Carmen Durán1, María F. Quiroga2, Zoraida Díaz-Bello3, Sylvia Silva4, Antonio Roschman-González5, Miriam Strauss6 & Felix Tejero2*
1 Cátedra de Parasitología. Escuela de Medicina “Luis Razetti”, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
2 Laboratorio de Biología Funcional de los Kinetoplastida. Instituto de Zoología Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
3 Sección de Inmunología. Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
4 Sección de Inmunoparasitología. Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
5 Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Mitsuo Ogura”. Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
6 Sección de Biología Celular. Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
*Autor de correspondencia: felixtejero@gmail.com
El mecanismo adaptativo entre Leishmania y Trypanosoma ante la competencia por los recursos nutricionales en ambientes compartidos ha sido pobremente investigado. En particular, el estudio de la conducta trófica entre Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi podría contribuir al entendimiento de situaciones de gran relevancia médica en humanos, como son las infecciones mixtas por ambos tripanosomatídeos. En este trabajo se establecieron cultivos axénicos puros de Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi, así como cultivos axénicos mixtos (L. chagasi + T. cruzi) en médio BHI. Se registraron los cambios de dinámica poblacional (organismos por mililitro), la evolución de la estructura de las poblaciones, las variaciones de las concentraciones de colesterol, glucosa y proteínas totales, así como los cambios de pH en el medio de cultivo. El manejo cuantitativo de los conjuntos numéricos generados experimentalmente se abordó con técnicas univariadas (Análisis de la Varianza) y multivariadas (Análisis Discriminante Múltiple). Los resultados demuestran diferencias estadísticas significativas entre las medias de los parámetros considerados y prueban que el comportamiento “in vitro” investigado en el cultivo mixto L. chagasi – T. cruzi difiere taxativamente del estudiado en los cultivos puros de L. chagasi y T. cruzi.
]]> Palabras clave: Leishmania chagasi, Trypanosoma cruzi, cultivo “in vitro”.Leishmania chagasi and Trypanosoma cruzi: Trophic behavior in pure and mixed axenic cultures
SUMMARY
The adaptive mechanisms between Leishmania and Trypanosoma facing the competence for the nutritional resources in shared environments have been poorly investigated. Particularly, the study of the trophic behavior between Leishmania chagasi and Trypanosoma cruzi could contribute to the understanding of relevant medical situations, as mixed human infections. In this work pure axenic cultures of Leishmania chagasi and Trypanosoma cruzi, as well as mixed cultures (L. chagasi + T. cruzi) were established in BHI medium. Changes of population dynamics (organisms/mL), the evolution of the population’s structure, the variations of the concentration of cholesterol, glucose and total proteins, as well as the changes of the medium’s pH were registered. The generated numerical sets were tackled with univariate (Analysis of Variance) and multivariate (Multiple Discriminant Analysis) techniques. The results demonstrate significant statistical differences between the media of the considered parameters and prove that the “in vitro” behavior investigated in the L. chagasi – T. cruzi mixed culture precisely differs from the L. chagasi and T. cruzi pure cultures.
Key words: Leishmania chagasi, Trypanosoma cruzi, in vitro culture.
Recibido el 03/02/2009 Aceptado el 28/04/2009
INTRODUCCIÓN
La actividad trófica es fundamental en los procesos de transmisión del agente patógeno y del desarrollo del parásito. Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi además de ser los agentes etiológicos de patologías humanas importantes en el Neotropico (WHO, 1990; Morel, 1999) son capaces de establecer infecciones mixtas en humanos y animales (Travi et al., 1994; Corredor-Arjona et al., 1999; Bastrenta et al., 2003). El éxito de tales infecciones mixtas esta vinculado, en parte, a la conducta trófica de los agentes patógenos y a su sobrevivencia en el medio ambiente compartido.
Ambos tripanosomatídeostienen ciclosde vida complicados caracterizados por ajustes metabólicos radicales. Tanto los amastigotes de L. chagasi como los tripomastigotes de T. cruzi, en cuestión de segundos, pasan del ambiente homeotermo del hospedador mamífero al medio poiquilotermo del insecto vector. Invadir, colonizar y establecerse en el vector o en el mamífero implica desempeñar roles peculiares (incluyendo metabolismo y comportamiento) y ocupar espacios específicos en el nuevo hábitat. Así, el éxito adaptativo del parásito, depende en gran medida, de su habilidad en el uso de los substratos tróficos disponibles.
Comprender los mecanismos de utilización de los sustratos nutricionales requiere conocer el metabolismo básico de los organismos. Si bien el metabolismo de los tripanosomatídeos es un tópico bien documentado (McConville et al., 2002; Roberts et al., 2003; Bringaud et al., 2006; Urbina, 2006; Opperdoes & Coombs, 2007), el manejo de sustratos tróficos potenciales o explícitos, es un tema no referido en la literatura.
]]> En este trabajo se presenta por primera vez una evaluación cuantitativa del comportamiento trófico de L. chagasi y T. cruzi mantenidos en cultivos axénicos puros y mixtos (L. chagasi + T. cruzi).MATERIALES Y MÉTODOS
Cultivos axénicos puros de L. chagasi (cepa MHOM/BR/74/PP75) y T. cruzi (cepa Y), así como cultivos axénicos mixtos (L. chagasi + T. cruzi) se establecieron en matraces Erlenmeyer de 500 mL con tapa de rosca no apretadas provistos de medio bifásico BHI (Brain Heart Infusion). El sistema de cultivo consta de fase sólida (2 gr de BHI + 1,5 gr de agar + 0,1 mg/mL de gentamicina + 50 mL de agua bidestilada + 10% de sangre de conejo desfibrinada) y de fase líquida (50 mL de solución salina isotónica en agua bidestilada: 0,85% de NaCl + 1% de glucosa + 0,1 mg/mL de gentamicina). En la fase líquida se sembraron 0,2×106 flagelados/mL. Un día después, e interdiariamente durante 35 días, se extrajeron 0,1 mL de la fase líquida; previo a la extracción los matraces de cultivo se agitaron con movimientos circulares suaves. De éste volumen (0,1 mL), 5mL se emplearon en el cálculo del número de flagelados/ml mediante cámara de Neubauer, 5mL adicionales se utilizaron para hacer frotis que, una vez teñidos con colorante Giemsa (10% en agua corriente), se utilizaron en el estudio de la dinámica morfotípica, otros 5mLse usaron en la determinación del pH y 85 mL se centrifugaron (350mg/25 min, 4°C). El sobrenadante se fraccionó en alícuotas de 3mLy 2 de 5mL cada una con las que se determinaron las concentraciones de colesterol, glucosa y proteínas totales, respectivamente. Las muestras de colesterol, glucosa y proteínas totales se procesaron (Reinhold, 1953; Trinder, 1979; Allain et al., 1974) y analizaron en un lector de microplacas a 520 nm, 505 nm y 540 nm, respectivamente. Matraces Erlenmeyer idénticos libres de parásitos se utilizaron como control. Los cultivos se mantuvieron a 26ºC sin agitación y sin mezclas particulares de gases. Los experimentos se hicieron por triplicado y se repitieron 3 veces.
Las magnitudes numéricas generadas se evaluaron cuantitativamente con análisis de la varianza de 2-vías (ANOVA) (Sokal & Rohlf, 1995) y análisis discriminante múltiple (ADM) (Pielou, 1977; Pielou, 1984).
El ANOVA de 2-vías es una prueba de comparación de medias que contrasta las fuentes de variación y el ADM es una técnica reduccional multivariada que permite determinar discriminación entre grupos naturales. En este caso el ADM reduce el espacio 8-dimensional original (variables registradas: organismos/mL, amastigotes/mL, promastigotes/mL, epimastigotes/mL, [glucosa], [colesterol], [proteínas totales] y pH) a un espacio 2-dimensional proyectado en un plano cartesiano cuyos ejes de abscisas y ordenadas son las funciones discriminantes (Función Discriminante 1 y Función Discriminante 2).
RESULTADOS
La representación gráfica de los cambios del número de organismos/mL en el cultivo puro de L. chagasi y T. cruzi, así como en el cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi) muestra curvas con picos máximos y mínimos de organismos/mL distintos que, adicionalmente, se alcanzan en tiempos desiguales con cinéticas de cambio diferentes en cada proceso (cultivo puro de L. chagasi, cultivo puro de T. cruzi y cultivo mixto de L. chagasi + T. cruzi) (Fig. 1).
En todos los casos se calculó el error estándar por cuanto se analizaron los resultados obtenidos de la distribución muestral.
Los frotis coloreados a partir de la fase líquida de los grupos experimentales permitieron establecer las características morfotípicas (estadios) particulares de las poblaciones en cada uno de ellos: cultivo puro de L. chagasi, cultivo puro de T. cruzi y cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi) (Fig. 2).
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En el cultivo purode L. chagasi se identificaron los estadios de promastigote, esferomastigote y amastigote (las formas aberrantes no fueron consideradas). El promastigote resultó la forma predominante (Fig. 2A), presentando pico de crecimiento máximo en las fases finales del cultivo. Los esferomastigotes y los amastigotes también expresaron picos poblacionales máximos en las postrimerías del cultivo. En todos los casos el número de esferomastigotes predominó sobre el de amastigotes.
El cultivo puro de T. cruzi permitió establecer la presencia de epimastigotes, esferomastigotes y amastigotes (las formas aberrantes no fueron consideradas). La Fig. 2B muestra que el estadio más abundante fue el epimastigote con pico de crecimiento máximo en las fases intermedias del cultivo, seguido por esferomastigotes y amastigotes. Es notorio el paralelismo entre las cinéticas y las concentraciones máximas de epimastigotes y esferomastigotes durante los primeros 17 días de cultivo (Fig. 2B).
Los únicos estadios rastreados en el cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi) fueron epimastigotes y promastigotes, ya que la metodología empleada en este trabajo no permite diferenciar amastigotes ni esferomastigotes de L. chagasi y T. cruzi (las formas aberrantes tampoco fueron consideradas). La Fig. 2C evidencia la preponderancia numérica de los epimastigotes sobre los promastigotes en el cultivo mixto, poniendo de manifiesto además, cinéticas de crecimiento y extinción que si bien son similares, resultan diferentes a sus correspondientes en los cultivos puros.
Los valores de pH registrados durante el tiempo de experimentación fueron diferentes, observándose su descenso sostenido. Por su parte, el pH del control fluctúa alrededor de 7,2. Los cambios entre el control (BHI sin parásitos), el cultivo puro de L. chagasi, el cultivo puro de T. cruzi y el cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi), parecieran diferir claramente (Fig. 3).
La dinámica de cambio en las concentraciones de colesterol, glucosa y proteínas totales en la fase líquida del cultivo puro de L. chagasi y T. cruzi, así como del cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi) en medio BHI se caracteriza por tendencias de comportamiento disímiles: las concentraciones de colesterol y glucosa disminuyen mientras que la de proteínas totales aumenta. Más aun, las particularidades de cambio en las concentraciones de colesterol, glucosa y proteínas totales, parecieran diferir entre los grupos experimentales (cultivo puro de L. chagasi, cultivo puro de T. cruzi y cultivo mixtos de L. chagasi + T. cruzi) y los controles respectivos (Fig. 3).
En efecto, los registros de concentración de glucosa (Fig. 4A) y colesterol (Fig. 4B) muestran disminución continua en el tiempo; en contraste con los controles. Por el contrario, los valores obtenidos al determinar la concentración de proteínas totales revelan conductas de incremento sostenido a lo largo del cultivo, comportamiento disímil al observado en el control (Fig. 4C). Según los intervalos de error estándar los cambios en la concentración de glucosa (Fig. 4A) y proteínas totales (Fig. 4C) observados en el cultivo mixto, sugieren diferencias con los registrados en el cultivo puro correspondiente.
Ciertamente que el estudio gráfico sugiere diferencias por cuanto la representación esquemática de los errores estándar en determinados casos y/o condiciones no se sobreponen (Fig. 1, 2, 3 y 4). Corroborar cuantitativamente la significancia de tales disimilitudes requiere que las magnitudes numéricas obtenidas a lo largo de los experimentos se investiguen con pruebas más objetivas; el ANOVA de 2-vías cumple con tales expectativas (Tabla I). El análisis se abordó ensamblando dos conjuntos de datos. El primero asociado a la dinámica de las poblaciones, como son la densidad de la población (fuente de variación: individuos, tiempo e interacción individuostiempo) (Fig.1) y los cambios observados en el número de los estadios presentes en el cultivo puro de L. chagasi (fuente de variación: estadios, tiempo e interacción estadios-tiempo) de T. cruzi (fuente de variación: estadios, tiempo e interacción estadiostiempo) y el cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi)(fuente de variación: estadios, tiempo e interacción estadiostiempo) (Fig. 2). El segundo set relacionado con los cambios de pH (fuente de variación: diferencias interespecíficas, tiempo e interacción diferencias interespecíficas-tiempo) (Fig. 3) y el manejo en las concentraciones de colesterol (fuente de variación: diferencias interespecíficas, tiempo e interacción diferencias interespecíficas-tiempo), de glucosa (fuente de variación: diferencias interespecíficas, tiempo e interacción diferencias interespecíficas-tiempo), y de proteínas totales (fuente de variación: diferencias interespecíficas, tiempo e interacción diferencias interespecíficas-tiempo) (Fig. 4).
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El ANOVA comprueba (a≤0,05) la significancia de todas las diferencias representadas gráficamente. Es más, el ANOVA demuestra además que el único caso en el que se observa similitud es la interacción diferencia interespecífica-tiempo en lo referente al consumo de glucosa. En otras palabras, al menos uno de los puntos de las curvas de extinción de glucosa es igual entre el cultivo puro de L. chagasi, el cultivo puro de T. cruzi y/o el cultivo mixto L. chagasi + T. cruzi (Tabla I).
El ANOVA resumido en la Tabla I demuestra la existencia de diferencias significativas entre las variables analizadas (densidad poblacional, estadios presentes, pH y [colesterol], [glucosa], [proteínas totales]) en los cultivos puros de L. chagasi y T. cruzi, así como en el cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi) con una probabilidad asociada menor o igual a 0,05. Las diferencias indican que las medias de crecimiento, estructura de las poblaciones (número y tipo de estadio), cambios en la concentración de colesterol, glucosa y proteínas totales, así como los valores de pH en la fase líquida del medio BHI, son diferentes. No obstante, no aporta información relevante al respecto de la acción simultánea de todas las variables en los grupos experimentales (cultivo puro de L. chagasi, cultivo puro de T. cruzi y cultivo mixto). Más aun, la información suministrada por el ANOVA es nsuficiente, ya que no permite inferir con certidumbre significativa si los comportamientos (entendidos como integración de funciones) de L. chagasi y T. cruzi en la fase líquida del medio BHI de cultivos puros son iguales o diferentes y, aun menos, si difieren o no del cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi).
Por ello, se emplea una potente prueba multivariada que responde estas interrogantes: el ADM. Se trata de un test que genera un modelo matemático que reduce el hiperespacio original de ocho dimensiones (variables registradas) a un espacio de dos dimensiones plasmable en un plano de ejes cartesianos.
Los valores de Lambda de Wilks (lw) denotan la significancia estadística del poder discriminante del modelo; 0,00 conlleva poder discriminatorio y 1,00 ningún poder discriminante. La magnitud numérica de lw en la Función 0 (lw = 0,09) implica gran capacidad discriminante de esa función. Por el contrario, la Función 1 tiene muy poco poder discriminante, características revalidadas por la bajísima significancia (0,00 < 0,05) de la Función 0 y la muy elevada significancia de la Función 1 (0,91 > 0,05). Las características generales del ADM (auto valores, correlación canónica y chi-cuadrado) permiten aseverar que el modelo generado por el ADM es consistente y, en consecuencia, la inferencia derivada es significativa con probabilidad asociada menor o igual a 0,05.
La representación gráfica del modelo produce tres nubes de puntos que corresponden al cultivo puro de L. chagasi, al cultivo puro de T. cruzi y al cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi). Las nubes de L. chagasi y T. cruzi están parcialmente superpuestas, mientras que la del cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi) se muestra sin conexión alguna con las otras dos (Fig. 5).
Si bien los resultados gráficos del ADM (Fig. 5) muestran discriminación parcial entre el cultivo puro de L. chagasi (A) y el cultivo puro de T. cruzi (B) (nótese la zona de superposición), evidencian taxativamente segregación del cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi)(C).
DISCUSIÓN
]]> El significado del cambio en la dinámica (crecimiento-decrecimiento) de las poblaciones y las variaciones morfológicas de los tripanosomatídeos heteroxenos está vinculado, al menos, a las variaciones del medio ambiente (Vickerman, 1976; 1985; 1988; 1994; Kollien & Schaub, 2000; Navarro et al., 2003; Gu et al., 2007). Los resultados presentados en este trabajo apoyan este enunciado, ya que los procesos observados en las curvas incremento-declinación de las densidades de las poblaciones, de la transformación morfológica y de las modificaciones en los valores del pH se corresponden con el cambio de concentración de proteínas totales en los tres cultivos (L. chagasi puro, T. cruzi puro y mixto: L. chagasi + T. cruzi). En este sentido, las fluctuaciones registradas en el número de organismos de una población serían función de la disponibilidad y manejo apropiado de los recursos del ambiente. Los resultados también sugieren relación entre el incremento del número de amastigotes y el descenso del pH. La acidificación de los cultivos podría constituir un aspecto inductor de la transmutación morfológica, por cuanto el pH extracelular es un factor promotor del cambio a formas infectivas que impulsa la metaciclogénesis in vitro de L. mexicana (Bates & Tetley, 1993).En términos generales pareciera que durante la fase de crecimiento los parásitos incorporan colesterol del medio, lo cual se corresponde con la reducción de su concentración. En este punto del cultivo los organismos serían generalistas, por ello, la conducta trófica sería facultativa: el colesterol se incorporaría siempre y cuando estuviera presente en concentraciones adecuadas; por el contrario, si su concentración es baja, su uso sería sustituido por glucosa, o cualquier otro sustrato. La extinción de glucosa en el medio BHI va paralela a los incrementos de la densidad poblacional y, subsecuentemente, a la incorporación de colesterol. Si bien, investigaciones previas han establecido que el colesterol no constituye fuente energética importante, se ha propuesto que la biosíntesis de triglicéridos endógenos está asociada a las reservas energéticas intraglicosomales (Hart & Coombs, 1982; Levick et al., 1998). Dichos acopios serían utilizables en las postrimerías del cultivo, evento acorde con el déficit de glucosa propio de esas fases del cultivo.
Se ha demostrado que la utilización de glucosa está restringida a medios con bajas presiones parciales de oxígeno (Furuya et al., 2002). La parte del ciclo de vida de L. chagasi que transcurre en el intestino del invertebrado es anóxica y, adicionalmente, sostiene la multiplicación de los promastigotes (Attias, 1991; Marquardt et al., 2000).
Por su parte, ni la incorporación ni la desincorporación de los compuestos investigados en los cultivos de T. cruzi evidenciaron relación intrínseca con los eventos de cambio morfológico. No obstante, la caída de los valores de pH del medio se correlaciona con el pico poblacional de epimastigotes, la disminución del número de esferomastigotes/mL y la presencia de amastigotes en los cultivos. Otros investigadores han relacionado el descenso de pH y la morfología de T. brucei, proponiendo que los cambios de pH promueven la transformación pleomórfica de este parásito (Rolin et al., 1998).
Por otra parte, los ácidos grasos no constituyen fuentes exógenas esenciales para T. cruzi, ya que mantienen altos niveles de reservas endógenas a lo largo del tiempo (Rogerson & Gutteridge, 1980). Los resultados de este trabajo en los cultivos puros de L. chagasi son similares, hecho que reafirmaría la condición facultativa.
El modelo deADM permite inferir escenarios ecológicos respecto a la superposición de nichos por cuanto L. chagasi y T. cruzi comparten espacios dimensionales en cultivos puros. Lo anterior se sustenta en la simpatría interespecífica en condiciones naturales (Bastrenta et al., 2003). La superposición de nichos acontece cuando dos unidades organísmicas explotan los mismos recursos u otras variables ambientales, superponiéndose completamente cuando ambas entidades utilizan nichos idénticos: si los nichos divergen no hay superposición (Pianka, 2000).
En el caso de recursos ilimitados en sistemas vivos y ambiente saturado, se han demostrado alteraciones interespecíficas en cultivos mixtos de L. chagasi y T. brucei (Ter-Kuile & Opperdoes, 1992). Si bien ambos parásitos emplean glucosa como sustrato trófico, la superposición in vitro no conduce a la exclusión, aun sabiendo; en el caso de T. brucei, que los desechos tóxicos actúan negativamente sobre L. chagasi (Coppens et al., 1992).
No obstante, en esta investigación no se observó uso diferencial de recursos tróficos en los cultivos puros, hecho que no sería un obstáculo para la coexistencia en cultivos mixtos (L. chagasi + T. cruzi). Por su parte, el comportamiento en los co-cultivos presenta características distintivas y particulares que permitirían definir la coexistencia in vitro de ambos organismos como una entidad morfo-funcional diferenciable de sus contrapartes puras (cultivo puro de L. chagasi y cultivo puro de T. cruzi) en términos matemáticos.
Nuestros resultados de conducta trófica en ambientes compartidos versus individuales, se correspondieron con la acumulación y expresión diferencial de la proteína de choque térmico Hsp70 (resultados no publicados) entre L. chagasi y T. cruzi. Se sugiere que los recursos nutricionales y la competencia por éstos, podría modular la respuesta adaptativa de los tripanosamatideos.
Finalmente, el comportamiento in vitro investigado en el cultivo mixto (L. chagasi + T. cruzi) difiere del estudiado en los cultivos puros de L. chagasi y T. cruzi, evidenciándose interacciones intra (estadios de desarrollo) e interespecíficas (L. chagasi -T. cruzi) en términos tróficos.
]]> AGRADECIMIENTOSLos autores expresan su agradecimiento al Proyecto LOCTI-UCV 2007 Nº P0934020 (Laboratorios ELMOR, S.A.) por el apoyo económico recibido.
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