Palabras clave: Paragonimus sp., enzimas, trematodos, Venezuela.

Recibido el 23/11/2009 Aceptado el 10/04/2010

INTRODUCCIÓN

La paragonimiasis es un problema de salud pública en países asiáticos y en algunos países de Latinoamérica (Yokogawa, 1965; Alarcón de Noya et al., 1985). Los parásitos migran a través de varios tejidos hospederos hasta alcanzar los pulmones, por lo que igual que la mayoría de los trematodos, Paragonimus debe poseer una serie de enzimas necesarias para la invasión, migración y nutrición que lo ayudan a adaptarse y sobrevivir en los diferentes hábitat hospederos, para cumplir su ciclo y garantizar su persistencia en el tiempo.

Recientes evidencias bioquímicas y proteómicas demuestran que los vermes adultos de Paragonimus westermani excretan/secretan proteasas que juegan un papel importante en la nutrición (hemoglobinasa), en la patogénesis de la paragonimiasis y en inmunomodulación de la respuesta del hospedero (Choi et al., 2006; Song & Kim, 1994; Lee et al., 2006); en particular, se describen varias cisteín-proteasas en adultos y distintos estadios de P. westermani capaces de hidrolizar sustratos sintéticos tales como CBZ-Phe-Arg-AFC(carboxybenzyl-phenylalanyl-arginyl-7-amino-4-trifluoromethylcoumarin) a sus respectivos óptimos de pH (Song & Kim, 1994; Na et al., 2006; Lee et al., 2006). Muchas enzimas de trematodos son antigénicas y han resultado de gran valor diagnóstico (Ikeda et al., 1996. Alarcón de Noya et al., 1997; Cesari et al., 1992; Pujol et al., 1989).

Las cisteín proteasas de P. westermani son antígenos inmunodominantes (Lee et al., 2006).

Con el objetivo de evaluar la diversidad enzimática de la fracción soluble (FSPA) de un aislado venezolano de adultos de Paragonimus sp. se realizaron determinaciones según Dresden & Asch (1972) y Cesari et al. (1998, 2000) a diferentes pH, usando curvas de calibración (A 405 nm vs. nmol) para interpolar la absorbancia de los grupos p-nitrofenol o p-nitroanilina liberados por la hidrólisis de sustratos sintéticos (Cesari, 1974; Cesari et al., 1998; Dresden & Asch, 1972); también se utilizaron sustratos 2-naftilamídicos y 2-naftólicos para determinar esterasas, peptidasas, fosfomonoesterasas y glicosidasas (API ZYM II, API ZYM 2520, BioMerieux, Marcy LEtoile, Francia) (Cesari et al., 2000).

Para obtener el perfil enzimático de la FSPA de Paragonimus sp. se siguió la metodología desarrollada por Dresden & Asch (1972) y Cesari et al. (2000). Se realizaron determinaciones enzimáticas a pH ácido y alcalino mediante microensayos en placas MAXISORP (NUNC) fondo plano y un lector de placas SpectraMAX 250 (Molecular Devices). Las actividades enzimáticas detectadas correspondieron a: las fosfomonoesterasas Fosfatasa Acida (FAc, pH = 5,0) y Fosfatasa Alcalina (FAL, pH = 9,6) utilizando como sustrato p-nitrofenil fosfato; las aminopeptidasas Leucín Aminopeptidasa (LAP, pH = 8,0) y L-α-Alanin

Aminopeptidasa (α-AAP, pH = 8,0) utilizando como sustrato L-α-Alanina p-nitroanilida; las glicosidasas N-Acetil-β-D-Glucosaminidasa (β-NAG, pH = 5,5) utilizando como sustrato p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glucosaminida, α-manosidasa (α-MAN, pH = 5,5) utilizando como sustrato p-nitrofenil-α-D-manósido y N-Acetil-α-D Glucosaminidasa (α-NAG, pH = 5,5) utilizando como sustrato p-nitrofenil-α-D-glucósido; y Cisteín-Proteasa (CP, pH = 5,5) utilizando el sustrato sintético CBZ.Phe-Arg-p-nitroanilida en presencia de L-cisteína. Los ensayos se leyeron a 405 nm. Se usaron curvas de calibración para interpolar los valores de absorción de la muestra (A vs. nmol) y calcular las distintas actividades. Se utilizó 1 N NaOH para detener la mayoría de las reacciones realizadas a pH ácido con excepción del ensayo de cisteín-proteasa donde se utilizó ácido acético al 20%. Por el contrario, para todas las reacciones realizadas a pH alcalino se utilizó ácido acético al 20%, con excepción del ensayo de Fosfatasa Alcalina donde la reacción se terminó añadiendo 1 N NaOH. La actividad enzimática fue expresada en términos de μmoles o nmoles de sustrato hidrolizado por 1 hora, definiéndose a la actividad específica como la actividad referida a la concentración de proteínas en la muestra (μmol/h/mg) (Cesari et al., 1983; 1992; 2000).

Se utilizó una serie de sustratos sintéticos adsorbidos sobre un soporte sólido en el fondo de pocillos dispuestos sobre tiras de plástico (series API ZYM II y API ZYM 2520, BioMerieux, Marcy L’Étoile, France). La serie API ZYM 2520 contenía un conjunto de sustratos 2-naftólicos (2N) y 2-naftilamídicos (2-NA) para la determinación de esterasas (2N-butirato, 2N-fosfato, 2N-caprilato, 2N-miristato), peptidasas (L-Leucil-2NA, L-Valil-2NA, L-Cistil-2NA, N-Benzoil-DL-Arginine-2NA, N-Glutaril-Fenilalanina-2NA), fosfohidrolasas (2N-fosfato, Naftol-AS-BI-fosfato), glicosidasas (6-Br-2N-α-D-galactopiranósido, 2N-β-D-galactopiranósido, Naftol-AS-BI-β-D-glucurónido, 2N-α-D-glucopiranósido, 6-Br-2N-β-D-glucopiranósido, 1N-acetil-α-D-glucosaminida, 6-Br-2N-α-D-manopiranósido, 2N-α-L-fucopiranósido). La serie API ZYM II contiene un conjunto de sustratos específicos para la determinación de peptidasas (α-L-Glu-2NA, N-Benzil-L-Leu-2NA, S-Benzil-L-Cys-2NA, D-L-Met-2NA, Gly-Gly-HBr-2NA, Gly-L-Phe-2NA, Gly-L-Pro-2NA, L-Leu-Gly-2NA y L-Ser-L-Tyr-2NA). En cada pocillo se colocó 65 μl de FSPA y las tiras de sustrato se incubaron por 2 horas a 37º en cáara húeda. Transcurrido el tiempo se añdieron 35 μl de reactivo A (2,5 g de Trizma-Base; HCl 37%; 1 g de SDS y 10 ml de agua destilada) y 35 μl de reactivo B (35 mg de Fast-Blue; 10 ml de 2-metoxietanol). Despué de 10 minutos, el sobrenadante de cada pocillo fue transferido a un pocillo correspondiente en una placa de ELISA y se leyóa diferentes longitudes de ondas entre 450 nm y 620 nm segú el producto cromogéico liberado (naftilamina o naftol) acomplejados con Fast Blue. Se estableciócomo unidad de actividad enzimáica la cantidad de enzima que produjo, por la hidróisis del sustrato, una absorció de 0,1 unidades de densidad ótica (DO) a la longitud de onda (nm) utilizada en una hora (U), definiédose a la actividad especíica como la actividad referida a la concentració de proteías en la muestra (Cesari et al., 2000).

La utilización de esta serie permitió corroborar algunos de los resultados obtenidos en los ensayos realizados con los sustratos sintéticos p-nitrofenilados o p-nitroanilidas (Fig. 1, 2, 4). Las actividades hidrolíticas más elevadas a pH ácido fueron: N-Acetil-β-D-Glucosaminidasa (1625 U/mg), Fosfatasa Ácida (980 U/mg) y Naftol-AS-BI-Fosfohidrolasa (885 U/mg); luego, la Leucín Arilamidasa (355 U/mg) y la β-Galactosidasa (215 U/mg) (Fig. 1). Otras actividades detectadas en esta galería fueron: C8-Lipasa (170 U/mg) y Fosfatasa Alcalina (125 U/mg), seguidas por Cistina-Arilamidasa (115 U/mg) y α-Manosidasa (105 U/mg). No se detectó actividad α-Galactosidasa, β-Glucosidasa, Valina-Arilamidasa y α-Fucosidasa (Fig. 4).

La importancia de las enzimas en el metabolismo de adaptación de los helmintos está bien establecida (Dresden & Deelder, 1979; Chapman & Mitchell, 1982; Hotez et al., 1985). Las actividades proteolíticas han sido estudiadas en extractos crudos o en productos de excreción/secreción liberados in vitro de estadios larvales y parásitos adultos de trematodos utilizando sustratos no específicos de proteasas como Azocoll, y sustratos específicos como elastina, fibrina y péptidos sintéticos derivatizados con aminometilcoumarina (Barret, 1980). Cornejo et al., (1994) reportaron la presencia de enzimas proteolíticas liberadas por adultos de Paragonimus mexicanus. En Venezuela, ningún estudio se ha realizado sobre las enzimas de especies similares; por ende se decidió evaluar la diversidad enzimática general en la fracción soluble (FSPA) de Paragonimus sp., en la cual se hallaron varias glicosidasas, fosfatasas y peptidasas.

y probablemente degrada la mucina presente en este fluido biológico. Otros sustratos para glicosidasas no fueron hidrolizados (no hubo detección significativa de α- o β-Glucosidasa, β-Glucuronidasa, α-Fucosidasa) (Fig. 1, 4), sugiriendo baja actividad de las enzimas correspondientes o que sencillamente no se expresan en los vermes adultos. Fujino et al., 1983 asociaron a las β-Glucuronidasas sólo con vermes juveniles mientras que las β-Galactosidasas se localizaron tanto en vermes jóvenes como en adultos.

En el ámbito de las proteasas, se observó una fuerte actividad Cisteín Proteasa (CP) (Fig. 1). En Paragonimus sp. se han descrito varias cisteín proteasas en metacercarias, vermes adultos y huevos. En metacercarias de P. westermani, se han descrito tiol proteasas que juegan un papel crucial en el desenquistamiento de las larvas, en la penetración de los tejidos, en la evasión de la helmintoxicidad por eosinofilos y en la inflamación (Yamakami et al., 1995; Chung et al., 1997; Shin et al., 2001; Sajid & McKerrow, 2002). En los productos de excreción/secreción (ES) de estas formas parasitarias, originados en la vejiga secretoria, se han caracterizado una CP de 27-kDa y otra de 28-kDa; la de 27-kDa induce la desgranulación de eosinófilos humanos con secreción de una neurotoxina (EDN) y el anión superóxido, mientras que la de 28-kDa facilita la migración de las metacercarias en los tejidos; la desgranulación de los eosinófilos es un evento clave para la eliminación de los helmintos y la inducción de inflamación en el sitio de infección (Chung et al., 1997; Yang et al., 2002; Shin et al., 2005; Na et al., 2006; Chung et al., 2008). Estas CP disminuyen dramáticamente durante la maduración en el hospedador definitivo, fenómeno este quizás relacionado con la disminución de la actividad de penetración y migración de la metacercaria dentro del hospedador definitivo (Chung et al., 1997). Park et al. (2001) caracterizaron en P. westermani una CP similar a la catepsina F de S. mansoni localizada principalmente en las glándulas vitelogénicas de los vermes adultos, sugiriendo un posible rol en la producción de huevos de este parásito. Choi et al. (2006) caracterizaron una CP con alta homología a la hemoglobinasa de F. hepatica y de S. mansoni que se expresa en el epitelio intestinal de los vermes adultos de P. westermani, sugiriendo una función digestiva sobre la hemoglobina hospedera. En los productos de excreción/secreción (ES) de vermes adultos de P. mexicanus se describieron varias bandas en geles de SDS-PAGE con actividad proteolítica tiol-dependiente

activas a pH 4,5 (Cornejo et al. 1994). Una CP de 24-kDa presente en adultos de P. westermani (PwCP2) fue clonada y sobreexpresada en E. coli para ser utilizada en ensayos de diagnóstico; antisueros contra esta CP reconocieron esta proteasa tanto en ES como en extractos solubles de adultos de P. westermani (Yang et al., 2004), lo cual sería concordante con la alta actividad CP detectada en nuestros extractos solubles de vermes adultos ya que una parte de los productos de ES del parásito son igualmente integrantes de la FSPA (Yang et al., 2004). El análisis proteómico de productos ES en adultos de P. westermani han informado sobre la existencia de 16 CP en estos productos (Lee et al., 2006). En extractos crudos de huevos inmaduros de P. westermani se observó alta actividad CP asociada con una banda de 35-kDa que no está presente en metarcercarias ni adultos y cuya función no se conoce aún (Kang et al., 1995). Se necesitan estudios ulteriores para conocer la diversidad (isoformas) y las funciones de la actividad CP detectada en el presente estudio.

Una enzima que pertenece al grupo de seril endopeptidasas y que juega un papel importante en ciertas relaciones hospedero-parásito es la elastasa. Esta actividad fue medida usando el sustrato N-succinil-Ala-Ala-Phe-Leu-p-nitroanilida; se detactaron valores muy bajos de actividad (Fig. 2), concordando este resultado con análisis previos los cuales sugieren que la expresión de las elastasas es estadío-específico; por ejemplo, en S. mansoni está presente solo en el estadio larval y está relacionada con la degradación de macromoléculas presentes en la piel tales como queratina, laminina, colágeno tipo IV, fibronectina y elastina, y seguramente le sirve al parásito durante la penetración por la piel del hospedero (Pierrot et al., 1996). La elastasa de S. mansoni, al ser excretada, estimula el sistema inmunológico del hospedero, encontrándose en el suero de pacientes infectados con esquistosomiasis anticuerpos anti-elatasa (Pierrot et al., 1996), un claro ejemplo de la importancia que tienen los antígenos enzimáticos y su posible aplicación al inmunodiagnóstico (Pujol et al., 1989, Pierrot et al., 1996, Alarcón de Noya et al., 1997, Cesari et al., 1998). No se detectó actividad endopeptidasa sobre sustratos generalmente hidrolizados por serín proteasas (tripsina, quimiotripsina) (Fig. 2, 4).

hidrolizados fueron: Gly-Pro-2-NA > Ser-Tyr-2-NA > Leu-Gly-2-NA (Fig. 3). Las N-aminopeptidasas podrían jugar un papel tanto en la fase final de la degradación de di- u oligopéptidos derivados de la digestión de proteínas, como en otros aspectos de la interacción hospedero-parásito. Los sustratos para aminopeptidasas mayormente hidrolizados fueron: p-nitrofenil-α-L-alanina > p-nitrofenil-α-L-leucina (pH 8,0). La α-AAP está generalmente asociada con la absorción de aminoácidos; libera preferencialmente alanina y aminoácidos secuencialmente de la porción N-terminal de péptidos (Lehninger & Cox, 1995). La leucín arilamidasa (detectada también con el sustrato L-leucil-2-naftilamida a pH 7,0) presentó valores medianos de actividad enzimática en la FSPA (Fig. 2, 4). En diferentes especies del género Schistosoma la LAP ha sido relacionada con la absorción de nutrientes por la superficie de su tegumento (Cesari et al., 1983). Song et al., (2008) sugieren que en P. westermani, la Leucin Aminopeptidasa está presente tanto en el parásito adulto como en la metacercaria y cumple funciones intracelulares relacionadas con el catabolismo final de la hemoglobina, difundiendo pequeños péptidos desde el epitelio intestinal del parásito e hidrolizándolos en aminoácidos libres, igualmente sugieren que esta enzima pudiera tener roles adicionales en la biología de Paragonimus.

En cuanto a la actividad fosfohidrolasa, la fosfatasa alcalina dio valores bajos (Fig. 2, 4). Fujino et al. (1989) describieron actividad FAL en vermes adultos de Paragonimus colectados tanto de perros como de ratas; mientras que la actividad FAc se observó en vermes extraídos de perros pero no de ratas, excepto en gránulos lisosomales del tegumento. La actividad FAc fue más importante que la alcalina y dio resultados positivos tanto con el sustrato p-nitrofenill fosfato como con 2-naftol fosfato en la serie API ZYM. La FAc cataliza la misma reacción que la FAL pero en el intervalo de pH 4,3-6,0 y está ampliamente distribuida en diferentes organismos; es considerada como un marcador lisosomal (Lehninger et al., 1995). La hidrólisis del sustrato naftol-AS-BI-fosfato fue llevada a cabo probablemente por una isoforma de la fosfatasa ácida. La presencia de fosfatasas en vermes adultos de Paragonimus sp. reportada en este trabajo (Fig. 2) concuerda con lo descrito en vermes adultos de P. westermani cuando se encuentran en un hospedero definitivo como el perro (Fujino et al., 1989). En S. mansoni, la FAc se observa en los espacios extracelulares de las invaginaciones del tegumento

de los vermes adultos (Cesari et al., 1981). Entre las diversas funciones del tegumento en los trematodos está absorber y transportar moléculas de origen hospedero; las fosfatasas participan en estos procesos de absorción de nutrientes y están generalmente presente en sitios de intercambio con el ambiente, relacionadas con la introducción y el transporte de carbohidratos al ambiente interno del parásito (Cesari, 1974).

Los resultados obtenidos con los derivados p-nitrofenilados y p-nitronilida de diferentes sustratos enzimáticos en los diferentes ensayos in vitro utilizados para cada enzima fueron en general corroborados en las series enzimáticas de tipo API ZYM. Los resultados descritos en el presente trabajo representan los primeros estudios enzimáticos que se registran en adultos de Paragonimus sp. obtenidos en Venezuela de un reservorio silvestre como Didelphis. Futuros estudios permitirán profundizar los presentes hallazgos, así como también realizar comparaciones de dichas determinaciones tanto en diferentes preparaciones del parásito como en extractos de excreción-secreción y preparados de huevos, además de la purificación de cada una de ellas, su definición antigénica y su posible aplicación en técnicas de inmunodiagnóstico.

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