El dengue es la enfermedad viral más importante transmitida por mosquitos a humanos por su alta morbimortalidad y el potencial de diseminación de su vector Aedes aegypti. Además, la falta de una vacuna y medicamentos antivirales específicos, así como el incremento progresivo de las infecciones secundarias y la hiperendemicidad en diferentes países, hacen de esta enfermedad un problema de salud pública. Existen cuatro serotipos del virus del dengue (DENV), dentro de cada serotipo se han descrito varios genotipos, constituidos a su vez por diferentes linajes o clados. La epidemiología molecular combina los análisis filogenéticos de los DENV detectados en un área geográfica, en un tiempo definido, con la información clínica y epidemiológica disponible. El objetivo de estos estudios es tratar de establecer asociaciones entre genotipos o linajes virales con el origen (ancestros), procedencia geográfica, ruta de transmisión viral, severidad de la enfermedad, grupos poblacionales afectados, y la intensidad y extensión de los brotes epidémicos. La epidemiología molecular ha generado información relevante como la etiología del DENV genotipo Asiático en los casos graves de dengue de la epidemia ocurrida en Venezuela en 1989, y la identificación de cambios nucleotídicos puntuales en el genoma viral asociados a propiedades biológicas fundamentales. En la actualidad se hace necesario realizar análisis exhaustivos del genoma viral completo, conjuntamente con el análisis bioinformático, biológico, clínico y epidemiológico de los cuatro serotipos circulantes en los países endémicos, así como instaurar en los laboratorios adscritos a los sistemas de vigilancia epidemiológica del dengue, la vigilancia molecular para la identificación de genotipos (o linajes) circulantes, lo que contribuiría entre otros aspectos al control efectivo de la enfermedad por DENV.

SUMMARY

Dengue is the most important viral disease transmitted by mosquitoes to humans in tropical and subtropical regions of the world. This is the result of its high morbidity and mortality, the spread potential of the vector Aedes aegypti, the lack of effective vaccines and specific antiviral drugs, the gradual increase in secondary infections and hyperendemicity differences in distinct countries. There are four serotypes of dengue virus which are phylogenetically grouped in genotypes and subdivided in lineages or clades. Molecular epidemiology combines phylogenetic analysis of DENV detected in particular geographic areas within a defined time with the available clinical and epidemiologic information. The objective of these studies is to look for relationships between genotypes or lineages, viral origin, geographical spreading and routes of viral transmission, disease severity, population groups affected, and the intensity, speed and extent of outbreaks. Also, molecular epidemiology has generated relevant information such as the Asian genotype DENV etiology in cases of the severe dengue epidemic in Venezuela in 1989, and the identification of specific nucleotide changes in the viral genome associated with its fundamental biological properties. However, analysis of the complete viral genome, together with bioinformatic, biological, clinical and epidemiological analysis corresponding to the four serotypes circulating in endemic countries should be performed. Molecular surveillance for the identification of genotypes (or strains) circulating should be implemented in the laboratories responsible for the epidemiological surveillance of dengue, which would improve the effective control of DENV.

Key words: Molecular epidemiology, dengue virus, Venezuela.

La infección es transmitida a los humanos fundamentalmente por el mosquito Aedes aegypti y se presenta de forma asintomática, o sintomática como fiebre por dengue (FD), fiebre hemorrágica del dengue (FHD) y/o síndrome de choque por dengue (SCD). Sin embargo, recientemente la Organización Mundial de la Salud reporta una nueva forma de clasificación clínica al establecer cuadros de dengue grave y no grave, éste último a su vez segregado en dos grupos de acuerdo a la presencia o no de signos de alarma (WHO, 2009).

Para el serotipo DENV-1 se ha propuesto la existencia de tres a cinco genotipos. Chu et al. (1989) describieron tres tipos distintos de este serotipo que agrupaban cepas provenientes de Tailandia, Filipinas y el Caribe, mientras que Rico-Hesse (1990) analizó cepas de DENV-1 aisladas de diferentes hospedadores y zonas geográficas para definir cinco grupos genotípicos sobre un valor de divergencia de 6% en la región de unión de los genes que codifican las proteínas E y NS1(E/NS1). Estos fueron: (1) América, África y Sudeste Asiático;(2) Sri Lanka; (3) Japón (1943); (4) Sudeste Asiático, Australia y México; y (5) Taiwán y Tailandia.

Por otra parte, la determinación de la variación en el gen que codifica la proteína E (52 288 nt) en aislados de mosquitos y humanos de DENV-1, colectadas un periodo de más de 50 años alrededor del mundo, permitió la definición de tres grupos genotípicos para DENV-1. El genotipo I conformado por virus aislados entre 1974 y 1978 en Naurú, Polinesia Francesa, Nueva Caledonia, Nuevas Hébridas, Fiji, Tonga, Tailandia, Singapur e Indonesia; el genotipo II constituido por aislados de la Polinesia Francesa y Nueva Caledonia (1988-1989), Islas Comoro (1993), Guinea Francesa, Guadalupe, Puerto Rico, Brasil, Perú, Nicaragua y Cuba y el genotipo III que agrupa aislados de Filipinas (1984) y Tailandia (1971). Esta clasificación sugería que las epidemias por DENV-1 en zonas del Pacífico habían sido causadas por la introducción de nuevas variantes virales, representada en éste caso por las cepas del genotipo II, las cuales habían circulado previamente en Centroamérica y Suramérica demostrando así la diseminación de éste genotipo (Chungue et al., 1995).

Además de la clasificación genotípica, se identificó un proceso de recombinación intragenómica para la cepa S275/90 (Singapur), ya que en la secuencia nucleotídica de la misma se evidenció el producto de la recombinación entre virus provenientes de distintos linajes. El primer linaje correspondiente a una cepa africana aislada en Abidjan (Costa de Marfil) y un segundo linaje que incluyó aislados deDjibouti y Cambodia. De forma particular pudo observarse como las regiones no traducibles (UTR, del inglés Untraslated Regions) ubicadas en los extremos 5´y 3´de la cepa S275/90 correspondían al linaje Djibouti/ Cambodia, mientras que un fragmento localizado a nivel de E/NS1 se mostraba igual al ancestral Abidjan. Por otra parte, aunque las implicaciones precisas relacionadas con los aspectos clínicos y epidemiológicos de este evento fueron desconocidas, no se descartaba el mayor potencial patogénico para recombinantes considerando el aislamiento de la cepa Singapur a partir de un caso severo de dengue. Un hecho que si quedaba claro era la importancia en la selección de la región genómica secuenciada para clasificar genéticamente cualquiera de los serotipos de DENV (Tolou et al., 2001).

En este mismo orden de ideas, la secuenciación nucleotídica del gen E de aislados virales venezolanos y de otras regiones del mundo colectados entre 1994 y 1997, permitió una clasificación diferente a la propuesta por Rico-Hesse en 1990. Los genotipos ahora descritos serían: (I) Hawai, sudeste Asiático, China y este de África; (II) Tailandia; (III) Malasia; (IV) Indonesia, Pacífico Oeste y Australia; y (V) América, Oeste de África y Asia. Este último, circulante en las Américas desde que ocurriera la introducción de DENV-1 en 1977. Así mismo, la estimación de la tasa de evolución para este serotipo indicaba la circulación del mismo en varios lugares del mundo en la primera mitad del siglo XX, lo que sugería que una cepa viral asociada a una pandemia mundial era el único linaje ancestral que diera origen a los genotipos de DENV-1 presentes en Asia, Oceanía y África en los últimos 50 años.

Por otro lado, el análisis a nivel de la secuencia de aminoácidos deducida de las cepas americanas, demostraba ausencia de cambios en los aminoácidos ocurridos en un periodo de 20 años, demostrando evolución de las cepas americanas bajo el modelo de la teoría neutral (Goncálvez et al., 2002), según la cual los cambios que pueden ocurrir en las secuencias nucleotídicas y de aminoácidos son adaptativamente neutras, es decir tienen poco o ningún efecto en la función de la molécula (Kimura, 1983). Bajo este mismo esquema de clasificación, Avilés et al. (2003) secuenciaron el genoma completo de virus circulantes en Paraguay y Argentina durante el año 2000. Los virus correspondieron al genotipo V, el cual se subdividió en dos linajes. El linaje I estrechamente relacionado con aislados brasileños en 1997 y el linaje II asociado a una cepa peruana aislada en 1991 (DEI 0151) lo que hacía presumir diseminación viral a lo largo del tiempo entre países latinos.

Posteriormente, Zhang et al. (2005) publican un reporte donde analizan el proceso evolutivo de DENV-1 colectados en un periodo de más de 30 años mediante el análisis del gen E. El primer hallazgo fue el establecimiento de una clasificación filogenética correspondiente a tres genotipos: (I) Cambodia, China, Taiwán y Tailandia y Djibouti de África del Este; (II) Pacífico y Asia (Australia, Indonesia, Filipinas y Tahití); (III) Asia, África y América Latina. Asimismo se observó como el genotipo I se subdividió en dos linajes, el primero correspondiente a virus aislados durante la década de los 80s y entre 1990-1994, denominados linaje "1980-1994"; mientras que los virus obtenidos durante los 90s, incluyendo aislados posteriores a 1994, conformaron el linaje "1990-2002". En relación a estos grupos se observó el fenómeno denominado reemplazo de linajes debido a que el grupo del linaje "19801994" fue sustituido por el linaje "1990-2002", lo que favorecía la presencia de patrones de diversidad genética intraserotípica variables en el tiempo, es decir persistencia temporal de determinados linajes con posibilidades de desaparecer producto de la interacción entre fuerzas selectivas y estocásticas.

En 2006, Domingo et al. describen un método rápido y sensible para la genotipificación de DENV-1. Los resultados indicaron la clasificación de DENV-1 en los genotipos: América-África (AMAF), Malasia (MAL), Tailandia (THAI), Asia (ASIA) y Pacífico Sur (SP), así mismo dentro del genotipo AMAF se observó la presencia de dos linajes para cepas provenientes de India, el linaje India-1 relacionado con cepas americanas e India-2 agrupado con cepas africanas y del sudeste asiático. Estos resultados sugirieron amplia circulación de cepas pertenecientes al genotipo AMAF, así como la utilidad de la región carboxilo terminal del gen E para la identificación de genotipos de DENV. Posteriormente, la secuenciación del gen de unión C/prM (208–561 nt) de cepas de DENV-1 aisladas durante más de 50 años en India, evidenció el agrupamiento de las cepas dentro de un mismo genotipo denominado III, exceptuando la cepa Delhi 2 (1997) y algunos otros aislados en 1998 que se agruparon con la cepa japonesa Mochizuki (1943).

De igual forma, se observó la presencia de dos linajes que incluyeron cepas aisladas en periodos diferentes, sugiriendo reemplazo de linaje de los aislados virales circulantes en 1997 y 1998 por el linaje de virus aislados entre 2004 y 2007, además de algunos obtenidos en 1998 y 1999, sin que este hecho pudiese asociarse a la gravedad de los casos. Por otra parte, el uso de secuencias parciales demostró una vez más la utilidad de regiones, como E/NS1, para identificar de manera precisa la circulación temprana de genotipos emergentes. Asimismo, de forma reciente la reconstrucción de la historia filogenética de DENV-1 permitió establecer la introducción y tasa de evolución de éste serotipo en Colombia. Tal como había sido reportado previamente para otros países americanos (Camacho et al., 2009; Goncálvez et al., 2002) en este país las cepas se agruparon dentro del genotipo V. Adicionalmente, se observó un marcado proceso de cladogénesis, considerado así por la separación evolutiva de los genotipos en ramas más pequeñas conformando clados, éstos últimos denominados también linajes.

Tal proceso fue observado alrededor de 1992, por la presencia de dos linajes, hecho que ocurrió probablemente por la elevada tasa de evolución (8,58 x 10^-4 sustituciones por sitio, por año) de la región estudiada (fragmento carboxilo terminal del gen E), sin que ello fuese un hallazgo concluyente. El hecho que si resultaba evidentemente claro fue la necesidad de realizar estudios posteriores, que incluyeran la incorporación de metodologías moleculares en el marco de los programas de vigilancia epidemiológica (Méndez et al., 2010). Otro país afectado por la circulación de DENV-1 fue Brasil, donde ocurrió la reemergencia del mismo en 2009 causando una gran epidemia entre 2010 y 2011. Los resultados del estudio filogenético de secuencias del gen E de aislados de DENV-1 permitieron corroborar la clasificación de DENV-1 como genotipo V, tal como había ocurrido en otros países latinoamericanos, sin embargo en esta oportunidad DENV-1 se mostraba segregado en múltiples linajes (I, II y III) lo que evidenciaba una vez más la necesidad de monitorear la diseminación de cepas potencialmente virulentas (dos Santos et al., 2011).

El serotipo 2 del complejo de DENV es uno de los más estudiados, hecho que probablemente se deba a su elevada diseminación, así como a su potencial de causar epidemias asociadas en muchas oportunidades a la presencia de casos graves de la enfermedad. Desde el punto de vista molecular, uno de los reportes que dio inicio a investigaciones relacionadas con la epidemiología molecular de DENV-2 fue el realizado por Rico-Hesse (1990) quienes secuenciaron el fragmento de E/NS1 del mencionado serotipo a partir de virus aislados de diferentes hospedadores y zonas geográficas, lo que permitió sentar bases de estudios posteriores gracias a la región genómica escogida para la secuenciación nucleotídica y a la definición de cinco grupos filogenéticamente distintos. El primero de ellos conformado por aislados del Caribe y Pacífico Sur; el segundo por cepas de Taiwán, Filipinas, la cepa prototipo Nueva Guinea "C" y la antigua cepa Thai; el tercero grupo se constituyó por cepas vietnamitas, jamaiquinas y tailandesas; el cuarto por aislados de Indonesia, Seychelles, Burkina Faso y Sri Lanka y el quinto grupo que solo incluyó aislados de África rural. En el año 2007, Rico-Hesse, quien reportara la clasificación anteriormente mencionada, publicó un árbol filogenético donde definió cuatro genotipos para DENV-2.

En 1995, Thant et al. secuenciaron aislados de DENV-2 provenientes del Noreste de Tailandia haciendo uso de la misma región empleada por Rico Hesse (1990), pero estableciendo una clasificación genotípica ligeramente diferente, dentro de la cual el genotipo I estuvo conformado por aislados del Caribe, Pacífico Sur, América Central y América Latina; el genotipo II por virus Asiáticos y del Pacífico Oeste; el genotipo III conformado por virus asiáticos y del Caribe, el IV constituido por aislados afroasiáticos, y finalmente el grupo V cuyos representantes eran exclusivamente africanos. Las cepas analizadas en éste estudio se agruparon dentro del genotipo II en una relación muy estrecha con la cepa de referencia Nueva Guinea "C". Por otra parte, los aislados tailandeses mostraron variaciones nucleotídicas que permitieron la segregación de dos aislados de FHD (ThNH-28/93 y ThNH-52/93), los cuales presentaron una diferencia nucleotídica respecto al aislado de SCD (ThNH7/93), mientras que el aislado de FD (ThNH-p11/93) mostró seis diferencias nucleotídicas en relación a la cepa causante de SCD. Este hallazgo sugería una correlación entre diferencias genéticas como posibles factores de virulencia y la presentación clínica de la enfermedad, destacando así la complejidad de la patogénesis de DENV y el origen multifactorial de la misma.

En el año siguiente, estos mismos autores (Thant et al. 1996), ampliaron la región de secuenciación de las mismas cepas tailandesas secuenciadas previamente al incluir todos los genes codificantes de las proteínas estructurales y la proteína no estructural NS1. El objetivo del estudio era tratar de identificar con mayor precisión diferencias moleculares que pudieran ser asociadas a factores de virulencia y severidad de la enfermedad. La comparación de las secuencias tailandesas con virus aislados en Puerto Rico (S1) y Jamaica (JAM), así como con la cepa NG"C" permitió una vez más establecer una elevada homología con esta última, asimismo se observó una alta conservación en las proteínas M y C. En otras secuencias de aminoácidos, como prM, se evidenció un único sitio potencial de glicosilación (posición 183-185), seis residuos de cisteína conservados y una sustitución de aminoácidos en la posición 130 de arginina en NG"C", JAM, S1 y ThNH-p11/93 a isoleucina enThNH-7/93,ThNH-28/93 yThNH-52/93, hallazgo que fue implicado en cambios de carácter hidrofílico a hidrofóbico del mencionado residuo de aminoácido, lo que implicaría una sustitución única en cepas causantes de FHD. Los hallazgos moleculares obtenidos demostraron en este caso que la gravedad clínica puede asociarse a variaciones en sus secuencias de nucleótidos y aminoacídicas deducidas, dando lugar a distintos grados de virulencia. De todos modos, los autores sugirieron el análisis de una región genómica de mayor longitud, así como la inclusión de mayor número de aislados.

El estudio pionero en Venezuela fue realizado por Rico-Hesse et al. en el año 1997, cuando también se analizaron cepas de diferentes orígenes geográficos, incluyendo 16 aislados obtenidos de pacientes con FD y/o FHD. El análisis de la región nucleotídica correspondiente a unión E/NS1 mostró idéntica secuencia para algunos virus del mismo país y de igual periodo, en el caso de los virus venezolanos se agruparon en genotipos Americanos y Asiáticos. Específicamente, los aislados del periodo 1990-1995 se distribuyeron entre grupos genotípicos del sudeste asiático, dejando ver un progenitor común que sugirió una ruta de transmisión desde el sudeste de Asia hasta las Américas. Estos hallazgos mostraron gran variabilidad genética de las cepas de DENV2 venezolanas, lo que recordaba las características de transmisión descritas para Tailandia en años anteriores (Trent et al., 1989). Esta investigación mostró la asociación directa entre la introducción de cepas importadas y la gravedad de la enfermedad, y la identificación del sudeste Asiático como fuente de nuevos genotipos virales para las Américas.

En 1997, Rico-Hesse et al., secuencian la región E/NS1 de DENV-2 aislados en el sudeste Asiático y cuatro países americanos (Venezuela, Brasil, Colombia y México). El árbol filogenético permitió evidenciar como virus caribeños y suramericanos aislados antes de 1990, así como virus mexicanos aislados en 1992 correspondían a un mismo grupo filogenético. Las cepas de DENV-2 de Puerto Rico, Colombia, Venezuela y México aisladas en distintos años se asociaron estrechamente al genotipoAmericano representado por la cepa Trinidad/1954, mientras que otros virus suramericanos aislados durante y después de 1990 y en México en 1995 se asociaban con aislados del sudeste Asiático o Jamaica. Este hecho apoyó la idea de que la epidemia cubana de FHD del año 1989, había sido producida por virus provenientes del sudeste asiático, los cuales además causaron brotes en Brasil, Colombia, México y Venezuela.

Esta genotipificación demostraba de forma contundente el origen asiático de los virus causantes de FHD y el subsecuente desplazamiento del genotipo Americano circulante hasta ese momento en la región de las Américas. Adicionalmente, con este estudio quedaba demostrada la situación de hiperendemicidad presente en Venezuela por el elevado número de casos de FD y FHD, así como una variabilidad genética semejante a la grave situación epidemiológica descrita previamente en Tailandia (Trent et al., 1989). En ese mismo orden de ideas, Salas et al. (1998) evidenciaron la endemicidad de los serotipos DENV-1, DENV-2 y DENV-4 en Venezuela y la circulación simultánea en las grandes ciudades del país con predominio de DENV-2. Así mismo, observaron incremento en la gravedad de los casos clínicos producto de la mencionada introducción de una cepa de DENV-2 correspondiente al genotipo Asiático.

Igualmente, Miagostovich et al. (1998) secuenciaron el gen E de DENV-2 aislados entre 1990 y 1995 en diferentes zonas de Brasil observando agrupamiento de los virus autóctonos con cepas asiáticas asociadas previamente con la gravedad de la enfermedad, hecho alarmante debido a que gran parte de la población portaba anticuerpos contra los tipos DENV-1 y DENV-4 lo que la predisponía a formas graves de la enfermedad. De igual manera, se consideraron virus colombianos circulantes antes y después de la aparición de casos hemorrágicos en 1989. Una vez más, empleando la región E/NS1, se observó la presencia de dos genotipos diferentes, uno asociado a cepas nativas americanas aisladas antes de la aparición de FHD y otras correspondientes al genotipo asiático, indicando el desplazamiento de las cepas autóctonas por genotipos agresivos, producto de la importación e introducción de virus que no habían circulado previamente (Méndez et al., 2003).

Otro análisis filogenético de interés fue reportado por Cardosa et al. (2009) donde se demostró el origen selvático de un aislado humano de DENV-2, causante de FHD grado II, cuya secuencia nucleotídica se relacionó con el aislado de un mono en la península de Malasia en 1970. La teoría del reloj molecular sugería que los virus selváticos tenían un ancestro común de aproximadamente 63 años, lo que indicaba circulación de DENV-2 en primates no humanos durante todo ese tiempo en Malasia con el agravante de que esa cepa fue capaz de generar enfermedad grave dando como resultado la reintroducción de virus ancestrales en poblaciones humanas.

Por otro lado, Oliveira et al. (2010) clasificaron aislados brasileños de DENV-2 como genotipo Asiático/Americano, los que a su vez se subdividieron en dos grupos, el linaje I (1990 y 1998) y el linaje II (2007 y 2008), hecho que sugería la circulación temporal de grupos genéticamente distintos producto de la evolución local de DENV-2 o causada por la introducción del linaje II en la zona, el cual además causó enfermedad grave incluyendo deceso de algunos pacientes. Por otra parte, la evolución de DENV-2 en Puerto Rico fue analizada ampliamente en un trabajo en el cual se estudiaron cepas circulantes durante 22 años consecutivos. Entre los hallazgos destacados se mostró un reemplazo de linajes entre 1994 y 1997, periodo en el cual se observó incidencia de DENV-2 autóctonos, así como reintroducciones de DENV-2 foráneos confirmando la necesidad de realizar muestreos sistemáticos y de instaurar sistemas de vigilancia molecular que permitan dilucidar aspectos relacionados con la dinámica de la transmisión por DENV (McElroy et al., 2011).

DENV-3 fue detectado por primera vez en las Américas en 1963 y aislado en 1977 (Pinheiro & Corber, 1997). Este serotipo se consideró ausente hasta el año 1994 cuando se aisló en Nicaragua y Panamá en 1994. Posteriormente (1995-2001) circuló en países de América Central y el Caribe causando brotes de FD con algunos casos severos (Gubler, 2005, Pinheiro & Corber, 1997). En el año 2000, se detectó en países suramericanos (Brasil, Ecuador, Venezuela y Perú) (Kochel et al., 2008; Uzcátegui et al., 2003). Posteriormente, fue causa de epidemias de FHD/SCD en Colombia y Venezuela (Ocazionez et al., 2006) así como en Paraguay, Argentina y Bolivia (2002 y 2007).

Filogenéticamente, ha sido dividido en cuatro genotipos (Chungue et al., 1993; Holmes & Twiddy, 2003; Lanciotti et al., 1994; Messer et al., 2003) aunque Díaz et al. (2006) han incorporado un quinto genotipo. El primero de estos reportes fue realizado por Chungue et al. (1993) quienes secuenciaron fragmentos correspondientes a la región 5´del gen E con el fin de genotipificar y a su vez analizar la relación genética y la patogenicidad de cepas de DENV-3. Considerando un valor de 6% de divergencia dentro de la región, tal como se había reportado previamente para DENV-2 (Rico-Hesse, 1990), los resultados indicaron la presencia de cuatro grupos filogenéticos. El primer grupo se conformó por aislados del Pacífico Sur (1988-1992), Singapur (1973) e Indonesia (1973 a 1991); el segundo comprendía virus asiáticos (1956-1989) incluyendo la cepa de referencia H-87; el tercero se conformó por un aislado tailandés (1971) y finalmente el cuarto grupo constituido por cepas de la Polinesia Francesa (1964-1969) y Puerto Rico (1963). Esta clasificación filogenética evidenció estrechas relaciones entre aislados recientes y otros más lejanos, como fue el caso de las cepas del Pacífico Sur (por ejemplo: Nueva Caledonia/1988, Polinesia Francesa/1992), que se agruparon con virus más antiguos (Singapur/1973, Indonesia/1973/1974).

Otro estudio de interés fue realizado por Peyrefitte et al. (2003) para caracterizar genéticamente aislados de DENV-3 circulantes en Martinica en 1999-2001, una región que no había padecido infecciones por DENV-3 en los últimos 20 años. La comparación nucleotídica de los genes prM/M y parte de E mostró un alto nivel de identidad entre las cepas de Martinica y Sri Lanka logrando agruparlas como genotipo III, el cual incluía además aislados provenientes de India, Samoa, Mozambique, Brasil, Guatemala y México. Estas observaciones indicaban, una vez más, que el ancestro común de las cepas circulantes en las Américas y el Caribe tenía su origen en el sudeste Asiático, tal como había sido demostrado previamente (Messer et al., 2003; Usuku et al., 2001).

Otro estudio que analizó cepas americanas correspondió al realizado por Uzcátegui et al. (2003), quienes a través de la secuenciación del gen de E de aislados colectados en 2000 y 2001, revelaron la asociación de los mismos con aislados de DENV-3 circulantes en países como Panamá y Nicaragua en 1994, mostrando nuevamente la introducción en la región americana del genotipo III a partir de Sri Lanka e India. Adicionalmente, la introducción de éste genotipo en tierras colombianas entre 2001 y 2007 desde Venezuela, Ecuador y Perú fue demostrado mediante el análisis filogenético del gen E (Villabona-Arenas et al., 2009).

En Tailandia, el análisis del proceso evolutivo del gen E de cepas de DENV-3 colectadas en un periodo de más de 30 años permitió su clasificación como genotipo II lo que evidenciaba principalmente una prolongada circulación viral en esa zona. Esta clasificación fue lograda luego que los autores identificaran cuatro genotipos virales, específicamente el I con virus del Sudeste de Asia y el Pacífico; genotipo II conformado por virus de Malasya, Myanmar y Tailandia; genotipo III con aislados de Asia (Sri Lanka, India), el Pacífico (Samoa), y América Latina (Brasil, Martinica, México y Venezuela); y el genotipo IV que agrupaba virus de Puerto Rico considerados para ese momento extintos por la falta de aislamiento (60s y 70s), así mismo virus ancestrales como los de Filipinas (1956) y Tailandia (1962) no pudieron ser clasificados (Zhang et al., 2005).

El análisis filogenético de DENV-3 aislados en las Américas reveló tres linajes (A, B y C) dentro del genotipo III. El linaje A compuesto en su totalidad por cepas venezolanas, el linaje B por aislados de Martinica, Brasil, Bolivia, Paraguay y el linaje C que agrupó virus ecuatorianos y peruanos. Esta segregación sugirió un alto nivel de variación genética que destacaba la necesidad de caracterizar DENV-3 circulantes en la región de las Américas (Ramírez et al., 2010). Posteriormente, Schmidt et al. (2011) analizaron la distribución espacial y temporal de DENV-3 aislados en dos brotes ocurridos de forma consecutiva en Venezuela (2001 y 2007-2008), así como secuencias de DENV-3 asiáticas y americanas. Los virus evaluados en este estudio fueron clasificados como genotipo III, lo que sugirió un predominio de este genotipo y su asociación a un elevado proceso de adaptación que permitiría su persistencia dentro de una subpoblación de especies.

Por otra parte, el análisis de las variaciones en las secuencias de las regiones E y NS5 evidenciaron sustituciones aminoacídicas relacionadas con diferentes eventos epidémicos en Venezuela. En relación a este hecho, los autores pudieron detectar diferencias entre secuencias, específicamente en aislados del brote venezolano de 2001 se observó un residuo de glicina en la posición 374, mientras que en las secuencias del brote 2007-2008 se presentó en esa misma posición un residuo de ácido glutámico, diferencias que podrían asociarse a procesos de patogénesis viral cuando son evaluadas en determinados contextos epidemiológicos. Los resultados sugirieron la necesidad de seguir analizando patrones de diversidad genética de DENV en futuras investigaciones con el fin de detectar características de protección y eficacia de vacunas asociadas al estudio de determinados aislados virales.

Desde que este serotipo se introdujo en el hemisferio occidental en 1981, ha estado circulado de forma contínua en el Caribe (Bennett et al., 2003) y al norte de Suramérica, con escasas evidencias de diseminación y asociación a casos de FHD/SCD (Pinheiro & Nelson, 1997). La variación entre cepas de DENV-4 fue reportada en 1986 por Henchal et al., quienes diferenciaron aislados caribeños de la cepa prototipo H-241 (Filipinas/1956). Posteriormente, aislados de DENV-4 se agruparon en tan solo un genotipo asociado a epidemias de FD (Lanciotti et al., 1994).

Así mismo, Chungue et al. (1995) determinaron la variación genética de DENV-4 obtenidos durante más de 33 años mediante el análisis filogenético de secuencias nucleotídicas de la región 5´ terminal del gen E, lo que permitió identificar solo un genotipo en el mundo, lo que en ese momento se asoció con propiedades biológicas, tales como las bajas tasas de replicación descritas en hospedadores humanos y a cuadros clínicos benignos. Sin embargo, cuando Lanciotti et al. (1997) realizaron el análisis de la región completa del gen E, demostraron la existencia de dos genotipos para DENV-4, el genotipo I que incorporaba cepas de Tailandia, Sri Lanka y Filipinas (incluyendo la cepa prototipo H-241) y el genotipo II conformado por virus provenientes de Indonesia, Nueva Caledonia, Tahití, Caribe y Suramérica.

En lo que se refiere a los posibles lugares de origen y diseminación de los DENV-4 (Genotipo II) circulantes en las Américas, el estudio reportado por Villabona-Arenas et al. (2011) corrobora teorías previas que indicaban asociación entre virus del Pacífico y aislados caribeños (Henchal et al., 1986), que a su vez se diseminaron hacia países americanos, tales como Colombia, Ecuador, Guinea Francesa, Perú, Surinam y Venezuela (Forshey et al., 2009). De forma reciente (Naveca et al., 2012) reportan la secuencia de genoma completo de DENV-4 (Br246RR/10) obtenido a partir de un paciente con FD en Boa Vista (Brasil), el resultado obtenido permitió la clasificación de este DENV-4 como el clásico genotipo II, cuya historia de circulación en el Caribe y países suramericanos está bien documentada (Forshey et al. 2009; Lanciotti et al.; 1997; Villabona-Arenas et al., 2011), incluyendo regiones como la Isla de Pascua (Chile) donde por primera vez se reportó la introducción de DENV-4 (Genotipo II) (Fernández et al., 2011) y Honduras (Tang et al., 2011).

Esta revisión destaca la importancia que representa la epidemiología molecular en la identificación de los distintos genotipos virales, y su asociación con la situación epidemiológica particular de cada región. De igual forma, se observó la determinación del origen viral, introducción en determinadas zonas geográficas y el impacto epidémico de los diferentes genotipos de DENV. Una perspectiva de gran interés en relación a los estudios de epidemiología molecular de DENV, es la posibilidad de un mayor alcance como por ejemplo los estudios de propiedades biológicas asociadas a los genotipos circulantes, considerando la asociación de los mismos a características muy específicas, como podría ser la presentación clínica de la enfermedad. Asimismo, de gran impacto epidemiológico sería también la incorporación de herramientas moleculares en el marco de los sistemas de vigilancia epidemiológica de las regiones afectadas por la circulación de DENV.

Los Autores declaramos no tener ningún conflicto de intereses.

1. Avilés G, Meissner R, Mantovani R & Jeor S St. (2003). Complete coding sequences of dengue-1 viruses from Paraguay and Argentina. Virus Res. 98: 75-82.         [ Links ]

2. Bennett S., Holmes E., Chirivella M., Rodriguez D., Beltran M., Vorndam V., et al. (2003). Selection-Driven Evolution of Emergent Dengue Virus. Mol. Biolo. Evol. 20: 1650-58.         [ Links ]

3. Camacho D. E., Álvarez M., Soler M., de Quintana M., Chiarello A., Sierra G., et al. (2003). Diagnóstico de laboratorio de infecciones por el virus dengue en el Estado Aragua; Venezuela: Octubre 1997-Diciembre 1998. Invest. Clín. 44: 91.         [ Links ]

4. Camacho D. E., Ferrer E., Rodríguez-Henríquez F., Sierra G., Bosch I., Schmidt D., et al. (2009). Genotipificación de virus dengue tipo 1 circulantes en el estado Aragua durante el período 1997-2007. Salus. 1: 73.         [ Links ]

5. Cardosa J., Ooi M. H., Tio P. H., Perera D., Holmes E. C., Khatijar B. & Manap Z. A. (2009). Dengue Virus serotype 2 from a sylvatic lineage isolated from a patient with Dengue Hemorrhagic Fever. PLoSNegl. Trop. Dis. 3(4): e423[Revista en línea]. Disponible en: http://www.plosntds.org [Consulta: 2010, Marzo 16].         [ Links ]

6. Chambers H., Galler R. & Rice C. (1990). Flavivirus genome,organization, expression, & replication. Ann. Rev. Microbiol. 44: 649-88.         [ Links ]

7. Chu M., O´Rourke E. & Trent D. (1989). Genetic Relatedness among Structural Protein Genes of Dengue 1 Virus Strains. J. Gen. Virol. 70: 17011712.         [ Links ]

8. Chungue E., Cassar O., Drouet M. T., Guzmán M. G., Laille M., Rosen L. & Deubel V. (1995). Molecular epidemiology of dengue-1 y dengue-4 viruses. J. Gen. Virol.76:1877.         [ Links ]

9. Chungue E., Deubel V., Cassar O., Laille M. & Martin M. V. (1993). Molecular epidemiology of dengue 3 viruses and genetic relatedness among dengue 3 strains isolated from patients with mild or severe form of dengue fever in French Polynesia. J Gen. Virol. 74: 2765-70.         [ Links ]

10. Díaz F. J., Black W. C., Farfan-Ale J. A., Lorono-Pinto M. A., Olson K. E. & Beaty B. J. (2006). Dengue virus circulation and evolution in Mexico: a phylogenetic perspective. Arch. Med. Res. 37: 760-773.         [ Links ]

11. Domingo C., Palacios G., Jabado O., Reyes N., Niedrig M., Gascón J., et al. (2006). Use of a short fragment of the C-terminal E gene for detection and characterization of two new lineages of dengue virus 1 in India. J. Clin. Microbiol. 44: 1519-1529.         [ Links ]

12. Dos Santos F., Nogueira F., Castro M., Nunes P., de Filippis A., Faria N., et al. (2011). First report of multiple lineages of dengue virus type 1 in Rio de Janeiro, Brazil. Virol. J. 8: 387.         [ Links ]

13. Fernández J., Vera L., Tognarelli J., Fasce R., Araya P., Villagra E., et al. (2011). Detection of dengue virus type 4 in Eastern Island, Chile. Arch. Virol. 156: 1865-1868.         [ Links ]

14. Forshey B., Morrison A., Cruz C., Rocha C., Vilcarromero S., Guevara C., et al. (2009). Dengue Virus Serotype 4, Northeastern Peru, 2008. Emerg. Infect. Dis. 15.         [ Links ]

15. Goncálvez A., Escalante A., Pujol F., Ludert J., Tovar D., Salas R. & Liprandi F. (2002). Diversity and evolution of the envelope gene of Dengue virus type 1. Virology. 303: 110.         [ Links ]

16. Gubler D. J., Reed D., Rosen L. & Hitchcock J. R. Jr. (1978). Epidemiologic, clinical and virologic observations on dengue in the Kingdom of Tonga. Am. J. Trop. Med. Hyg. 27:581.         [ Links ]

17. Gubler D. & Clark G. (1995). Dengue/dengue hemorrhagic fever: the emergence of a global health problem. Emerg. Infect. Dis. 1: 55-7.         [ Links ]

18. Gubler D. (2005). The emergence of epidemic dengue fever and dengue hemorrhagic fever in the Americas: a case of failed public health policy. Rev Panam Salud Pública. 17: 221-224.         [ Links ]

19. Guzmán M. G. & Kourí G. (2002). Dengue: an update. Lancet. 2: 33-42.         [ Links ]

20. Halstead S. B. (2003). Neutralization and antibody-dependent enhancement of dengue viruses. Adv. Virus Res. 60: 421-467.         [ Links ]

21. Henchal E. A. & Putnak J. R. (1990). The dengue viruses. Clin. Microbiol. Rev. 3: 376.        [ Links ]

22. Henchal E. A., Repik P. M., McCown J. M. & Brandt W. E. (1986). Identification of an antigenic and genetic variant of dengue-4 virus from the Caribbean. Am. J. Trop. Med. Hyg. 35: 393-400.         [ Links ]

23. Holmes E. C. & Twiddy S. S. (2003). The origin, emergence and evolutionary genetics of dengue virus. Infect. Genet. Evol. 3: 19.         [ Links ]

24. Kimura M. (1983). The Neutral Theory of Molecular Evolution. Cambridge University Press, Cambridge, U.K.         [ Links ]

25. Kochel T., Aguilar P., Felices V., Comach G., Cruz C., Alava A., et al. (2008). Molecular epidemiology of dengue virus type 3 in Northern South America: 2000-2005. Infect Genet Evol. 8:682-688.         [ Links ]

26. Kukreti H., Kumar P., Parida M., Chaudhary A., Saxena P., Rautela R. S., et al.(2009). Phylogenetic studies reveal existence of multiple lineages of a single genotype of DENV-1 (genotype III) in India during 1956-2007. J. Virol. 6: 1.         [ Links ]

27. Lanciotti R. S., Lewis J. G., Gubler D. J. & Trent D. W. (1994). DW: Molecular evolution and epidemiology of dengue-3 viruses. J Gen Virol. 75: 65-75.         [ Links ]

28. Lanciotti R. S., Gubler D. J. & Trent D. W. (1997). Molecular evolution and phylogeny of dengue-4 viruses. J Gen Virol.78: 2279-86.         [ Links ]

29. McElroy K., Santiago G., Lennon N., Birren B., Henn M. & Muñoz-Jordán J. (2011). Endurance, Refuge, and Reemergence of Dengue Virus Type 2, Puerto Rico, 1986-2007. Emerg. Infect. Dis. 17: 64-71.         [ Links ]

30. Méndez J., Bernal M. del P., de Calvache D. & Boshell J. (2003). Genotipificación y análisis filogenético de cepas colombianas del virus Dengue tipo 2. NOVA. 1: 1794.         [ Links ]

31. Mendez J., Usme-Ciro J., Domingo C., Rey G., Sanchez J., Tenorio A. & Gallego-Gomez J. (2010). Phylogenetic history demonstrates two different lineages of dengue type 1 virus in Colombia. Virol. J. 7: 226.         [ Links ]

32. Messer W. B., Gubler D. J., Harris E., Sivananthan K. & de Silva A. M. (2003). Emergence and global spread of a dengue serotype 3, subtype III virus. Emerg. Infect. Dis. 9: 800-809.         [ Links ]

33. Miagostovich M., Nogueira R., Schatzmayr H. & Lanciotti R. (1998). Molecular Epidemiology of Den-2 Virus in Brazil.Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 93: 625.         [ Links ]

34. Naveca F., Souza V., Silva G., Maito R., Granja F., Siqueira T. & Acosta P. (2012). Complete Genome Sequence of a Dengue Virus Serotype 4 Strain Isolated in Roraima, Brazil. J. Virol. 86: 1896-1898.         [ Links ]

35. Ocazionez R. E., Cortes F. M., Villar L. A. & Gómez S. Y. (2006). Temporal distribution of dengue virus serotypes in Colombian endemic area and dengue incidence. Reintroduction of dengue-3 associated to mild febrile illness and primary infection. Mem Inst. Oswaldo Cruz. 101:725-731.         [ Links ]

36. Oliveira M. F., Galvão J. M., Costa Ferreira Jr., Fernandes D., Bonfi D., Barreto F., et al. (2010). Two Lineages of Dengue Virus Type 2, Brazil. Emerg. Infect. Dis. 16:576-578.         [ Links ]

37. PAHO (1990). Dengue hemorrhagic fever in Venezuela. Epidemiol. Bull. 11: 7-9.         [ Links ]

38. Peyrefitte C., Couissinier-Paris P., Mercier-Perennec V., Bessaud M., Martial J., Kenane N., et al. ( 2003). Genetic characterization of newly reintroduced dengue virus type 3 in Martinique (French West Indies). J. Clin. Microbiol. 41:5195.         [ Links ]

39. Pinheiro F. & Nelson M. (1997). Re-emergence of dengue and emergence of dengue haemorrhagic fever in the Americas. Dengue Bull. 21: 16-24.         [ Links ]

40. Pinheiro F. P. & Corber S. J. (1997). Global situation of dengue and dengue hemorrhagic fever, and its emergence in the Americas. World Health Stat Q. 50: 161-169.         [ Links ]

41. Ramírez A., Fajardo A., Moros Z., Gerder M., Caraballo G., Camacho D., et al. (2010). Evolution of Dengue Virus Type 3 Genotype III in Venezuela: Diversification, Rates and Population Dynamics. Virol. J. 7: 329.        [ Links ]

42. Rico-Hesse R. (1990). Molecular evolution and distribution of dengue viruses type 1 and 2 in nature. Virology. 174: 479.         [ Links ]

43. Rico-Hesse R., Harrison L. M., Salas R. A., Tovar D., Nisalak A., Ramos C., et al. (1997). Origins of dengue type 2 viruses associated with increased pathogenicity in the Americas. Virology. 230:244.         [ Links ]

44. Rico-Hesse R. (2007). Dengue Virus Evolution and Virulence Models. Clin Infect Dis. 44: 1462–1466.         [ Links ]

45. Salas R.A., Tovar D., Barreto A., de Miller E., Leitmeyer K. & Rico-Hesse R. (1998). Serotypes and genotypes of dengue virus circulating in Venezuela, 1990-1997. Acta Cient. Venez. (Suppl 49): 33.         [ Links ]

46. Schmidt D., Pickett B., Camacho D., Comach G., Xhaja K., Lennon N., et al. (2011). A phylogenetic analysis using full-length viral genomes of South American dengue serotype 3 in consecutive Venezuelan outbreaks reveals novel NS5 mutation. Infect. Genet. Evol. 11: 2011-2019.         [ Links ]

47. Tang Y., Quintana M., Zhang C., Li T., Sauls D., Putnak R., et al. (2011). Letter to the editor: molecular genotyping of Dengue Virus Types 2 and 4 from Guatemalan and Honduran Epidemics of 2007 using the envelope glycoprotein gene. Virus Genes. 42: 200-203.         [ Links ]

48. Thant K, Morita K & Igarashi A. (1995). Sequences of E/NS1 gene junction from four dengue-2 viruses of Northeastern Thailand and their evolutionary relationships with other dengue-2 viruses. Microbiol. Immunol. 39: 581.         [ Links ]

49. Thant K., Morita K. & Igarashi A. (1996). Detection of the disease severity.related molecular differences among New Thai dengue-2 isolates in 1993, based on their structural proteins and major non-structural protein NS1 sequences. Microbiol. Immunol. 40: 205.         [ Links ]

50. Tolou H. J. G., Couissinier-Paris P., Durand J. P., Mercier V., de Pina J. J., de Micco P., et al. (2001). Evidence for recombination in natural populations of dengue virus type 1 based on the analysis of complete genome sequences. J Gen. Virol. 82: 1283-90.         [ Links ]

51. Trent D. W., Grant J. A., Monath T. P., Manske C. L., Corina M. & Fox G. E. (1989). Genetic variation and microevolution of dengue 2 virus en Southeast Asia. Virology. 172: 523.         [ Links ]

52. Usuku S., Castillo L., Sugimoto C., Noguchi Y., Yogo Y. & Kobayashi N. (2001). Phylogenetic analysis of dengue-3 viruses prevalent in Guatemala during 1996-1998. Arch. Virol. 146: 1381.        [ Links ]

53. Uzcátegui N. Y., Camacho D., Comach G., Cuello de Uzcátegui R., Holmes E. C. & Gould E. (2001). Molecular epidemiology of dengue type 2 virus in Venezuela: evidence for in situvirus evolution and recombination. J. Gen. Virol. 82: 2945.         [ Links ]

54. Uzcátegui N. Y., Comach G., Camacho D., Salcedo M., Cabello de Quintana M., Jiménez M., et al. (2003). Molecular epidemiology of dengue virus type 3 in Venezuela. J. Gen. Virol. 84:1569         [ Links ]

55. Villabona-Arenas C., Miranda-Esquivel D. & Ocazionez Jimenez R. (2009). Phylogeny of dengue virus type 3 circulating in Colombia between 2001 and 2007. Trop Med Int Health.14:1241-50.         [ Links ]

56. WHO (2008). Guidelines for the Clinical Evaluation of Dengue Vaccines in Endemic Areas. 2008. Documento en línea: www.who.int/vaccinesdocuments/ (Consultado: 2009, Septiembre 07).         [ Links ]

57. WHO (2009). Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. New edition. France.         [ Links ]

58. Zhang C., Mammen M., Chinnawirotpisan P., Klungthong C., Rodpradit P., Monkongdee P., et al. (2005). Clade replacements in dengue virus serotypes 1 and 3 are associated with changing serotype prevalence. J. Virol. 79: 15123.         [ Links ] ]]> 1 2003 98 75-82 2 2003 20 1650-58 3 2003 44 91 4 2009 1 73 5 2009 3 4 4 e423 6 1990 44 649-88 7 1989 70 17011712 8 1995 Virol.76 1877 9 1993 74 2765-70 10 2006 37 760-773 11 2006 44 1519-1529 12 2011 8 387 13 2011 156 1865-1868 14 2009 15 15 2002 303 110 16 1978 27 581 17 1995 1 55-7 18 2005 17 221-224 19 2002 2 33-42 20 2003 60 421-467 21 1990 3 376 22 1986 35 393-400 23 2003 3 19 24 1983 25 2008 8 682-688 26 2009 6 1 27 1994 75 65-75 28 1997 Virol.78 2279-86 29 2011 17 64-71 30 2003 1 1794 31 2010 7 226 32 2003 9 800-809 33 1998 93 625 34 2012 86 1896-1898 35 2006 101 725-731 36 2010 16 576-578 37 PAHO 1990 11 7-9 38 2003 41 5195 39 1997 21 16-24 40 1997 50 161-169 41 2010 7 329 42 1990 174 479 43 1997 230 244 44 2007 44 1462-1466 45 1998 ^s49 ^s49 49 33 46 2011 11 2011-2019 47 2011 42 200-203 48 1995 39 581 49 1996 40 205 50 2001 82 1283-90 51 1989 172 523 52 2001 146 1381 53 2001 82 2945 54 2003 84 1569 55 2009 14 1241-50 56 WHO 2008 57 WHO 2009 58 2005 79 15123