= 1409); Puerto Ayacucho de 576 a 57692 parásitos/μL de sangre (= 11351) y Platanal < 500 parásitos/μL de Antigens of Plasmodium falciparum, target of humoral immune response in patients treated with chloroquine
Albina Wide*1-2, María Rangel2, Jacinta Capaldo2, Gabriela Certad3, Rosalba Pabón2, Carlos Vásquez4, Neuro Galbán4, Noraida Zerpa5, Irma Rodriguez6, Magda Magris6 & Oscar Noya1-2
1 Cátedra de Parasitología, Escuela de Medicina "Luis Razetti", Instituto de Medicina Tropical, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
2 Centro de Estudios sobre Malaria, Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios Dr. "Arnoldo Gabaldon" - Ministerio del Poder Popular para la Salud, Caracas, Venezuela.
3 Cátedra de Parasitología, Escuela de Medicina "José María Vargas", Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.
4 Ministerio del Poder Popular para la Salud y Protección Social, Caracas, Venezuela.
5 Fundación Instituto Estudios Avanzados. Centro de Biociencias, Caracas, Venezuela.
6 Centro Amazónico de Investigación y Control de Enfermedades Tropicales (CAICET) Puerto Ayacucho, Estado Amazonas, Venezuela.
*Autor de correspondencia: albinawide@yahoo.com
]]> RESUMENSe planteó identificar antígenos que pudieran ser reconocidos por los anticuerpos IgG
1 e IgG3, descritos como protectores en la infección malárica, en personas con respuesta clínica adecuada (RCA) o falla al tratamiento (FT) antimalárico, provenientes de localidades con diferentes grados de endemicidad. Se evaluaron por Immunoblotting muestras de sueros de individuos provenientes de tres localidades del Edo. Amazonas (Venezuela): Puerto Ayacucho (Atures), San Juan de Manapiare (Manapiare) y Platanal (Alto Orinoco). La reactividad de IgG, IgG1 e IgG3 frente a componentes antigénicos del extracto de P. falciparum (FCB2), permitió identificar un mayor número de moléculas específicas en los pacientes con RCA que en los pacientes con FT. La frecuencia de reconocimiento de polipéptidos fue baja en las tres localidades, algunas moléculas con una frecuencia de reconocimiento igual o mayor al 20% pertenecían a sueros de individuos de las localidades de Puerto Ayacucho y Platanal, ambas con exposición permanente a P. falciparum. Dado el reconocimiento de polipéptidos por IgG, IgG1 e IgG3 en sueros de pacientes con RCA, estos podrían ser considerados como posibles blancos relevantes de la respuesta inmunológica protectora que coadyuven con el tratamiento antimalárico. Esto contribuiría al desarrollo y diseño de vacunas más efectivas, que prevengan la infección malárica y/o potencien la eficacia a la quimioterapia.Palabras claves: Plasmodium falciparum, Inmunoglobulinas IgG, IgG1, IgG
3, Falla Terapéutica (FT), Respuesta Clínica Adecuada (RCA), Cloroquina.SUMMARY
Here we studied the presence of antigens recognized by IgG1 and IgG3 antibodies, thought as protective, in patients with adequate clinical response (RCA) or treatment failure (FT), living in areas of different degrees of endemicity. Immunoblotting was evaluated from serum samples of individuals from three locations in the State Amazonas (Venezuela): Puerto Ayacucho (Atures), San Juan de Manapiare (Manapiare) and Pantanal (Alto Orinoco). The reactivity of IgG, IgG1 and IgG3 against antigenic components of the extract of P. falciparum (FCB2) identified a greater number of specific molecules in patients with RCA in patients with AFT. The frequency of recognition of polypeptides was low in all three locations, with some molecules having a recognition rate of greater than or equal to 20% sera of individuals belonging to the towns of Puerto Ayacucho and Platanal, both with cases of P. falciparum. Given the recognition of polypeptides by IgG, IgG1 and IgG3 in sera of patients with RCA, they could be considered as possible targets for relevant protective immune responses that contribute to malaria treatment. This would contribute to the development and design of more effective vaccines that prevent malaria infection and/or enhance the efficacy of chemotherapy.
Key words: Plasmodium falciparum, Inmunoglobulins IgG, IgG1, IgG3, Immunoblotting, Therapeutic Failure (TF), Adequate Clínical Response (ACR), Chloroquine.
Recibido el 12/09/2010 Aceptado el 02/08/2011
INTRODUCCIÓN
La respuesta inmunológica en malaria es compleja y específica para cada estadío del parásito. El desarrollo de inmunidad protectiva puede ser lento y se evidencia sólo después que el individuo ha sido expuesto a infecciones repetidas a través de los años (Bull & Marsh, 2002). Esto puede reflejar infecciones sucesivas por diferentes aislados del parásito expresando variantes antigénicas y/o clones (Riggione et al., 1996; Hommel & Gilles, 1998; Greenwood, 1999) y a la existencia de mecanismos de evasión de la respuesta inmunológica (Good & Doolan, 1999; Nascutiu, 2002). La inmunidad contra el estadío eritrocítico de Plasmodium falciparum está asociada con anticuerpos protectores de ciertas clases y subclases (Taylor et al., 1998; Garraud et al., 2003). Hay evidencias del papel de la inmunoglobulina G (IgG) en la protección contra la malaria, específicamente los isotipos IgG1 e IgG3 son considerados citofílicos y protectores contra infecciones por P. falciparum (Aucan et al., 2000; Garraud et al., 2003). A pesar de que los anticuerpos son esenciales en la inmunidad, niveles elevados de IgG contra un amplio rango de antígenos de estadíos sanguíneos de P. falciparum han mostrado ser pobres en la protección clínica (Ferreira et al., 1998; Ndungu et al., 2002). Sin embargo, algunos antígenos de los estadíos asexuales sanguíneos de P. falciparum inducen, preferencialmente, anticuerpos citofílicos. Uno de ellos el MSP-1 (merozoite surface protein-1) que se asocia con la respuesta de IgG1 e IgG3, mientras que el MSP-2 está restringido al estímulo de la síntesis de IgG3 (Ferreira et al., 1998; Aubouy et al., 2007). Se ha encontrado que individuos con malaria aguda por P. falciparum y con inmunoglobulínas IgG anti-RESA (Ring-inffected erithrocytes) o anti-GLURP (Glutamate-rich protein) respondieron efectivamente al tratamiento antimalárico, soportando la hipótesis de que la inmunidad adquirida aumenta la eficacia clínica de la terapia con drogas (Mayxay et al., 2001; Enevold et al., 2007). El propósito de este trabajo fue evaluar el patrón de la respuesta de anticuerpos citofílicos antimaláricos e identificar antígenos de P. falciparum con potencial valor protectivo, en base al grado de endemicidad en áreas maláricas del estado Amazonas y al reconocimiento diferencial a la quimioterapia con cloroquina.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> Área de estudioEl trabajo fue realizado en 3 municipios del estado Amazonas, Venezuela, con diferentes patrones de endemicidad a la malaria: 1. En Átures, en la población de Puerto Ayacucho, considerada como una región hipoendémica. 2. Manapiare, en la población de San Juan de Manapiare donde ocurrió un brote epidémico por P. falciparum a finales del año 2000. En esta región el muestreo se llevó a cabo después de haberse aplicado las medidas de control antivectorial. 3. En el Alto Orinoco, en la población de Platanal, donde la transmisión de la malaria es hiperendémica y estable con predominio de parasitemias bajas (Marcano et al., 2004).
Población estudiada
Se evaluaron sueros de pacientes sintomáticos, con infección por P. falciparum que habitaban en las comunidades endémicas (San Juan de Manapiare, n=20, edad de 2-66 años; Puerto Ayacucho, n=12, rango de edad de 8-44 años; Platanal, n=10 edad de 7-50 años), divididos en dos grupos de acuerdo a su respuesta al esquema de tratamiento con cloroquina establecido en Venezuela hasta diciembre del año 2002 (OMS/OPS, 1998). Un grupo con respuesta clínica adecuada al tratamiento (RCA) y un grupo con falla terapéutica (FT). Los rangos de parasitemia fueron: San Juan de Manapiare de 500 a 7680 parásitos/μL de sangre (= 1409); Puerto Ayacucho de 576 a 57692 parásitos/μL de sangre (= 11351) y Platanal < 500 parásitos/μL de
En San Juan de Manapiare se encontró que el 93 % presentó RCA, en Puerto Ayacucho el 100% presentó FT y en Platanal el 70% presentó RCA y el 30% FT.
También se incluyó como grupo control, personas sin infección ni antecedentes maláricos (determinado por diagnóstico parasitológico), procedentes de Caracas y habitantes de Puerto Ayacucho.
Fuente de antígeno
El antígeno utilizado consistió de un extracto crudo de glóbulos rojos parasitados con P. falciparum (GRP) cepa FCB2 (sensible a la cloroquina), mantenido en cultivo "in vitro" según la metodología de Trager & Jensen (1976). Los parásitos fueron concentrados mediante gradiente de Percoll al 90% (Kramer et al., 1982; Rivadeneira et al., 1983) y tratados con una solución de lisis (1 mM de PMSF, 1 mM de Iodoacetamida, 1 mM de EDTA y SDS 5% (p/v) y se centrifugó a 21000 g a 4ºC por 10 min, utilizando el sobrenadante como fuente de antígeno (Patarroyo & López, 2002). La concentración de proteínas se determinó mediante el método de ácido bincinconínico (Smith et al., 1985). Se incluyó como control, un extracto de glóbulos rojos sanos (GRS), correspondiente al mismo lote utilizado en el cultivo de P. falciparum, a una concentración de 35 μg en total para absorber las reacciones específicas del GRS.
Immunoblotting
El patrón de la respuesta de anticuerpos antimaláricos y la identificación de los antígenos de P. falciparum con potencial valor protectivo se evaluó mediante la técnica de inmunodetección de polipéptidos con los sueros de pacientes tratados con cloroquina (Towbin et al., 1979). Las muestras fueron analizadas frente a un mismo lote de antígeno y los mismos controles negativos y positivos. El extracto crudo de P. falciparum fue separado por electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% en condiciones disociantes y reductoras (Laemmli, 1970), transferido a papel de nitrocelulosa y bloqueado con leche descremada al 5% (p/v) en PBS-Tween-20. El marcador de peso molecular utilizado fue el mismo en todos los ensayos. Luego, el papel fue cortado en tiras de 2 mm e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente con los sueros humanos a una dilución de 1:100 para la detección de IgG y 1:50 para IgG1 e IgG3. Los sueros humanos fueron previamente incubados con 35 μg en total de glóbulos rojos sanos por 1 hora, debido a que los sueros reconocen a componentes moleculares de glóbulos rojos sanos. Después se lavaron las tiras (3X) con PBS Tween 20 y se incubaron con el anticuerpo antihumano marcado con peroxidasa, IgG dilución de 1:20.000 (Sigma, St. Louis, MO, A-0170), IgG1 dilución 1:1500 (The binding site, AP006), IgG3 dilución 1:2000 (The binding site, AP008). Las reacciones fueron reveladas con solución de Luminol (Amersham Life Sciences, UK) y expuestas a una placa fotográfica (ECL-Hyperfilm).
]]> Análisis de datosLa determinación de los pesos moleculares de los polipéptidos se realizó mediante el software Kodak Digital ScienceTM. Para determinar la frecuencia de reconocimiento de los diferentes polipéptidos por las inmunoglobulinas se utilizó el método estadístico de frecuencia relativa porcentual (Camel, 1972).
Consideraciones éticas
Las muestras evaluadas en el estudio se tomaron previo consentimiento informado y antes de iniciar el tratamiento.
RESULTADOS
Patrón de reconocimiento de componentes polipeptídicos de P. falciparum por las clases y subclases de inmuoglobulinas (IgG, IgG1 e IgG3) de sueros de pacientes provenientes de las localidades de Puerto Ayacucho, San Juan de Manapiare y Platanal.
Puerto Ayacucho
El patrón de reconocimiento de bandas polipeptídicas específicas en el extracto de GRP por IgG consistió de 80 polipéptidos con pesos moleculares entre 11 y 227 kDa, siendo los de 11, 12, 13, 15, 16, 25, 30, 41, 46, 53, 62, 72, 86, 93 y 99 kDa (Fig. 1) los que presentaron una frecuencia de reconocimiento ≥ 20 % (Tabla I). La IgG1 reconoció 44 polipéptidos entre 14 y 233 kDa. Los polipéptidos de 15, 43, 52, 58, 72, 97 y 113 kDa presentaron una frecuencia del 20 % (Tabla I). La IgG3 de los sueros de los pacientes reconoció 47 polipéptidos entre 13 y 118 kDa. Las moléculas de 15, 27, 58, 66, 74 y 99 kDa presentaron una frecuencia ≥ 20 % (Tabla I).
El patrón de reconocimiento en el extracto de GRP por IgG consistió de 81 bandas polipeptídicas específicas con pesos moleculares entre 11 y 222 kDa, siendo los de 23, 35, 37, 42, 46, 47, 53, 57, 61, 62, 68, 69, 78, 90, 116 y 148 kDa los que presentaron una frecuencia de reconocimiento ≥ 10 % (Fig. 2). Las moléculas de 47 y 78 kDa presentaron frecuencias ≥ 20 % (Tabla I). IgG1 reconoció 61 polipéptidos entre 17 y 176 kDa. Los polipéptidos de 24, 40, 55, 58, 63, 64, 72, 78, 85, 98, 100, 105, 110, 114, 119, 123, 125, 139, 140 y 176 kDa, presentaron una frecuencia ≥ 10%, sólo la molécula de 78 kDa tuvo una frecuencia de reconocimiento ≥ 20% (Tabla I). IgG3 de los sueros de los pacientes reconoció 61 polipéptidos entre 15 y 150 kDa. Las moléculas de 23, 28, 40, 89, 116, 128, 129, 134 y 138 kDa presentaron una frecuencia ≥10%, ninguna molécula presentó un reconocimiento ≥ 20% (Tabla I).
Platanal
El patrón de reconocimiento de bandas polipeptídicas específicas en el extracto de GRP por IgG consistió de 48 polipéptidos con pesos moleculares entre 17 y 145 kDa, siendo los de 41, 42, 45, 48, 49, 50, 52, 64, 66, 78, 93, 122, 137, 138 y 144 kDa (Fig. 3) los que presentaron una frecuencia de reconocimiento ≥ 20% (Tabla I). IgG1 reconoció 31 polipéptidos entre 15 y 139 kDa. Los polipéptidos de 15, 19, 56, 73, 98, 99, 101, 121 y 122 kDa presentaron una frecuencia ≥20 % (Tabla I). IgG3
de los sueros de los pacientes reconoció 34 polipéptidos entre 14 y 245 kDa. Las moléculas de 24, 27, 34 y 35 kDa presentaron una frecuencia ≥20% (Tabla I). 
No se encontraron antígenos con frecuencias de reconocimiento iguales o mayores a 20% que estuviesen presentes en las tres localidades evaluadas. Sólo dos moléculas fueron reonocidas por los sueros provenientes de las comunidades de Puerto Ayacucho y Platanal con una frecuencia de reconocimiento igual o mayor a 20% y correspondieron a los pesos moleculares 41 y 93 kDa (Tabla I).
Patrón de reconocimiento de componentes polipeptídicos de P. falciparum por las clases y subclases de inmuoglobulinas (IgG, IgG1 e IgG3) de sueros de pacientes con diferentes respuestas al tratamiento con cloroquina.
Se identificaron varios antígenos asociados a la respuesta clínica adecuada (RCA) y a la falla terapéutica (FT) al tratamiento con cloroquina.
En pacientes con respuesta clínica adecuada
]]> La IgG de los sueros de pacientes reconoció 21 polipéptidos específicos con pesos moleculares entre 14 y 153 kDa. La IgG1 reaccionó con 15 polipéptidos específicos de pesos moleculares entre 20 y 140 kDa.La IgG3 reconoció 4 polipéptidos específicos de 21, 24, 48 y 93 kDa. Solo se reportaron aquellos polipéptidos cuya frecuencia de reconocimiento en todos los casos fue mayor al 10% (Tabla II).
En pacientes con falla terapéutica
En los sueros de pacientes con falla terapéutica a la cloroquina se encontró que las inmunoglobulinas reconocieron un número menor de polipéptidos. La IgG reaccionó con 4 polipéptidos específicos con pesos moleculares entre 11 y 44 kDa. La IgG1 reaccionó con 2 polipéptidos específicos de pesos moleculares 46 y 77 kDa. La IgG3 reconoció sólo 1 polipéptido específico de 41kDa. Al igual que los pacientes con
RCA sólo se tomaron en cuenta aquellos polipéptidos cuyo reconocimiento fue igual o superior al 10%. En ambos grupos de pacientes (FT y RCA) se observó un mayor número de antígenos reconocidos por las inmunoglobulinas IgG e IgG1 con respecto a IgG3 (Tabla I). En algunos casos se observó reconocimiento de algunos polipéptidos de GRS por los anticuerpos presentes en los sueros controles negativos (sin episodios maláricos previos), provenientes de las áreas endémicas.Las moléculas de 11, 38, 41 y 46 kDa fueron reconocidas sólo en el grupo con falla terapéutica. El polipéptido de 38 kDa presentó la mayor frecuencia de reconocimiento (27,27%). Esta molécula resultó específica del parásito al no ser reconocida en el
extracto de glóbulos rojos sanos utilizado como control.Los antígenos de importancia en este estudio
son los específicos del glóbulo rojo parasitado con P. falciparum, es decir que no están presentes en el glóbulo rojo sano utilizado como control. El patrón de reconocimiento de componentes antigénicos de P. falciparum por inmunoglobulinas de sueros de personas con RCA o FT, mediante Immunoblotting se muestra en las Fig. 1, 2 y 3.DISCUSION
Esta investigación es una de las primeras
realizadas en el país enfocadas a identificar antígenos blancos de la respuesta inmunitaria humoral protectiva en la infección malárica, que pudieran participar como coadyuvantes en la respuesta al tratamiento y que además pudieran asociarse con el grado de endemicidad en las diferentes localidades del foco malárico meridional de Venezuela. Aunque la falla terapéutica es multifactorial y depende de la biología del parásito, presencia de genes de resistencia, constitución genética de la población, estacionalidad de la transmisión, del metabolismo y absorción de la droga (Wellems & Plowe, 2001). También se ha determinado que una respuesta inmunitaria protectora preexistente, es uno de los factores fundamentales en la eficacia de la terapia antimalárica (White, 2004). De acuerdo a las regiones evaluadas del Edo. Amazonas, resulta interesante que en este estudio se encontraron diferencias en el patrón y frecuencia de reconocimiento de polipéptidos en el extracto antigénico de una cepa de referencia internacional por las diferentes inmunoglobulinas presentes en los sueros de los pacientes según su proveniencia. Dichas diferencias podrían ser explicadas entre otros factores, por las condiciones epidemiológicas de estas áreas, la constitución genética de la población y por la presencia de diferentes aislados de plasmodios circulando en cada una de estas localidades (lo cual fue confirmado por PCR y secuenciación, datos no publicados). Con respecto a las diferencias poblacionales entre las áreas de estudio, Puerto Ayacucho y San Juan de Manapiare son poblaciones multiétnicas, mientras que la de Platanal está constituída principalmente por la etnia Yanomami. Por otra parte, debido a sus condiciones de vida, la población de Platanal está expuesta a un mayor número de picadas de anofelinos infectados, lo cual aumenta la probabilidad de transmisión de diferentes aislados del parásito en comparación con las otras dos áreas (Magris, 2004; Magris et al., 2007). No obstante, otras investigaciones han revelado que la población de P. falciparum del Alto Orinoco tiene poca variabilidad genética (Lasserson et al., 1999; Tami-Hirsch, 1999)En cuanto a las diferencias de la transmisión malárica que pudieran presentarse entre comunidades diferentes, es importante mencionar que algunos autores han planteado que hay variación en los títulos de anticuerpos contra P. falciparum de acuerdo con la estacionalidad (Riggione et al., 1996; Perraut et al., 2000). Específicamente, en relación al tipo de malaria que se presenta en las zonas estudiadas, en las regiones de Puerto Ayacucho y San Juan de Manapiare existe una marcada estacionalidad por lo cual la transmisión malárica no es constante. En Platanal la transmisión de paludismo es estable, ocurre durante todo el año debido a la alta pluviosidad en esa región, siendo esta zona holoendémica o hiperendémica según la definición de Bruce-Chwatt (1986). De acuerdo a esta clasificación, los pobladores de regiones donde ocurre una transmisión perenne desarrollan un considerable grado de respuesta inmunitaria, lo que conlleva a una reducción de la prevalencia malárica y de la morbilidad. Por otro lado, la región de Puerto Ayacucho correspondería a una zona hipoendémica, ya que la transmisión tiene una intensidad variable de acuerdo a las circunstancias de la localidad. Es importante resaltar que estas localidades no se enmarcan estrictamente a las definiciones propuestas por Bruce-Chwatt (1986) (Marcano et al., 2004). Adicionalmente, es fundamental destacar que en la localidad de San Juan de Manapiare se producen circunstancias especiales que lo convierten en una zona de transmisión malárica inestable ya que el momento de toma de las primeras muestras (2001), coincidió con una situación de epidemia por P. falciparum, inusual en esa comunidad, puesto que hasta ese momento había venido predominando la infección por P. vivax. A partir de esa epidemia se aplicaron medidas anti-vectoriales y tratamiento a la población infectada, lográndose que la transmisión permaneciera esporádica y con una prevalencia muy baja. Este período correspondió con la toma de las restantes muestras de sueros (Certad et al., 2005). Esto contribuiría a explicar el hecho de que la frecuencia de reconocimiento por IgG fuera mayor en los casos de Platanal y Puerto Ayacucho en comparación con la de San Juan de Manapiare ya que como se mencionó anteriormente la adquisición de inmunidad toma años, lo cual ocurre bajo un continuo contacto con el parásito (Artavanis-Tsakonas et al. , 2003). En algunos casos la respuesta inmunológica no sólo se relaciona a un efecto acumulativo asociado a la exposición, sino también a la edad de las personas. En evaluaciones anteriores realizadas por nuestro grupo con las muestras provenientes de San Juan de Manapiare y Puerto Ayacucho, utilizando la técnica de MABA (Noya & Alarcón de Noya, 1998), se encontró que la frecuencia de seropositividad de IgG3 fue estadísticamente significativa en individuos mayores de 12 años (datos no publicados). Así mismo, en esta investigación se encontraron diferencias en el patrón de respuesta inmunitaria de acuerdo a la respuesta al tratamiento antimalárico. Un mayor número de moléculas antigénicas fueron reconocidas por los pacientes con RCA. Los polipéptidos de 114 -116, 123 - 125 kDa fueron reconocidos tanto por IgG como por IgG1, siendo los de 124 y 125 kDa equivalentes al peso molecular de la proteína serine repeat antigen (SERA). Igualmente fueron reconocidos polipéptidos de 55-58 kDa que podrían ser equivalentes al fragmento de 56 kDa de la proteína SERA que es conservado entre los aislados y cepas de P. falciparum
.Diferentes estudios han descrito que la inmunidad adquirida puede contribuir con la respuesta terapéutica. En Gambia se encontró en un área de alta prevalencia de resistencia a drogas que los anticuerpos anti-MSP-1, estaban asociados con la mejoría clínica
y control de la parasitemia en niños con malaria no complicada que habían recibido tratamiento (Pinder et al., 2006). En un estudio realizado en Tanzania se encontró que en niños infectados con P. falciparum y con respuesta al tratamiento antimalárico, la prevalencia de anticuerpos IgG anti glutamate rich protein (GLURP) G era significativamente más elevada que en el caso de los niños con falla al tratamiento (Enevold, 2007). Sin embargo, en este estudio las frecuencias de reconocimiento de polipéptidos específicos fueron bajas (aproximadamente 10%), y el número de antígenos con mayor frecuencia de reactividad con las IgG1 e IgG3 presentes en los sueros de los pacientes con RCA fue relativamente equivalente a hallazgos anteriores del laboratorio en los cuales no se encontró una asociación significativa entre pacientes con RCA y los anticuerpos protectores IgG1 e IgG3 (Wide et al., 2004). ]]> La frecuencia de reconocimiento ≥20% de los componentes antigénicos de P. falciparum (cepa FCB2), por las inmunoglobulinas asociadas a protección (IgG1 e IgG3), pareciera indicar o reafirmar que la protección viene dada por la sumatoria de mecanismos celulares y humorales contra distintos antígenos y no contra un grupo reducido de moléculas. Es decir, que la respuesta exitosa al tratamiento no sólo depende de la respuesta inmunológica humoral sino también de otras vías que involucran al TNF, óxido nítrico y otros radicales libres de manera de contribuir a la eliminación de este protozoario intracelular (Hommel & Gilles, 1998).En general, la cantidad de polipéptidos reconocidos por IgG3 fue menor, probablemente debido a la baja avidez de este isotipo hacia los componentes polipeptídicos presentes en el extracto crudo del plasmodio utilizado (cepa FCB2), o a las diferencias entre la composición antigénica del aislado responsable de la infección con respecto al antígeno utilizado en el ensayo. Estos resultados podrían también estar influenciados por el tiempo que transcurrió entre el
momento en que comenzó la infección, el diagnóstico y la toma de la muestra de suero, dada la vida media de estos anticuerpos (Nguer et al., 1997).En general, en esta investigación se encontró un bajo número de polipéptidos reconocidos por las
inmunoglobulinas evaluadas. Una posible explicación sería que la expresión de los antígenos maláricos pudiera ser modulada por la variación antigénica de P. falciparum, por lo tanto dichos antígenos pueden encontrarse en abundancia en algunas variantes y ausentes en otras (Perraut et al., 2000). Adicionalmente, algunos de los antígenos con bajas frecuencias o ausencia de reconocimiento por las Igs, podrían estar formando complejos inmunes circulantes lo cual impide su detección. Tal es el caso de un fragmento de 11 kDa de PFMSP1, uno de los candidatos para vacunas (Pizarro et al., 2002), de SERA o de EBA175 (Sam- Yellowe, 1993; Jhaveri et al., 1997; Sim, 1998). También el bajo número de polipéptidos reconocidos, pudiera deberse a que algunas moléculas al ser tratadas bajo condiciones reductoras y disociantes hayan perdido su conformación epitópica dejando de ser reconocidas por los anticuerpos.El reconocimiento inespecífico de algunas moléculas tanto en el extracto de glóbulos rojos parasitados como en el de glóbulos rojos sanos por los diferentes isotipos de inmunoglobulinas de sueros negativos sin episodios maláricos, se explicaría por fenómenos de reactividad cruzada entre moléculas similares a los antígenos de Plasmodium, presentes en otros agentes patógenos e incluso entre los anofelinos y los plasmodios, por eventos de autoinmunidad cuya trascendencia es desconocida, ya que se ha observado la presencia de anticuerpos antinucleares en población aparentemente sana (Tan et al., 1997; Daniel-Ribeiro, 2000) o también por un mecanismo de inmunidad innata que sería responsable de inducción de anticuerpos anti-glóbulos rojos sanos (Stevenson & Ridley, 2004), o la presencia de anticuerpos anti-banda 3 oxidada que aparece en los eritrocitos envejecidos y garantizan su eliminación a nivel esplénico (Arese et al.
, 1991).Las vacunas antimaláricas en estudio han sido cuestionadas por el hecho de que la adquisición
de inmunidad toma muchos años (Noya et al., 1994; Alonso et al. 2004; Bermúdez et al., 2007; Lozano & Patarroyo, 2007), lo cual se espera debido a un contínuo contacto con el parásito como ocurre en las áreas holo e hiperendémicas. Por otra parte, hay autores que señalan que esta inmunidad es parcial (no estéril) y de vida corta si el estímulo parasitario no está presente (Carvalho et al., 2002). Sin embargo, aún siendo así, si se indujera una inmunidad parcial que coadyuvara con la quimioterapia, podría minimizarse el problema creciente de la quimioresistencia.Estos resultados permiten hacer algunas inferencias acerca del patrón de inmunoglobulinas y su posible participación en la respuesta inmunitaria protectiva en pacientes tratados con drogas antimaláricas. Asimismo, es necesario ampliar estos estudios tanto en relación al número de pacientes como el tipo de localidades, para confirmar si es sólo el factor endemicidad el que condiciona los diferentes patrones de reconocimiento. Obviamente, es necesario llevar a cabo investigaciones dirigidas a la búsqueda de antígenos que actúen como blancos de la respuesta inmunitaria e identificar posibles candidatos que no sólo prevengan la infección sino también que potencien el efecto de los medicamentos antimaláricos. Estas estrategias metodológicas podrían permitir identificar antígenos que, incluidos en una vacuna multi-epitópica, induzcan una inmunidad parcial y coadyuve con la eficacia del tratamiento antimalárico para controlar la infección aún con parásitos resistentes a la quimioterapia en uso.
AGRADECIMIENTOS
Principalmente a las comunidades de Puerto Ayacucho, San Juan de Manapiare y de Platanal. A los microscopistas Aníbal Carrasquel, Margarita Rodríguez (CAICET-Puerto Ayacucho), Leonel Díaz y Jhon Camico (Zona de Malariología, Región 19, San Juan de Manapiare-Edo. Amazonas). Esta Investigación fue subvencionada por la Gerencia de Investigación Orientada, Agenda Salud, FONACIT, Proyecto N° 98003203 y por el Consejo de Desarrolo Científico Humanístico (CDCH)-(UCV), Proyecto PI-09-00-6470-2006. La presentación de resultados en Congresos nacionales e internacionales fue
apoyado por el CDCH-UCV.REFERENCIAS
1. Alonso P. L., Sacarlal J., Aponte J. J., Leach A., Macete E., Milman J., et al. (2004). Efficacy of the RTS,S/AS02A vaccine against Plasmodium falciparum infection and disease in young African children: randomised controlled trial. Lancet. 364 (9443): 1411-1420. [ Links ]
2. Arese P., Turrini F., Bussolino F., Lutz H. U., Chiu D., Zuo L., et al. (1991). Recognition signal for phagocytic removal of favic malaria-infected and sickled erythrocytes. Adv. Exp. Med. Bol. 307: 317-327. [ Links ]
3. Artavanis-Tsakonas K., Tongren J. E. & Ridley E. M. (2003). The war between the malaria parasite and the immune system: immunity, immunoregulation and immunopathology. Clin. Exp. Immunol. 133: 145-152. [ Links ]
4. Aubouy A., Migot-Nabias F. & Deloron P. (2007). Correlations between treatment outcome and both anti-MSP1(19) antibody response and erythrocyte-related genetic factors in Plasmodium falciparum malaria. Infect. Genet. Evol. 7: 147-154. [ Links ]
5. Aucan C., Traore Y., Tall F., Nacro B., Traore-Leroux T., Fumoux F. & Rihet P. (2000). High Immunoglobulin G2 (IgG2) and low IgG4 levels are Associated with Resistance to Plasmodium falciparum. Malaria. Infect. Imm. 68: 1252-1258. [ Links ]
6. Bermúdez A., Reyes C., Guzmán F., Vanegas M., Rosas J., Amador R., et al. (2007). Synthetic vaccine update: applying lessons learned from recent SPf66 malarial vaccine physicochemical, structural and immunological characterization. Vaccine. 25: 4487-4501. [ Links ]
7. Bruce-Chwatt L. J. (1986). Essential Malariology. Chapter 7 pp. 127- 48. 2nd Ed. William Heinemann Medical Book, Ltd. London, U.K. [ Links ]
8. Bull P. C. & Marsh K. (2002). The role of antibodies to Plasmodium falciparum - infected erythrocyte surface antigens in naturally acquired immunity to malaria. Trends Microbiol. 10: 55-58. [ Links ]
9. Camel V. F. (1972). Estadística Médica. pp. 131-132. Tomo I. Edit. Consejo de Publicaciones de la Universidad de los Andes. Mérida, Venezuela. [ Links ]
10. Carvalho L. J. M., Daniel – Ribeiro C. T. & Goto H. (2002). Malaria vaccine: candidate antigens, mechanisms, constraints and prospects. Scand. J. Immunol. 56: 327- 343. [ Links ]
11. Certad G., Wide A., Rodríguez I., Capaldo J., Zárate M., Galbán N., et al. (2005). Respuesta terapéutica y parasitemia en pacientes con malaria por Plasmodium falciparum en diferentes comunidades del estado Amazonas, Venezuela. Bol. Mal. Salud Amb. 45: 19-25. [ Links ]
12. Daniel-Ribeiro C. T. (2000). Is there a role for autoimmunity in immune protection against malaria? Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 95: 199 – 207. [ Links ]
13. Enevold A., Nkya W. M. M. M., Theisen M., Vestergaard L. S., Jensen A. T. R., Staalsoe T., et al. (2007). Potential impact of host immunity on malaria treatment outcome in Tanzanian children infected with Plasmodium falciparum. Malar. J. 6: 153. [ Links ]
14. Ferreira M. U., Kimura E. A. S. & Katzin A. M. (1998). The IgG subclass distribution of naturally acquired antibodies to Plasmodium falciparum in relation to malaria exposure and severity. Ann. Trop. Med. Parasitol. 92: 245- 256. [ Links ]
15. Garraud O., Mahanty S. & Perraut R. (2003). Malaria-specific antibody subclasses in immune individuals: a key source of information for vaccine design. Trends Immunol. 24: 30-35. [ Links ]
16. Good M. F. & Doolan D. L. (1999). Immune effector mechanisms in malaria. Curr. Opin. Immunol. 11: 412- 419. [ Links ]
17. Greenwood B. (1999). What can the residents of malaria endemic countries do to protect themselves? Parassitologia. 41: 295-299. [ Links ]
18. Hommel M. & Gilles M. (1998). Malaria. Chapter 20. pp 361-409. En: Topley and Wilson´s. Microbiology and microbial infections. Volumen V: Parasitology. Cox F. E., Kreier J. P. and Wakelin D. Eds. London, U.K. [ Links ]
19. Jhaveri K. N., Ghosh K., Mohanty D., Parmar B. D., Surati R. R., Camoens H. M., Joshi S. H., Iyer Y. S., Desai A. & Badakere S. S. (1997). Autoantibodies, immunoglobulins, complement and circulating immune complexes in acute malaria. Natl. Med. J. India. 10: 5-7. [ Links ]
20. Kramer K. L., Kan S. Ch. & Siddiqui W. A. (1982). Concentration of Plasmodium falciparum–infected erythrocytes by density gradient centrifugation in Percoll. J. Parasitol. 68: 336-337. [ Links ]
21. Laemmli U. K. (1970). Clearage of structural proteins during the assembly of head of bacteriophage T4. Nature. 227:
680-685. [ Links ]22. Lasserson K. F., Petralanda I., Almera R., Barker
R. H. , Spielman A., Maguire J. H. & Wirth D. F. (1999). Genetic characterization of an epidemic of Plasmodium falciparum malaria among Yanomami amerindians. J. Infect. Dis. 180: 2081-5. [ Links ]23. Lozano J. M. & Patarroyo M. E. (2007). A rational strategy for a malarial vaccine development.
Microbes Infect. 9: 751-760. [ Links ]24. Magris M. (2004).
Malaria control trial using lambdacyhalohrin treated nets in Yanomami communities in Amazonas State, Venezuela. [Ph.D dissertation] London School of Hygene and Tropical Medicine, London, UK. [ Links ]25. Magris M., Rubio-Palis Y., Menares C. & Villegas L. (2007). Vector bionomics and malaria transmission in the Upper Orinoco River, Southern Venezuela.
Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 102: 303 -311. [ Links ]26. Marcano T. J., Morgado A., Tosta C. E. & Rodrigues
Coura J. (2004). Cross - Sectional Study Defines Difference in Malaria Morbidity in Two Yanomami Communities on Amazonian Boundary between Brazil and Venezuela. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 99: 369- 376. [ Links ]27. Mayxay M., Chotivanich K., Pukrittayakamee S., Newton P., Looareesuwan S. & White N. J. (2001). Contribution of humoral immunity to the therapeutic response in falciparum malaria. Am. Soc. Trop. Med. Hyg. 65: 918-923. [ Links ]
28. Nascutiu A. M. (2002). "Hide-and-seek as modus vivendi of malaria parasites. Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 61:
301- 314. [ Links ]29. Ndungu F. M., Bull P. C., Ross A., Lowe B. S., Kabiru E & Marsh K. (2002). Naturally acquired immunoglobulin (Ig)G subclass antibodies to crude
asexual Plasmodium falciparum lysates: evidence for association with protection for IgG1 and disease for IgG2. Parasite Immunol. 24: 77- 82. [ Links ]30. Nguer C. M., Diallo T. O., Diouf A., Tall A., Duellye A., Perraut R. & Garuad O. (1997).
Plasmodium falciparum and Merozoite Surface Protein 1 - Specific antibody isotype balance in immune senegalese adults. Infect. Immun. 65: 4873 - 4876. [ Links ]31. Noya O. & Alarcón de Noya B. (1998). The multiple antigen blot assay (MABA): A simple immunoenzymatic technique for simultaneous screening of multiple antigens.
Immunol. Letters. 63: 53-56. [ Links ]32. Noya O., Gabaldón Y., Alarcón de Noya B., Borges R., Zerpa N., Urbáez J. D.,
et al. (1994). A population-based clinical trial with the SPf66 synthetic Plasmodium falciparum malaria vaccine in Venezuela. J. Infec. Dis. 170: 396-402. [ Links ]33. OMS/OPS (1998). Evaluación de la eficacia terapéutica para el tratamiento de la malaria por Plasmodium falciparum sin complicaciones en las Américas. OMS/OPS/HC/113/98. Geneva, Switzerland. [ Links ]
34. Patarroyo M. E. & López O. (2002). Preparación de antígeno de Plasmodium falciparum.
Fundación Instituto de Inmunología de Colombia. Bogotá, Colombia. [ Links ]35. Perraut R., Mercereau-Puijalon O., Diouf B., Tall A., Guillote M., Le Scanf C.,
et al. (2000). Seasonal fluctuation of antibody levels to Plasmodium falciparum parasitized red blood cell-associated antigens in two senegalese villages with different transmission conditions. Am. Trop. Med. Hyg. 62: 746-751. [ Links ]36. Pinder M., Sutherland C. J., Sisay-Joof F., Ismaili J., McCall M. B. B., Ord R.,
et al. (2006). Immunoglobulin G antibodies to Merozoite Surface Antigens are associated with recovery from chloroquine – resistant Plasmodium falciparum in Gambian children. Infect. Immun. 74: 2887-2893. [ Links ]37. Pizarro J. C., Chitarra V., Calvet C., Verger D. & Bentley G. A. (2002). Crystalization and preliminary structural analysis of an antibody
complex formed with PfMSP1-19, a malaria vaccine candidate. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 58 (Pt 7): 1246-1248. [ Links ]38. Riggione F., Pulido M. & Noya O. (1996).
Plasmodium falciparum: Surface modifications of infected erythocytes from clinical isolates. Evidence of antigenic diversity using Venezuelan human malaria sera. Parasitol. Res. 82: 490- 496. [ Links ]39. Rivadeneira E. N., Wasserman M. & Espinal C. T. (1983). Separation and concentration of schizonts of
Plasmodium falciparum by Percoll gradients. J. Protozool. 30: 367- 370. [ Links ]40. Sam-Yellowe T. Y. (1993).
Plasmodium falciparum: analysis of protein-protein interactions of the 140/130/110-kDa rhoptry protein complex using antibody and mouse erythrocyte binding assays. Exp. Parasitol. 77: 174-194. [ Links ]41. Sim B. K. (1998). Delineation of functional regions on
Plasmodium falciparum EBA – 175 by antibodies eluted from immune complexes. Mol. Biochem. Parasitol. 95: 183-192. [ Links ]42. Smith P., Krohn R., Hermanson G., Mallia A. K., Gartner F. H., Provenzano M. D., et al. (1985). Measurement of protein using Bicinchoninic Acid. Anal. Biochem. 150(1): 76-85. Erratum in: Anal. Biochem. (1987). 163:
279. [ Links ]43. Stevenson M. M. & Ridley E. M. (2004). Innate immunity to malaria.
Nature Rev. Immunol. 4: 169 -180. [ Links ]44. Tami-Hirsch A. (1999). Malaria among Yanomami and Yekuana ethnic groups of the Venezuela Amazon. Epidemiology, risk factors and genetic characterisation of Plasmodium falciparum. PhD. London School of Hygiene and Tropical Medicine.
London. [ Links ]45. Tan E. M., Feltkamp T. E. W., Smolen J. S., Butcher B., Dawkins R., Fritzler M. J., et al. (1997). Range of antinuclear antibodies in "healthy" individuals.
Artritis Rheum. 40: 1601-1611. [ Links ]46. Taylor R. R, Allen S. J., Greewood B. M. & Riley E. M. (1998). IgG3 antibodies to
Plasmodium falciparum merozoites surface protein 2 (MSPII): Increasing prevalence with age and association with clinical immunity to malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 58: 406-413. [ Links ]47. Towbin H., Staehelin T. & Gordon J. (1979). Electrophoretic transfer of protein from poliacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354. [ Links ]
48. Trager W. & Jensen J. B. (1976). Human malaria parasites in continuous culture. Science. 193:
673 -675. [ Links ]49. Wellems T. E. & Plowe C. V. (2001). Cloroquine–resistant malaria.
J. Infect. Dis. 184: 770 -776. [ Links ]50. White N. (2004). Antimalarial drug resistance (review).
J. Clin. Invest. 113: 1084-1092. [ Links ]51. Wide A., Certad G., Capaldo J., Romero M., Fernández M., Alfonso R.,
et al. (2004). Characterization of humoral immunity and its association with the therapeutic response to chloroquine in P. falciparum infection. Proceedings of the IX European Multicolloqium of Parasitology. Valencia - Spain, July 18-23. [ Links ] ]]>