichoderma, que de la especie (Martínez et al., 2013; Waghunde et al., 2016). Es bien conocido en Trichoderma la producción de enzimas líticas extracelulares en mecanismos de micoparasitismo como quitinasas, glucanasas, polisacaridasas, proteasas y lipasas que degradan las paredes celulares del patógeno, y metabolitos secundarios en mecanismos de antibiosis como las alquilpironas, isonitrilos, poliquétidos, peptaibioles, sesquiterpenos, dicetopiperacinas y esteroides (Martínez et al., 2013). En trabajos realizados in vitro, T. harzianum mostró inhibición de las esporas de Fusarium oxysporum sp. lycopersici en un 33 %, mientras que T. atroviridae redujo la germinación de esporas del mismo patógeno en un 57 % (Hermosa et al., 2012). En T. pseudokoningii SMFE se demostró una actividad antibiótica contra patógenos fúngicos como F. oxysporum al producir el peptaiboltrichokonin VI e inducir una extensiva apoptosis o muerte celular programada (Shi et al., 2012).

Efecto de los MPCP sobre la germinación de las semillas de tomate expuestas al patógeno A. alternata. Se observó que la germinación de las semillas de tomate se incrementó significativa-mente con la inoculación del hongo T. koningii Vp con respecto al testigo no inoculado, lo que demuestra su actividad promotora del crecimiento (Cuadro 3). Así mismo, T. koningii Vp ejerció un efecto biocontrolador y mantuvo su efecto promotor en la germinación de las semillas infectadas por los dos aislados de A. alternata. Estos resultados sugieren que los MPCV pudiesen constituir una biotecnología prometedora en la etapa de producción de plántulas. Según Benítez et al. (2004), la colonización de semillas por Trichoderma puede generar plantas más robustas, con resistencia a la sequía y más eficientes en la absorción de los nutrientes del suelo.

Efecto de los MPCP en la infección de A. alternata en plántulas de tomate. En la Figura 1 se observa que los tratamientos inoculados con los hongos biocontroladores T. Koningii Vp y P. rugulosum IR tuvieron igual comportamiento y presentaron el menor porcentaje de infección (2,70 %) del patógeno aislado 475 en comparación con el aislado 485 (5,41 %), mientras que los testigos de A. alternata 475 y 485 presentaron los mayores valores de infección en las hojas, 24,32 y 27,03 %, respectivamente, con los síntomas de manchas marrones características de la enfermedad.

Así mismo, se observa para todos los casos que el aislado A. alternata 485 ejerció un mayor efecto patogénico bajo estas condiciones. La habilidad de cepas de Trichoderma sp. para proteger plantas contra patógenos ha sido atribuida sobre todo a su efecto antagonista contra la invasión del patógeno (Waghunde et al., 2016); sin embargo, otros trabajos demuestran que Trichoderma sp. (Li et al., 2015) y otros hongos como Penicillium sp. (Reyes et al., 2002; Murali et al. 2016) participan en la inducción del crecimiento de las plantas promovida por el desarrollo de raíces, y que combinado con mecanismos indirectos como la disolución de nutrientes minerales estarían incidiendo en plantas más robustas y resistentes al ataque de patógenos y a condiciones ambientales adversas. Estas asociaciones de raíz-hongo también estimulan los mecanismos de defensa de la planta contra diferentes clases de patógenos, mediante mecanismos de resistencia sistémica (Martínez et al., 2013).

Biocontrol de los MPCP en plantas de tomate contaminadas con A. alternata en condiciones de umbráculo. En cuanto al desarrollo de manchas de infección en las plantas de tomate después de la inoculación foliar de los dos aislados del patógeno, previa inoculación con los MPCP, se encontró que los potenciales biocontroladores de A. alternata fueron T. koningii Vp, para el aislado 485 y Enterobacter sp. CR para el aislado 475 (Cuadro 4). En trabajos realizados con T. harzianum éste incrementó el contenido de ácido salicílico y ácido jasmónico en melón contra el patógeno F. oxysporum (Contreras et al., 2016). Dependiendo de las cepas de Trichoderma sp. este hongo activa el mecanismo sistémico de defensas de la planta a través del ácido jasmónico y del etileno, pudiendo también intervenir en la producción del ácido salicílico, mensajero de la resistencia sistémica adquirida; sin embargo, en tomate su efecto benéfico ha sido encontrado modulado por el genotipo de la planta (Tucci et al., 2011). También existen reportes de especies reactivas de oxígeno como peróxido de hidrógeno y óxido nítrico asociadas a Trichoderma como mediadores de inmunidad en plantas de algodón y Arabidopsis thaliana (Contreras et al., 2016). Igualmente en un trabajo realizado con A. thaliana, la colonización de las raíces por Penicillium sp. cepa GP16-2 promovió la resistencia sistémica inducida (RSI) contra la infección de P. syringae pv. tomato cepa DC3000 restringiendo el crecimiento del patógeno y desarrollo de la enfermedad; la RSI mediada por GP16-2 ha sido directamente correlacionada con la producción de los ácidos salicílico y jasmónico, y del etileno (Hossain et al., 2008). Por otra parte, T. virens cepa G-6 mostró protección de las plantas de algodón contra el patógeno Rhizoctonia solani y redujo la enfermedad en un 78 %; similarmente T. harzianum cepa NF-9 inoculado en plantas de arroz, produjo resultados significativos en la RSI contra los patógenos Magnaporthe grisea y Xanthomonas oryzae (Contreras et al., 2016).

Finalmente este trabajo muestra la importancia de evaluar en distintas etapas experimentales y con el cultivo de interés, a los microorganismos benéficos con potencial biocontrolador y promotor del crecimiento vegetal, los cuales siempre deben ser caracterizados previamente en relación a su taxonomía y bioquímica (Peña y Reyes, 2007; Reyes et al., 2008). En general, se pudo observar que en los experimentos con la planta, T. koningii Vp expresó un mayor biocontrol del porcentaje de infección de las plántulas con el patógeno Alternaria-475, mientras que en el desarrollo de las manchas de infección, a los 93 días de crecimiento del cultivo de tomate, el mayor biocontrol lo ejerció sobre Alternaria-485. Estos resultados sugieren que existen diversos factores que inciden en esta relación microorganismo-microorganismo-planta, y donde probablemente el sustrato y la biología inherente de cada organismo en sus distintas interrelaciones despliega en sus genomas un potencial de posibilidades de supervivencia que  puede ser considerado.

Se reportan dos aislados diferenciados de A. alternata en relación a las pruebas de biocontrol con los MPCP, observándose in vitro con el hongo T. koningii cepa Vp y la bacteria Enterobacter sp. cepa CR los mayores efectos antagónicos. Así mismo T. koningii Vp, además de ejercer un alto efecto biocontrolador, mantuvo su actividad promotora del crecimiento de las plántulas y  germinación de semillas de tomate expuestas con los aislados de los patógenos. Durante la etapa de semillero las plántulas de tomate inoculadas con T. koningii Vp y P. rugulosum IR presentaron el menor porcentaje de infección con los dos aislados de A. alternata; sin embargo, en la etapa de umbráculo T. koningii Vp y Enterobacter sp. CR mostraron diferente respuesta como controladores específicos a los  aislados de este patógeno.

En general, en las diferentes etapas experimentales desde laboratorio hasta desarrollo en maceta, se encontró consistentemente una respuesta de biocontrol hacia A. alternata por el hongo T. koningii Vp. El doble efecto ejercido por este hongo como promotor de crecimiento del tomate e inductor de resistencia contra este patógeno, muestra la importancia de este hongo para el manejo de una agricultura sustentable del tomate. Finalmente se plantea para investigaciones posteriores si la respuesta ejercida por T. koningii Vp puede ser observable para otras solanáceas afectadas por A. alternata y hacia otros patógenos de importancia comercial.

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