Maira Cabrera González1*, Guillermo Terán-Ángel1, Orquídea Rodríguez2, Franca Puccio3, Olga Zerpa4 & Jacinto Convit4,5
1 Laboratorio de Inmunoparasitología,
2 Biología Celular,
3 Inmunopatología y
4 Sección de Leishmaniasis,
5 Dirección, Instituto de Biomedicina, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela, Apartado 4043, Caracas 1010A, Venezuela.
*Autor de correspondencia: mairacab@gmail.com
La leishmaniasis cutánea Americana (LCA) presenta un espectro clínico e inmunológico, donde las formas intermedias se asocian con respuestas celulares exacerbadas frente a Leishmania spp., que pueden reflejar defectos de inmunoregulación. Debido a que la IL-10 y el TGF-β son algunos de los factores importantes en modular la respuesta inmunitaria, nos propusimos establecer si existen alteraciones en su producción entre las diferentes manifestaciones de la leishmaniasis cutánea. Se estudiaron individuos con leishmaniasis cutánea: localizada (LCL n=20), mucocutánea (LCM n=14), intermedia (LCI n=20), difusa (LCD n=12) y 22 voluntarios sanos. La IL-10 se determino por citometría de flujo y el TGF-β por ELISA en muestras de plasma y en sobrenadantes de cultivos linfocitarios de pacientes y controles, estimulados "in vitro" con L. braziliensis. Se evidenció una baja producción de IL-10 en los pacientes con LCI respecto a los LCM y LCD. Mientras que en plasma, no se observaron variaciones en la concentración de esta citocina entre los diferentes grupos. En contraste, el TGF-β estuvo incrementado significativamente en concentración y frecuencia de individuos respondedores en todos los grupos de pacientes respecto a los controles, siendo más elevado en los pacientes LCM asociado con un Odds Ratio muy elevado (87). Luego de estimulación con L. braziliensis, los pacientes con LCM continúan mostrando una mayor producción de TGF-β que los pacientes con LCI y LCD. En general, nuestros resultados sugieren que la IL-10 y el TGF-β pudiesen estar mediando supresión en los pacientes con LCD y una inadecuada inmunoregulación en los pacientes con LCI por el escaso nivel de estas. En los pacientes LCM, ambas citocinas fallan en modular la respuesta exacerbada presente en ellos. Otros mecanismos de regulación deben de ser investigados en futuros estudios.
Palabras clave:
IL-10, TGF-β, leishmaniasis cutáea Americana. ]]> Regulatory cytokines (IL-10 and TGF-β) in American cutaneous leishmaniasis patientsSUMMARY
American cutaneous Leishmaniasis shows a clinical and immunological spectrum, where intermediate forms are associated with exacerbated cell responses against Leishmania spp., which may reflect defective immunoregulation. Since IL-10 and TGF-β modulate the immune response, we aimed to establish whether there are changes in its production between the different manifestations of cutaneous leishmaniasis. We studied individuals with cutaneous leishmaniasis: localized (LCL n = 20), mucocutaneous (MCL n = 14), intermediate (ICL n = 14), diffuse (LCD n = 12) and twenty two healthy subjects. The IL-10 was determined by flow cytometry and TGF-β by ELISA in plasma and in supernatants of lymphocyte cultures from patients and controls stimulated in vitro with L. braziliensis. The results showed a low production of IL-10 in patients with intermediate or chronic leishmaniasis compared to MCL and DCL patients. There were no changes in plasma concentration of this cytokine among the different groups. In contrast, the TGF-ß was significantly increased in concentration and frequency of respondents in all groups of patients compared to controls, being higher in MCL patients associated with an elevated odds ratio (87). After stimulation with L. braziliensis, the MCL patients continue to show increased production of TGF-β compared to ICL and LCD patients. Overall, our results suggest that IL-10 and TGF-β could be mediating suppression in DCL patients and an inadequate or defective regulation in ICL patients by the low level of these cytokines. In MCL patients, both cytokines fail to modulate their exacerbated response. Other regulatory mechanisms must be investigated in future studies.
Key words: IL-10, TGF-β
, American cutaneous leishmaniasisRecibido el 06/05/2010 Aceptado el 29/09/2010
INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis cutánea Americana (LCA) es producida por la infección con protozoarios del género Leishmania. La misma presenta un espectro de formas clínicas que poseen entre sí características distintivas bien establecidas (Convit, 1974; Convit et al., 1993). En un extremo del espectro se sitúa la forma inmunocompetente (leishmaniasis cutánea localizada, LCL), con un patrón de respuesta CD4+ Th1, en el cual se producen niveles adecuados de interferón-g (IFN-γ), linfotoxina (Lt), factor de necrosis tumoral -a (TNF-a) e interleucina-2 (IL-2) que conducen a la eliminación efectiva de los parásitos (Cáceres-Dittmar et al. 1993, Castés et al. 1996). Al otro extremo del espectro, se ubica la forma anérgica leishmaniasis cutánea difusa, (LCD); en donde el patrón de respuesta que se establece es de tipo Th2, predominando la producción de IL-4, IL-5, IL-10 y IL-13 entre otras citocinas, que conducen a la inhibición de los mecanismos leishmanicidas en los macrófagos y en consecuencia el parásito se disemina (Cáceres-Dittmar et al., 1993, Bomfim et al., 1996, Castés et al., 1996). Entre estas formas polares hay manifestaciones intermedias en las cuales se ubica la leishmaniasis mucocutánea (LCM) y la leishmaniasis cutánea intermedia (LCI), en esta última no hay compromiso mucoso y las lesiones pueden ser simples o múltiples, de desarrollo atípico, placas o múltiples úlceras (Zerpa et al., 1999, Díaz et al. 2002). De estas formas intermedias, la LCM ha sido la más estudiada, en estos pacientes se evidencia una elevada producción de IFN-g, TNF-a y óxido nítrico (Castés et al., 1988, 1993; Cabrera et al., 2003), y una baja carga parasitaria, lo cual ha permitido sugerir que el daño tisular que presentan estos pacientes es mediado por la exacerbada respuesta inflamatoria que se desarrolla. Esto, puede ser reflejo de un defecto en los mecanismos de regulación de la respuesta inmune. En ese sentido, la IL-10 y el TGF-β son reconocidas citocinas moduladoras de la respuesta inmune; en leishmaniasis las células recién infectadas, y las células T reguladoras CD4+CD25+ FoxP3+, liberan estas citocinas, modulando la respuesta hacia un patrón Th2, lo que inhibe: activación de los macrófagos, la presentació antigéica, , la expansió / proliferació clonal de los linfocitos T y la liberación de citocinas pro-inflamatorias (Barral et al.,1995; Rocha et al., 1999; Shevach, 2002). Muchos de estos reportes en humanos, son derivados de estudios aislados con alguna u otra de las formas clínicas que componen el espectro de la LCA, generádose en algunos casos, resultados contrastantes. Hasta la fecha no existe un estudio en el cual se documente la variación de estas citocinas en forma simultáea en las manifestaciones polares del espectro así como en la LCM y LCI.
En el presente trabajo nos propusimos evaluar las variaciones de IL-10 y el TGF-β en pacientes con LCA, a fin de establecer si existen alteraciones en la producción de estas citocinas en las diferentes formas clínicas de la enfermedad.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Població bajo estudio
]]> Pacientes: El estudio comprendióun total de 66 pacientes con LCA con un promedio de 31,83 ± 18,64 años de edad, los cuales fueron evaluados en la sección clínica de leishmaniasis del Instituto de Biomedicina, Caracas, Venezuela. Se incluyeron los siguientes grupos de pacientes: LCL (n=20), LCI (n=20), LCM (n=14) y LCD (n=12). Ellos fueron diagnosticados siguiendo criterios clínicos, epidemiológicos e histopatológicos establecidos por Convit (1974). Los pacientes con LCL tenían una evolución de la enfermedad de menos de 4 meses. Ninguno de los pacientes se encontraba bajo algú tipo de tratamiento al momento de realizar el estudio. Todos los pacientes o los representantes legales de los menores de edad aceptaron voluntariamente su participación en el estudio.Individuos voluntarios sanos: Un total de 22 individuos
sanos fue estudiado (edad promedio: 33,72 ± 18,13 años). Todos provenian de diferentes zonas endémicas de nuestro país y eran negativos a la prueba de Montenegro o leishmanina.Antígenos
En este estudio se utilizó un antígeno crudo de Leishmania (V) braziliensis
(cepa MHOM/BR/75/M2903). Los promastigotes en la fase estacionaria de crecimiento fueron autoclavados y almacenados a 4ºC.Aislamiento y activació de las céulas mononucleares
Las células mononucleares de sangre
periféica (PBMC), fueron aisladas de 20 mL de sangre venosa heparinizada de pacientes con LCA y sujetos controles. El aislamiento y el cultivo in vitro de las PBMC de los diferentes grupos se realizósegú lo descrito en un estudio previo (Cabrera et al., 2000). Las células fueron dispensadas por triplicado para cada condició experimental, en placas fondo plano estéiles de 96 pozos a una concentració de 2 x 105 céulas/pozo y se estimularon con antíeno crudo de Leishmania (V) braziliensis (L.b.) (2 x 105 paráitos/pozo) o solo medio RPMI 1640 (Gibco, USA). Las placas fueron incubadas a 37º 5% CO2. Después de 6 dís, se colectaron 100 μL/pozo de sobrenadante y se almacenóa -70º para posterior evaluació de citocinas.ELISA de TGF-β
La concentració de TGF-β en el plasma y en
los sobrenadantes de los cultivos celulares estimulados con L.b., fue determinada mediante el uso de una ELISA de captura comercial, siguiendo las recomendaciones del fabricante (TGF-β Duoset, R&D Systems, USA). La concentració de TGF-β fue determinada mediante una curva patró realizada con TGF-β recombinante suministrado por el kit (0 a 2000 pg/mL) por lo que los resultados fueron expresados en pg/mL. Para los sobrenadantes se sustrajo la concentració de TGF-β determinada en los pozos controles sin estimulación de los estimulados.La concentración de IL-10 en el plasma y en los sobrenadantes de las células de pacientes y controles estimuladas con L.b., fueron determinadas por citometría de flujo mediante un kit comercial ("CBA:cytometric bead array" BD Biosciences, USA) siguiendo el procedimiento del fabricante. Inicialmente se realizó una curva patrón mediante la dilución seriada (0 a 5000 pg/mL) del estándar de IL-10. Posteriormente, se mezclaron tanto las muestras (plasma o sobrenadantes diluidos 1:2) como el estándar con las perlas de captura (10 μL), las cuales estaban cubiertas con un anticuerpo contra IL-10. Se adicionaron 50 μL de reactivo de detección PE (anti-IL10 conjugado a PE) y se incubó en oscuridad por 3 horas a temperatura ambiente. La fluorescencia producida se midió en un citómetro de flujo FACSCanto (BD Biosciences) y se analizó con el software BD™ Cytometric Bead Array (CBA) para obtener la concentración de IL-10 en pg/mL. En el caso de los sobrenadantes, se procedió a sustraer la concentración de IL-10 obtenida para los pozos controles de los estimulados con L.b..
Análisis estadístico
]]> Los distintos análisis estadísticos fueron realizados mediante el uso del software: GraphPad INSTAT-3™, versión 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA). Debido a que los datos no se distribuyeron en forma normal, se compararon los diferentes grupos estudiados mediante el uso del test no-paramétrico de "Mann-Whitney".Se estableció la proporción de individuos respondedores para cada citocina en base a un valor "cut-off", el cual se fijó en base a la respuesta observada en el grupo de voluntarios sanos. La respuesta positiva era considerada por encima del valor del percentil 95 en cada caso. Las diferencias en la proporción de respondedores /no respondedores fue analizada mediante el test de chi-cuadrado con la corrección de "Yates" (χ2). En cada caso se calculó el "Odds ratio" o razón de probabilidades (OR), el cual constituye un cociente entre la probabilidad o proporción de veces de que un evento suceda y la probabilidad de que no suceda. En otras palabras, es un cociente que nos refleja el grado de asociación, en términos de susceptibilidad, entre una citocina y alguna de las manifestaciones de la LCA.
Consideraciones Éticas
Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética del Instituto de Biomedicina, UCV.
RESULTADOS
Concentración plasmática de IL-10 y TGF-β
En la Tabla I se presenta la concentración de IL-10 y TGF-βestimada para los distintos grupos de pacientes con LCA e individuos voluntarios sanos en muestras de plasma. Se evidenció un incremento significativo en la concentración de TGF-βentre los diferentes grupos de pacientes respecto a los controles (0.0001<P<0.001 por el test de Mann Whitney). Siendo más elevados en los pacientes con LCM respecto a los LCL y LCI. En contraste, no se observaron variaciones significativas entre los grupos
en la concentración de IL-10.
Como puede evidenciarse en la Fig. 1, en todos los grupos de pacientes se encontró un porcentaje significativo de respondedores por TGF-β asociados con OR significativos: LCL: OR=8.073; LCI: OR=9,9; LCM: OR=87 LCD: OR=19,12.
En general, luego de estimulación con L. braziliensis (Tabla II), se observó una incrementada concentración de TGF-βen los cultivos celulares de los pacientes con LCL respecto a los demás grupos; sin embargo ésto no fue significativo por la elevada desviación estándar que presentaron estos datos (promedio ± desviación estándar: 1681,2 ± 3034,2). Por otra parte, los pacientes con LCM desarrollaron una respuesta de TGF-β similar a la mostrada en plasma; las PBMC de estos pacientes produjeron una concentración significativa de esta citocina comparado con los pacientes LCI y LCD (P<0,05). Notablemente, la producción de IL-10 fue escasa en los cultivos de los pacientes con LCI respecto a los LCM y LCD (P<0,05).
No se observaron variaciones significativas en el porcentaje de individuos respondedores por la producción de IL-10 y TGF-β, en los cultivos celulares en presencia de L.b. (Fig. 2). Sin embargo fue muy interesante evidenciar que entre el grupo de pacientes con LCI no hubo respondedores frente al parasito al considerar ambas citocinas.
DISCUSIÓN
La respuesta inmunológica mediada por células, particularmente la activación de las células CD4+ Th1, es la clave en la resolución de las infecciones con Leishmania spp., ya que éstas activan a los macrófagos para la eliminación de los parásitos. Por ende, un defecto en el desarrollo de esta respuesta a nivel de activación o regulación repercute negativamente en la recuperación del paciente con leishmaniasis (Pirmez et al., 1993; Rocha et al., 1999). Sin embargo, Esta respuesta Th1 debe darse en forma moderada, puesto que en exceso puede mediar inmunopatología causante de daños tisulares. Diferentes investigaciones han mostrado que en los pacientes del área intermedia del espectro de la LCA, particularmente en los pacientes LCM, existe una exacerbación de la respuesta CD4+Th1 (elevada producción de IFN-γ y TNF-α), que se ha sugerido, es la responsable del daño en los tejidos y mutilación que se observa en estos individuos (Castés et al., 1996; Bacellar et al., 2002; Cabrera et al., 2003). Por otra parte, en los pacientes con LCI, también del área intermedia del espectro, se han reportado coincidencias con las respuestas de los pacientes con LCM tales como elevada reactividad a la prueba de Montenegro y la presencia de un patrón mixto de citocinas Th1 y Th2 en sus lesiones (Díaz et al., 2002; Díaz et al., 2006). Sin embargo, éstos no desarrollan lesiones en las mucosas. Hasta la fecha no existen reportes de estudios in vitro de la respuesta de citocinas luego de estimulación de PBMC de estos pacientes con antígenos de Leishmania spp.
Por otra parte, los estudios previos en citocinas reguladoras (TGF-β y la IL-10) no se han realizado simultáneamente en todas las formas clínicas que comprende el espectro de la LCA, y algunos de ellos proporcionan información contrastante por lo cual decidimos evaluar las variaciones de estas citocinas a
lo largo de las distintas manifestaciones clínicas del espectro de la LCA para tratar de dilucidar su papel en esta enfermedad.En ese sentido, se conoce que la IL-10 es
una de las citocinas más importantes en modular la respuesta inmune en pacientes con infecciones crónicas incluyendo leishmaniasis (Rocha et al., 1999); principalmente por su capacidad en inhibir la síntesis de IFN-γ y por ende la activació de los macróagos. Diferentes estudios han demostrado que la IL-10 es capaz de inhibir la respuesta inmunológica de tipo Th1 y Th2 tanto en modelos experimentales como en enfermedades infecciosas en humanos. Previos estudios han evidenciado que la inhabilidad en producir IFN-γ observada en los pacientes con leishmaniasis visceral en su fase aguda y en los pacientes con leishmaniasis cutáea en la fase inicial de la infecció, puede ser restaurada al neutralizar la IL-10 mediante el uso de anticuerpos monoclonales contra la misma (Carvalho et al., 1994; Rocha et al., 1999; Bourreau et al., 2009). Otro estudio mostróque la adició de IL-10 recombinante a cultivos celulares de pacientes con leishmaniasis visceral curados, suprime la respuesta de los linfocitos T (Bacellar et al., 2000).En el presente estudio, estimamos esta citocina
mediante el méodo de CBA Array (BD Biosciences), el cual ha sido utilizado satisfactoriamente en otras investigaciones, utilizando muestras de suero de pacientes con Kala azar, PKDL (Ansari et al., 2006) y malaria (Lyke et al., 2004). En nuestro estudio no detectamos variació en la concentració plasmáica de la IL-10 entre los diferentes grupos de pacientes y los individuos controles. Sin embargo, luego de estimulación con el antígeno de L. braziliensis, las PBMC de los pacientes con LCI mostraron una baja producción de IL-10 comparado con la respuesta desarrollada por los pacientes con LCM y LCD. Si bien, se ha encontrado en las lesiones de pacientes LCM un predominio de ARN mensajeros para la IL-10 (Cáeres-Dittmar et al., 1993; Pirmez et al.,1993), lo cual apoya nuestras observaciones, existen reportes contrarios (Bacellar et al., 2002; Díz et al., 2002; Díz et al., 2006). Bacellar et al. (2002), evidenciaron una disminución en la producción de esta citocina en los pacientes con LCM respecto a los LCL. Similarmente, luego de la curación clínica de pacientes con LCM se ha demostrado que la producción in vitro de esta citocina sigue siendo menor en los pacientes mucocutáeos que en los LCL (Góez-Silva et al., 2007). Otros investigadores observaron un mayor porcentaje de células positivas para IL-10 en las lesiones de los pacientes con LCI respecto a las lesiones de los sujetos con LCL; este estudio no incluyópacientes LCM (Díz et al., 2002, 2006). Por otra parte, otra investigació sugiere que el defecto en la regulación de la respuesta inflamatoria exacerbada caracterítica de los pacientes con LCM no es a nivel de una defectuosa producción de IL-10 sino en sus receptores; ellos no encontraron diferencias en el porcentaje de células positivas para la IL-10 en los pacientes con LCM respecto a los LCL, pero demuestran la disminució de la expresió del receptor para esta citocina en los primeros (Faria et al., 2005). ]]> Contrario a lo reportado por Castellano et al. (2009), los pacientes con LCL evaluados en nuestro estudio, no mostraron una producción importante de IL-10 en ninguna de las condiciones en que fue evaluada ("in vivo" e "in vitro"). Éto podrí ser consecuencia de la migració de las céulas T reguladoras (principales fuentes de IL-10 y TGF-β) desde la periferia hacia las lesiones, puesto que se ha reportado que estas células y los transcriptos de Foxp3+ son abundantes en las lesiones de estos pacientes (Campanelli et al., 2006; Bourreau et al., 2009). Má aú se ha especulado que estas células pudiesen estar regulando a las células efectoras en el sitio de la lesión.El TGF-β es otra citocina importante en la
modulación de la respuesta inmune en leishmaniasis experimental (Barral-Netto et al., 1992; Barral et al., 1993). Por una parte se ha señlado que la producció de TGF-β es inducida por el paráito y constituye un mecanismo de evasión de la respuesta inmunológica del hospedador al suprimir a los linfocitos T CD4+ Th1 (Barral-Netto et al., 1996). Recientemente se ha develado como una molécula importante en la iniciación de la respuesta inflamatoria y en la diferenciació de las céulas T CD4+ Th17 (Wahl, 2007).En el presente estudio, encontramos que
la concentració plasmáica de TGF-β estuvo incrementada significativamente en todos los grupos de pacientes con LCA (LCL, LCI, LCM y LCD) respecto a los controles, asociados con OR significativos. Sin embargo, la asociació má fuerte fue con los pacientes con LCM (OR=87). Esto concuerda con estudios previos, en los cuales macrófagos aislados de pacientes con leishmaniasis cutáea producen TGF-β al infectarlos con L. amazonensis, L. donovani o L. braziliensis (Barral-Netto et al.1996). En las lesiones de los pacientes con LCA se ha encontrado un número variable de parásitos estando muy incrementados en la forma difusa de la enfermedad, lo cual podría explicar en parte la alta producción de TGF-β. No lo es así para los pacientes con LCM, cuyas lesiones aL.b.ergan un escaso número de parásitos (Convit et al., 1993). Sin embargo estos mostraron una mayor concentración de TGF-β en plasma comparado con los pacientes LCI, LCL y en los sobrenadantes comparado nuevamente con los LCI y LCD. Otros estudios, también han reportado la presencia de TGF-β en las lesiones de pacientes con LCL, LCI y LCM (Barral-Netto et al., 1996; Díaz et al., 2006).Este TGF-β no parece estar regulando la respuesta inflamatoria que se observa en estos pacientes particularmente en los LCM. Quizás por no estar biológicamente activo, ya que se conoce que esta citocina es secretada como un complejo latente que requiere del clivaje proteolítico o de su modificación estructural para que su afinidad por su receptor sea óptima (Wahl, 2007). También, sus receptores podrían no expresarse adecuadamente en los linfocitos T. Otra posibilidad es que esta citocina en conjunción con la IL-6 pudiese estar dando lugar a la diferenciación de linfocitos Th17, muy involucrados en la respuesta inflamatoria crónica.
Notoriamente, las PBMC de los pacientes con LCI mostraron una disminución o ausencia en la producción de citocinas reguladoras (TGF-β e IL-10) luego de estimulación con L. braziliensis. Todo esto indica que la poca o ausente producción de estas citocinas no es suficiente para regular la respuesta
inmunológica que se establece en estos pacientes y la misma se hace crónica.En conclusión, las citocinas reguladoras
(IL-10 y TGF-β) pareciesen tener un significado distinto a lo largo del espectro de la LCA. El hallazgo más interesante de este estudio fue que en el área intermedia del espectro, la respuesta esta citocinas fue diferente. Los pacientes con LCI mostraron disminución o ausencia de ambas citocinas lo cual podría relacionarse con la cronicidad de la enfermedad que experimentan estos pacientes. En contraste, los pacientes con LCM, mostraron respuestas significativas de ambas citocinas, lo cual no se traduce en regulación o modulación de la respuesta inflamatoria que se evidencia en estos pacientes. Esto, nos hace especular que quizás sean otros factores los implicados en esta respuesta inflamatoria incontrolada. Para dilucidar esto, es necesaria la realización de futuras investigaciones orientadas en la determinación de factores recientemente vinculados con la génesis de enfermedades inflamatorias crónicas y relacionadas con el TGF-β. La determinación de citocinas IL-17, IL-9 e IL-22, asociadas con las subpoblaciones de linfocitos T recientemente descritas: Th17, Th9 y Th22 (Annunziato et al., 2007; Annunziato & Romagnani 2009; Eyerich et al., 2009; Vedlhoen et al., 2008) constituyen buenos candidatos para este propósito.AGRADECIMIENTOS:
Trabajo financiado por el proyecto individual CDCH-UCV Nº 09.00.5701.2004.
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