María Gabriela Barrios1, Emilia Elena Barrios1,2, María Lorena Marquez3, Rowhiny Hernández1, Juan Fernando Quintana4, Olga Ojeda1
1 Laboratorio de Helmintología del Instituto de Biología Molecular de Parásitos (Instituto BioMolP). Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo. Valencia, Venezuela.
2 Departamento de Investigación y Desarrollo Profesional, Escuela de Bioanálisis. Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo. Valencia, Venezuela.
3 Laboratorio de Cultivo de Tejidos y Biología de Tumores. Instituto de Biología Experimental. Facultad de Ciencias. Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
4 Centre for Immunity, Infection and Evolution, University of Edinburgh, Ashworth Laboratories, West Mains Road, EH93JT, Edinburgh, UK.
Correspondencia: Emilia Barrios. E-mail: barrios.emilia@gmail.com
RESUMEN
Los rotíferos y ciliados son microorganismos que cohabitan con B. glabrata, y en el caracol infectado comparten espacio con el parásito S. mansoni, agente causal de la esquistosomosis. La experiencia con crías en cautiverio sugiere que la presencia de tales microorganismos puede afectar la evolución del parásito en el caracol, debido a competencia por espacio y nutrientes. En base a esto se evaluó el efecto de los rotíferos y ciliados, sobre la emisión de cercarias de S. mansoni por el molusco B. glabrata mantenida en cautiverio. En los experimentos se emplearon cinco grupos de 10 caracoles infectados con 10 miracidios de S. mansoni, los cuales, se colocaron en recipientes plásticos, con: (a) 87500 rotíferos y 25000 Paramecium sp, (b) 27000 rotíferos y 54000 Paramecium sp, (c) 800000 rotíferos, (d) 4500 Paramecium sp y rotíferos, respectivamente y (e) el grupo control de infección se mantuvo sin rotíferos y ciliados. Se demostró un efecto de inhibición en la emisión de las cercarias de S. mansoni en presencia de rotíferos y Paramecium sp, dependiente de la cantidad de organismos presentes. El porcentaje de inhibición en la emisión de las cercarias de S. mansoni se relacionó con la presencia de un gran número de rotíferos. El presente trabajo constituye el primer hallazgo que sugiere que organismos de los phyllum Rotifera y Ciliophora podrían ser empleados como control biológico de la infección por S. mansoni.
Palabras clave: Biomphalaria glabrata, Schistosoma mansoni, rotiferos, Paramecium sp.
]]> Effect of aquatic organisms (rotifers and ciliate) on the issuance of Schistosoma mansoni larvae by Biomphalaria glabrata maintained in laboratoryABSTRACT
The rotifers and ciliates are microorganisms that coexist with B. glabrata, Inside tissues normally infected by S. mansoni in the snails. the causative agent of schistosomiasis. The captive breeding experience suggests that the presence of such microorganisms can affect the evolution of the parasite in the snail, because competition for space and nutrients. The effect of rotifers and ciliates in the release of cercariae of S. mansoni by the mollusc B. glabrata maintained in captivity. The experimental setting was constituted by five groups of snails (n=10) infected with 10 miracidia from S. mansoni, which were placed in plastic containers with (a) 87500 25000 rotifers and Paramecium sp, (b) 27000 54000 rotifers and Paramecium sp, (c) 800000 rotifers, (d) Paramecium sp 4500 and the same number of rotifers and (e) infection control group remained rotifers and ciliates. It was possible to observe an number-dependent inverse correlation between the release of cercaria from S. mansoni and the number of rotifers and Paramecium sp. Used in this study. Particularly, the percentage of inhibition was strongly associated with the presence of large numbers of rotifers. To date, these are the first findings suggesting that microorganisms from the genus ciliata, subphylum Crustacea, are capable of regulating S. mansoni lyfe cycle progression in the snail stage, therefore could be potentially used as biological controls for the infection caused by S. mansoni.
Key words: Biomphalaria glabrata, Schistosoma mansoni, rotifers, Paramecium sp.
INTRODUCCIÓN
La infección causada por el Schistosoma mansoni, la esquistosomosis, afecta a un promedio de 200 a 300 millones de personas a nivel mundial. Entre los continentes afectados América Latina destaca con países como República Dominicana, Puerto Rico, Surinam, Brazil y Venezuela (1).
La región centro-norte costera de Venezuela es un área geográfica que ofrece condiciones que favorecen la transmisión de este parásito, puesto que las condiciones climáticas y la presencia de los caracoles necesarios para que parte del ciclo del parásito se desarrolle se encuentran presentes, siendo esta una zona con ríos y riachuelos relacionados a actividades productivas, como la pesca o la agricultura y más recientemente la actividad turística, lo que realza la importancia de controlar la transmisión de esta infección sin alterar el ambiente ecológico (2).
B. glabrata es una especie de caracol que habita en aguas dulces y en Venezuela, es el principal hospedador intermediario del tremátodo S. mansoni. El parásito en el molusco, se multiplica hasta transformarse en una larva denominada cercaria, posteriormente alcanza el medio acuático, donde al entrar en contacto con el hombre y ocasiona una enfermedad denominada esquistosomosis. La infección se caracteriza por fiebres altas, dolores abdominales, diarreas, tos, entre otras patologías en el organismo (3).
El control de la esquistosomosis en las áreas endémicas constituye una gran problemática sanitaria, debido a que una vez desarrollada en el humano, el daño a nivel hepático es irreversible, y la lesión puede ir desde daño grave hasta ocasionar la muerte al paciente por una insuficiencia hepática, fibrosis, cirrosis, e Hipertensión Portal (4). Por tanto, se ha intentado controlar la transmisión de la infección empleando sustancias molusquicidas, sin embargo, su alta toxicidad no solo para el caracol, sino también a la flora y fauna que cohabita con este, hacen del control por este medio inviable, en especial, cuando se trata de ríos, canales de riegos, represas y lagunas con fines de cultivo de peces y plantas para el consumo humano (5). Desde un punto de vista ecológico, el control biológico que no lesione el ambiente es la salida ideal, no obstante, hasta ahora las estrategias empleadas, entre ellas el uso de caracoles de otras especies que compitan por el espacio geográfico de B. glabrata no fueron exitosas para controlar la infección (6).
Lo anterior determina que el control de la infección se base exclusivamente en el tratamiento del paciente infectado con una droga denominada praziquantel, que actúa sobre los gusanos adultos, pero que no previene la infección ni limita las secuelas a nivel hepático o intestinal (7). Además algunas evidencias sugieren que el parásito puede desarrollar resistencia a la acción del praziquantel, ocasionando que sea deficiente como estrategia de control de la infección a dosis única (8).
]]> La experiencia acumulada a lo largo de veinte años manteniendo el ciclo del parásito en su hospedador intermediario, B. glabrata en cautiverio, sugiere que microorganismos acuáticos diferentes al parásito pueden influir en el desarrollo de la infección por S. mansoni. A través de observaciones realizadas en las crías del Laboratorio del grupo de investigación, se ha observado una relación entre la disminución en la emisión de larvas del parásito provenientes de caracoles infectados experimentalmente y el aumento de organismos de los Phyla ses Rotífera y Ciliophora (rotíferos y Paramecium sp.), en el agua de las crías.Por tanto, un mecanismo de control biológico potencial de la transmisión de la infección por S. mansoni al humano, podría basarse en aumentar la presencia de organismos acuáticos de vida libre como son rotíferos y ciliados, ya que al parecer estos constituyen una competencia por el espacio en los tejidos del caracol, que parece limitar la multiplicación de las larvas del parásito y en consecuencia podrían limitar la transmisión al humano. La observación de ésta fauna acuática en condiciones de infección experimental, por lo tanto, podría aportar datos que confirmen si la existencia de dicha fauna afecta la continuidad de la infección y si podría, en consecuencia, tener efectos sobre la transmisión de la infección al humano. En tal sentido, se evaluó el efecto de los microorganismos acuáticos (rotíferos y ciliados) sobre la emisión de cercarias de S. mansoni por el molusco B. glabrata infectado.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los caracoles B. glabrata y las otras especies empleadas en los procedimientos metodológicos provenían de crías mantenidas en cautiverio en el Laboratorio de Helmintología del Instituto BioMolP de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Carabobo. De igual manera, los miracidios empleados en los experimentos con caracoles infectados provenían del ciclo de mantenimiento de Schistosoma mansoni entre hámsters dorados (Mesocricetus auratus) y B. glabrata en el Laboratorio (9). Para ello, los hámster fueron sacrificados previa anestesia con cloroformo, a las 7 semanas de infección con cercarias de S. mansoni del aislado Puerto Rico. Los huevos obtenidos de hígados e intestinos fueron colocados en agua declorinada, y estimulados con luz de una lámpara para favorecer la eclosión de los huevos y salida de los miracidios. Luego cada caracol se colocó en un pozo plástico con aproximadamente 10 miracidios recién salidos de los huevos, y se incubaron por 6 horas a temperatura ambiente.
Se emplearon cinco grupos experimentales con 10 caracoles infectados como se describió previamente. Estos se colocanlos cuales, se colocaron en recipientes plásticos de aproximadamente 12x6cm, con diferentes números de ciliados y rotíferos.En el grupo 1 se emplearon 87500 rotiferos y 25000 Paramecium sp, en el segundo 27000 rotiferos y 54000 Paramecium sp, en el tercero 800000 rotiferos, en el cuarto, 4500 rotiferos e igual número de Paramecium sp. El quinto grupo de caracoles infectados se dejó sin ciliados ni rotíferos en el agua, y constituyó el grupo control de infección. Los grupos en su totalidad fueron mantenidos en recipientes de plástico rectangulares con agua declorada y lechuga Ad libitum, en una proporción de un recipiente por cada grupo de 10 caracoles. La evaluación de la infección se hizo a la quinta semana luego de la infección de los caracoles e incubación con los organismos acuáticos. Todos los procedimientos con los animales de experimentación se siguieron tomando como referencia los principios bioéticos del Código de Bioética y Bioseguridad del Fondo Nacional de Ciencia Tecnología e Innovación (10).
Obtención de rotíferos y ciliados. Se recolectó agua de las peceras con crías de caracoles B. glabrata mantenidas sin reemplazo ni limpieza de las peceras por un mes. El agua recolectada se dejó sedimentar las heces y elementos sólidos, por 1 hora en cilindros de vidrio de 5 L. Luego se recolectó el sobrenadante en tubos cónicos de 15 ml y se centrifugaron a 5000 rpm por 10 min, en centrífuga refrigerada (HERMLE, modelo Z400) y los sedimentos obtenidos fueron examinados al microscopio de luz, para visualizar y contar los rotíferos y ciliados presentes. Los sedimentos con los organismos, se resuspendieron en agua declorada (en la proporción antes señalada) y se colocaron en peceras con caracoles B. glabrata de 7 a 10 mm de diámetro de concha, previamente infectados con 10 miracidios de S. mansoni.
Análisis de los datos: Los contajes de cercarias en caracoles infectados y co-infectados con rotíferos y Paramecium sp., se expresaron como el promedio ± desviación estándar. Luego se estimó el rendimiento de la infección en los grupos co-infectados y los controles infectados en ausencia de los organismos de vida libre expresados en porcentaje. Los datos referentes a la morfología de ciliados, rotíferos y cercarias se registraron fotográficamente en un fotomicroscopio (Nikon, Eclipse 600) equipado con una cámara (Coolpix 900) y los datos de numéricos fueron presentados a través de gráficos de barra.
RESULTADOS
Las características morfológicas de los organismos de vida libre, fueron típicas del Phylum Rotifera como es la corona, los pies de fijación, el segmento anal, el mástax y la rama caudal, descritas por otros autores (11) (Fig 1).
Al analizar el rendimiento de la infección en cada grupo se obtuvo que en el grupo 1 de B. glabrata coinfectada, se obtuvo una emisión de 1500 ± 15 cercarias de S. mansoni. En los grupo 2 y 3, no hubo emisión de cercarias. Mientras que en el grupo 4, donde se empleó el mismo número de rotíferos y ciliados (4500), la emisión fue de 28000 ± 12 cercarias (Gráfico 1). En los grupos empleados como control de infección se obtuvo un promedio de emisión de 57600±24373 cercarias.
Estos datos muestran que los grupos 1 y 4, la cantidad de ciliados y rotíferos empleados en el medio acuático no impidió que el parásito se multiplicara y se produjeran cercarias, no obstante, el número de cercarias emitidas fue menor a las de el grupos control. En contraste, en los grupos 2 y 3, incubados con un mayor número de rotíferos y ciliados o con un gran número de rotíferos no se observó emisión de cercarias, demostrando de forma indirecta que la inhibición de la emisión de cercarias parece estar relacionada con la presencia de gran número de rotíferos, mas que a la presencia de Paramecium sp.
Al calcular el porcentaje de inhibición en la emisión de las cercarias correspondiente a cada grupo de co-infección, tomando como referencia el grupo infectado sin presencia de rotíferos y Paramecium, se encontró que en el grupo 1 de co-infección hubo una disminución de 98,3% en la emisión de las cercarias. En los grupos 2 y 3 fue 100% y en el grupo cuatro de 63% (Gráfico 2).
DISCUSIÓN
La competencia por espacios y nutrientes entre organismos es un hecho frecuente dentro de los ecosistemas, en el presente trabajo se evaluó el efecto de microorganismos acuáticos (rotíferos y Paramecium sp.), sobre larvas de S. mansoni a fin de definir si existe una relación con la disminución en la emisión de las cercarias, estadios larvarios importantes en la transmisión de la esquistosomosis al humano.
]]> Las diferencias observadas parecen estar relacionadas con el número de rotíferos y Paramecium empleados, también parece indicar que la inhibición de la emisión de las cercarias se encuentra directamente relacionada con un gran número de rotíferos, como se aprecia en el grupo 3, quizás debido a que estos organismos se ubican en los tejidos del caracol, de manera que no solo compiten por los nutrientes en la pecera, además compiten por el espacio en el caracol. En relación a lo anterior, otro autor (14) refiere que los rotíferos son microorganismos que no afectan al ser humano y que son, en general, organismos inofensivos a excepción de algunas especies que representan una amenaza para otros animales acuáticos, lo que podría explicar su efecto sobre las cercarias de S. mansoni. Por otra lado, el empleo tanto de los rotíferos como los ciliados como competencia con S. mansoni constituirían un medio un tanto eficaz como mecanismo preventivo (en lugar de utilizar molusquicidas como medida para prevenir la transmisión de S. mansoni) que según los autores (4) son medios regulados por leyes estrictas en cuanto a su uso indiscriminado y su alto costo. Y el éxito del control biológico empleando moluscos u otros organismos que compitan con el hospedador intermediario depende de muchos factores que hacen que sean aplicados en el campo (15, 16).Algunos autores reseñan que los Paramecium son organismos quimiosensibles por lo que constituye un biosensor para ambientes contaminados con aceite, pesticidas y otros agentes, puesto que su aparato sensorial detecta gran variedad de sustancias químicas repelentes y quimioatractantes y repelentes (17). En relación a los rotíferos se demostró que la especie B. rotundiformis es un eslabón clave en la transferencia de energía a niveles tróficos tropicales superiores debido a la alta tasa de renovación de sus poblaciones y al impacto sobre el fitoplancton (18), lo que los hace ideal su uso en acuicultura de peces, como Tilapia larvae (19) y en los parámetros de producción del camarón blanco del pacífico, sin deteriorar la calidad del agua (20).
Todos los autores mencionados anteriormente parecen tener algo en común y es la demostración a través de sus estudios, de que tanto el molusco B. glabrata como los individuos de la especie de rotíferos y ciliados, no se ven afectados al entrar en contacto entre sí, lo que a la luz de los hallazgos encontrados en el presente trabajo indica la factibilidad de que al introducir copépodos o rotíferos en el medio acuático, se alteraría la infección por S. mansoni, sin alterar los organismos del ecosistema que rodean al caracol, incluso los peces. Esto abre la posibilidad en un ámbito más amplio, de reemplazar los molusquicidas por métodos menos tóxicos como mecanismo de control de la transmisión de S. mansoni al humano, en especial porque otros modelos de control biológico han fracasado.
En conclusión, el estudio de las características morfológicas y de locomoción de los organismos encontrados en las peceras empleadas para crías de B. glabrata en cautiverio en el Laboratorio, mostró que los organismos pertenecen a los Phyla Ciliophora y Rotifera. Se demostró un efecto de inhibición en la emisión de las cercarias de S. mansoni en presencia de rotíferos y Paramecium sp, dependiente de la cantidad de organismos presentes. Un porcentaje total de inhibición en la emisión de las cercarias de S. mansoni se relacionó con la presencia de un gran número de rotíferos.
Finalmente, el presente trabajo constituye el primer hallazgo que demuestra que organismos de los Phyla Ciliophora y Rotifera podrían ser empleados como control biológico de la infección por S. mansoni.
AGRADECIMIENTOS: Este trabajo se realizó con el financiamiento del Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad de Carabobo a través del Proyecto grupal CDCH-UC #422-10 y de Inversión Menor CDCH-UC #00220-08
REFERENCIAS
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