Pruebas de campo sobre la eficacia y persistencia de tres formulaciones de
Bacillus sphaericus contra larvas de Anopheles aquasalis Curry en manglares del municipio Mariño, estado Sucre, Venezuela.Field trials on the efficacy and persistence of three formulations of Bacillus sphaericus against larvae of Anopheles aquasalis
Curry in mangroves of Mariño municipality, Sucre state, Venezuela.Jesús Berti Moser¹, Melfran Herrera², Julio González Rivas¹, Nelson Puentes², Rafael Caraballo² & Jesús Valero¹
1 Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios "Dr. Arnoldo Gabaldon". Dirección de Investigación. Maracay, estado Aragua, Venezuela.
2 Servicio de Endemias Rurales, Gerencia de Malariología y Saneamiento Ambiental. Carúpano, estado Sucre, Venezuela.
*Autor de correspondencia: jbertimoser@yahoo.com
RESUMEN
Anopheles aquasalis Curry es el principal vector de malaria de la región nororiental de Venezuela. Un estudio sobre el control biológico de la especie fue realizado en Rio Chiquito Abajo, municipio Mariño, estado Sucre. El objetivo del mismo fue evaluar en condiciones de campo, la eficacia y persistencia de tres formulaciones comerciales de Bacillus sphaericus contra larvas de An. aquasalis. Los criaderos típicos de esta especie son humedales de agua dulce con vegetación herbácea emergente y manglares salobres estacionales con vegetación arbórea (Avicennia germinans). El hábitat seleccionado para realizar los bioensayos fue un típico manglar de Avicennia germinans. En este criadero de An. aquasalis, se evaluaron estas formulaciones de B. sphaericus: dos formulaciones liquidas (GRISELESF-Cepa 2362 y VECTOLEX
® WGD-51,2%) y una formulación granulada (VECTOLEX® CG-7,5%). En cada prueba, se aplicó un diseño completamente al azar con 4 repeticiones por tratamiento y por control. Los resultados fueron expresados como porcentajes de reducción larval, después de aplicar la formula de Mulla. De acuerdo con los resultados obtenidos, la formulación granulada VECTOLEX® CG-7,5% con dosis de 30 Kg/ha (3 g/m²), resultó ser altamente eficaz hasta 7 días post-aplicación con 92,3% de reducción, la misma fue menos efectiva después de 14 días post-aplicación con 74,8%. Al aumentar la dosis a 40 Kg/ha (4 g/m²), la eficacia después de 7 días de la aplicación fue de 93,9 %, es decir muy similar que a la dosis anterior. Ambas dosis presentaron la misma eficacia contra larvas de An. aquasalis. Por otra parte, la otra formulación VECTOLEX® WGD-51,2%, con la dosis de 2,0 Kg/ ha, resultó ser eficaz hasta 8 días post-aplicación con 85,2% de reducción larval; la misma produjo 13,3% de reducción a los 16 días post-tratamiento; sin embargo, esta formulación con la dosis de 2,5 Kg/ha, fue altamente eficaz hasta 16 días postaplicación con más de 90% de reducción larval. En cambio, en el mismo manglar el producto GRISELESF fue menos eficaz tanto a 2,0 Kg/ha como a 2,5 Kg/ha, obteniéndose porcentajes de reducción muy bajos a los 8 y 16 días post-aplicación.Palabras clave: Bacillus sphaericus, Anopheles, control biológico, control microbiano, larvas, malaria, manglar salobre, vectores, Sucre, Venezuela.
]]> SUMMARYAnopheles aquasalis Curry is the main vector of malaria in northeastern Venezuela. A study of biological control of An. aquasalis larvae was carried out in Río Chiquito Abajo, Sucre State, Venezuela. The objective of this study was to evaluate effectivity and persistence of three formulations of Bacillus sphaericus against larval populations of An. aquasalis. The main breeding-sites of An. aquasalis are seasonal brackish mangrove with Avicennia germinans and semi-permanent freshwater wetlands with herbaceous emergent vegetation. A typical seasonal brackish mangrove with Avicennia germinans was selected. In these breeding-sites of An. aquasalis, three commercial formulations of B. sphaericus: VECTOLEX® CG-7.5%, VECTOLEX® WGD-51.2% and GRISELESF were evaluated in field trials. According to the results obtained VECTOLEX® CG-7.5% was effective against An. aquasalis larvae during 7 days post-treatment at rates not lower than 30 Kg/ha (3 g/m²), producing a larval reduction greater than 92.3%. This granular formulation provided very good larval control during 7 days. The two dosages (30 and 40 Kg/ha) had the same efficacy against An. aquasalis larvae. The second commercial formulation VECTOLEX® WGD-51.2% was effective against An. aquasalis larvae at dose of 2.0 Kg/ ha, producing a larval reduction greater than 85 % during 8 days post-treatment, and only 13.3 % larval reduction at 16 days after treatment; but the same formulation with at dose of 2.5 Kg/ha was more effective, producing a larval reduction greater than 90 % during 16 days posttreatment. In the same brackish mangrove, GRISELESF at rates not lower than 2.0 and 2.5 Kg/ha, appears to be less effective against An. aquasalis larvae, producing very low larval reduction at 8 and 16 days post-treatment.
Key words: Bacillus sphaericus, Anopheles, biological control, microbial control, malaria, larvae, brackish mangrove, vectors, Sucre, Venezuela.
Recibido el 30/01/2012 Aceptado el 24/04/2012
INTRODUCCIÓN
Los problemas asociados al control de la malaria en el estado Sucre, han generado una serie de investigaciones de campo sobre bionomía, ecología y manejo integrado de sus principales vectores (Berti et al., 1993; Zimmerman & Berti, 1994; Berti & Zimmerman, 1998; Grillet et al., 1998; Berti et al., 2002; Zoppi et al., 2002; Berti et al., 2003; Berti & González, 2004; Berti et al., 2004; Berti et al., 2010). El vector principal de malaria en ese estado es Anopheles aquasalis Curry (Zimmerman & Berti, 1994). Durante muchos años las actividades de control de este vector se han basado principalmente en la aplicación espacial de insecticidas contra el adulto (Berti & Zimmerman, 1998). Hasta el presente se han implementado muy pocos programas de control mediante la aplicación de Bacillus sphaericus contra larvas de An. aquasalis. Apesar de sus grandes ventajas ambientales, este producto biológico es poco usado en el país para el control de vectores de la malaria (Berti et al., 2010; Moreno et al., 2010), lo cual es muy preocupante. No obstante, en otros países se conocen muchos trabajos sobre su uso exitoso contra vectores de la malaria (Castro et al., 1996; Groves & Meisch, 1996; Skovmand & Bauduin, 1997; Skovmand & Sanogo, 1999; Karch et al., 1991; Berrocal et al., 2000; Blanco-Castro et al., 2000). En Venezuela, podemos contar actualmente con insecticidas químicos de mayor acción residual para efectuar los rociamientos intradomiciliarios contra la malaria. Estos rociamientos dentro de la casa fueron suspendidos en el estado Sucre desde 1991, debido a la elevada exofilia y exofagia que tenía Anopheles aquasalis (Zimmerman & Berti, 1994; Berti & Zimmerman, 1998). La utilización de agentes de control biológico, tanto depredadores de larvas, como bacterias patógenas a larvas (B. sphaericus), implica tener buen conocimiento sobre la Ecología larvaria del vector (Berti & Zimmerman, 1998; Grillet et al., 1998; Berti et al., 2003; Berti et al., 2010). La utilización de depredadores de larvas como estrategia de control puede combinarse con el uso periódico de B. sphaericus; para lo cual es indispensable la evaluación en el campo de las diferentes formulaciones comerciales existentes en el mercado (GRISELESF, VECTOLEX CG-7,5% y VECTOLEX WGD51.2%). En Venezuela, Berti et al. (2002) evaluaron la persistencia VECTOLEX CG-7,5% a la dosis 30 kg/ ha en pantanos herbáceos no salobres, señalando una reducción larvaria de 76% contra An. aquasalis a los 21 días post-aplicación. En ese mismo ambiente, también fue evaluado VECTOLEX WGD-51,2% a la dosis 2,5 kg/ha, obteniéndose una reducción larval mayor de 80% por 24 días post-aplicación (Berti y González, 2004). En el estado Bolívar, Moreno et al. (2010) evaluaron la persistencia VECTOLEX CG-7,5% también en pantanos herbáceos no salobres, señalando resultados muy prometedores. En ningún hábitat del tipo "manglares salobres" se habían probado estas tres formulaciones. En cambio, el producto GRISELEF-Cepa 2362 (formulación líquida), había sido evaluado en Venezuela contra larvas de Anopheles nuneztovari (Rojas et al., 2001). No obstante, el producto todavía no había sido probado en el país contra larvas de An. aquasalis en manglares. El presente estudio hace referencia a la evaluación de la eficacia y la persistencia de estas tres formulaciones (GRISELESF, VECTOLEX CG-7.5% y VECTOLEX WGD-51.2%) contra larvas de An. aquasalis en un hábitat del tipo manglares salobres, ubicado en la Península de Paria, localidad de Río Chiquito Abajo, municipio Mariño, estado Sucre.
MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio
La Península de Paria, está localizada en la región nororiental de Venezuela (Fig. 1), estado Sucre, entre 10° 27’ 00’’ N; 10° 42’ 32’’ N (latitud) y 62° 32’00’’W; 63° 11’00’’W(longitud) y comprende un área geográfica de 1.078 Km². Al norte de la misma se encuentra el Mar Caribe y al sur el Golfo de Paria (Fig. 1). Entre las características ambientales más resaltantes de la región tenemos: pendientes que varían entre 0 y 5%, precipitación media anual entre 1.200 y 1.700 mm y temperatura media anual entre 27ºC y 29ºC; dependiendo de la altitud del lugar, gran parte del área permanece con suelos muy húmedos o con grandes zonas de acumulación de agua de mar y/o de lluvia, denominadas humedales y que están representadas principalmente por: manglares costeros (estuarios), manglares de cuenca (sin comunicación con el mar), manglares de franja, pantanos arbóreos salobres, pantanos herbáceos de agua dulce (temporales o permanentes), bosques inundados por agua dulce, lagunas, canales de irrigación de cultivos y canales para el manejo de hatos o fincas de ganado vacuno o bufalino (Hato Río de Agua).
Diseño experimental
En ese ambiente se efectuaron las pruebas biológicas de campo, conocidas como bioensayos de eficacia a fin de evaluar tres formulaciones de Bacillus sphaericus contra Anopheles aquasalis. Estas formulaciones son: Vectolex CG-7,5% a la dosis de 30 Kg/ha y de 40 Kg/ha en 2 ensayos sucesivos; Vectolex WGD-51,2 % a la dosis de 2,0 Kg/ha en un tercer ensayo; y Griselesf a la dosis de 2,0 y 2,5 Kg/ha, también en ensayos sucesivos. Y asimismo, en otro bioensayo se comparó la eficacia y persistencia de Vectolex WGD-51.2 % y Griselesf a la misma dosis de 2,5 Kg/ha (en un solo ensayo). La formulación granulada Vectolex CG-7,5% se aplicó de forma manual al criadero, las dos restantes son formulaciones liquidas que fueron aplicadas mediante una motomochila.
En cada uno de los bioensayos, se aplicó el mismo diseño experimental. En ese sentido, se aplicó el diseño estadístico completamente aleatorizado, estableciéndose cuatro parcelas experimentales de igual superficie (5 x 5m = 25 m²); que fueron delimitadas artificialmente (5 m/lado) para la obtención de las unidades experimentales a tratar con las respectivas dosis de cada formulación de Bacillus sphaericus (Kg de producto por hectárea). Se establecieron cuatro parcelas (25 m² cada una) por tratamiento (Kg de producto por hectárea) y también cuatro parcelas como controles (4 repeticiones por tratamiento y 4 por parcela control). La separación entre cada parcela fue de 10 m. En cada bioensayo, una primera evaluación (pre-evaluación), se realizó inmediatamente antes de la aplicación del respectivo producto, las restantes evaluaciones (post-tratamiento) fueron efectuadas periódicamente a los 2, 4, 8, 16, 24, y 34 días post-tratamiento, o a los 2, 4, 7, 14 y 21 días post-aplicación. En la mayoría de los casos a causa de las lluvias fueron suspendidas las evaluaciones correspondientes al día 21 o al día 24. En cada parcela de 25 m², mediante uso del cucharón se tomaron 20 muestras de agua (Fig. 3) de un litro y de cada muestra se colectó, identificó y contó el número total de larvas de tercero y cuarto instar de An. aquasalis. El efecto de cada tratamiento (Kg de producto por hectárea) fue cuantificado, calculando el porcentaje de reducción de larvas de tercero y cuarto estadio; según la fórmula siguiente: % de Reducción = 100-[ [C1/C2 x T2/T1] x 100], desarrollada por Mulla et al. (1971); y donde C1 y C2, representan al promedio de larvas (3er y 4to instar) en el control antes (C1) y después (C2) del tratamiento; y T1 y T2 representan al promedio de larvas (3er y 4to instar) en las parcelas tratadas, antes (T1) y después (T2) del tratamiento. Todos los resultados obtenidos fueron expresados como el porcentaje de reducción de larvas de An. aquasalis de tercer y cuarto instar después de aplicar la formula de Mulla et al. (1971). Se aplicó un análisis de varianza con un solo criterio de clasificación o de una vía; y después un análisis de pruebas de separación de medias de Duncan y/o del mínimo rango significativo con un nivel de significación del 5%; antes de la aplicación del ANOVA, los porcentajes de reducción fueron transformados a arcoseno, a fin de normalizar los datos.
RESULTADOS
Los resultados de los dos primeros bioensayos (formulación Vectolex
® CG-7,5 %) se presentan en las Tablas I y II. El producto, resultó ser altamente eficaz a la dosis de 30 Kg/ha, con un porcentaje de reducción larval de 92,3% hasta 7 días post-aplicación (Tabla I), con esta misma dosis 14 días después de la aplicación presentó una menor eficacia, disminuyendo a 74,8 % de reducción larval (Tabla I). Al aumentar la dosis a 40 Kg/ha (en el segundo bioensayo) la eficacia 7 días después de la aplicación fue de 93,9 %, es decir, muy similar que a la dosis anterior (Tablas I y II); en consecuencia estos resultados sugieren que tanto a 30 como a 40 Kg/ha, este producto resultó ser muy poco persistente en este tipo de ambiente (Tablas I y II). 
Por ultimo, en el bioensayo para comparar la eficacia de GRISELESF (formulación liquida) y VECTOLEX® WDG a una dosis de 2,5 Kg/ha, se observó que el producto GRISELESF, resultó ser mucho menos eficaz que VECTOLEX® WDG. En efecto los porcentajes de reducción larvaria después de 8 y 16 días de la aplicación, fueron de solo 42,82% y 48,06 % respectivamente (Tablas VII, VIII y IX). Este producto, tanto con dosis de 2,0 Kg/ha como de 2,5 Kg/ha, resultó ser mucho menos eficaz. Por el contrario, al aumentar la dosis de VECTOLEX® WDG a 2,5 Kg/ha, se observó que el producto fue altamente eficaz hasta 16 días post-aplicación con 90,2% de reducción larvaria (Tablas VII, VIII y IX). Según estos resultados, las aplicaciones de VECTOLEX® WDG con la dosis de 2,5 Kg/ha, en este ambiente de manglares deberán ser cada 20 días (Tablas VII y IX).
DISCUSIÓN
]]> En Río Chiquito Abajo, las evaluaciones de las dos formulaciones de Vectolex (Vectole® CG7,5% y Vectolex® WGD-51,2%), demuestran que el producto fue poco persistente en ese ambiente (manglar), sobre todo cuando se comparan con resultados previos contra larvas de An. aquasalis en otros tipos de hábitat (Berti et al., 2002; Berti & González, 2004). No obstante, éste fue un resultado esperado, ya que este hábitat de manglares es muy adverso en cuanto a condiciones de mayor salinidad, mayor cantidad de materia orgánica, mayor turbidez, mayor alcalinidad, menor porcentaje de oxigeno y menor densidad de vegetación emergente. Vectolex® CG, resultó ser altamente eficaz (92,3% reducción larval) a la dosis de 30 Kg/ha durante 7 días post aplicación (Tabla I) y con la misma dosis a 14 días de la aplicación fue menos eficaz (74,8 % reducción larval). Al aumentar la dosis a 40 Kg/ha, la efectividad del producto a 7 días de la aplicación fue de 93,9%, muy similar que a la dosis de 30 Kg/ha (Tablas I y II).El municipio Sifontes del estado Bolívar, es la principal área endémica a malaria de Venezuela (Moreno et al., 2010). En este municipio se evaluó la persistencia de Vectolex
® CG 7,5%, en criaderos naturales de Anopheles marajoara Galvao & Damásceno, An. triannulatus (Neiva & Pinto, 1922) y An. braziliensis (Chagas, 1907). Para ello se evaluaron las dosis de 20 y 30 Kg/ha de Vectolex® CG durante 60 y 90 días. Los resultados indicaron que existen diferencias en la persistencia por tipo de criadero y especie de Anopheles. Las tendencias para las tres especies indicaron que el porcentaje de reducción larvaria fue 100% durante la primera semana, luego disminuyó paulatinamente hasta más o menos 40% después de 28 días de la aplicación, para luego recuperarse hasta alrededor de 60% de reducción larvaria a 45 días post-aplicación (Moreno et al., 2010). Este resultado fue más evidente en An. marajoara; mientras que con An. triannulatus su eficacia a 30 Kg/ha fue de alrededor de 80% de reducción durante 90 días; con An. braziliensis la eficacia se mantiene en 100% hasta 14 días post aplicación con ambas concentraciones; para luego caer abruptamente sin recuperación (Moreno et al., 2010). Estos resultados junto con los del estado Sucre (Berti et al., 2002; Berti & González, 2004), confirman que existen diferencias en la persistencia por tipo de criadero y especie de Anopheles y que indudablemente en manglares salobres la persistencia es mucho menor que en humedades de agua dulce.Los manglares son comunidades de plantas leñosas que forman densos bosques en zonas costeras, deltas y estuarios. En estos ecosistemas, las especies de mangle han desarrollado adaptaciones fisiológicas y morfológicas que les permiten adaptarse a un ambiente adverso de altas concentraciones de sales y bajo contenido de oxigeno disuelto. Se caracterizan por presentar alta productividad, jugando un importante rol en el reciclaje de nutrientes, también sirven de hábitat y refugio para una gran diversidad de especies acuáticas, desde crustáceos, insectos e invertebrados acuáticos hasta peces y aves. Este ecosistema es muy sensible a cualquier impacto producto de las actividades humanas; asimismo es muy buen indicador de la calidad ambiental. Es por ello que, el uso de agentes de control biológico como Bacillus sphaericus en manglares costeros de Venezuela, es la mejor alternativa al uso indiscriminado de productos químicos o medidas de ingeniería ambiental contra la malaria.
Con relación a Vectolex
® WDG, es la primera vez que se evalúa sobre alguna especie de Anopheles en manglares costeros de Venezuela, considerándose estos resultados muy prometedores para el programa de control de vectores del país. En ese sentido, con la dosis de 2,0 Kg/ha, el producto resultó ser bastante efectivo (85,12%) hasta por 8 días post-aplicación (Tablas III y V); asimismo a 2,5 Kg/ha fue altamente efectivo (92,2%) hasta por 16 días post-aplicación (Tablas VII, VIII y IX). Según estos resultados, las aplicaciones del producto en este ambiente, deberán ser cada 20 días a la dosis de 2,5 Kg/ha. En Venezuela, este producto solo fue evaluado previamente en humedales del estado Sucre del tipo herbazales o pantanos herbáceos, en los cuales la persistencia fue por 24 días con más de 80% de reducción larval (Berti & González, 2004).Por el contrario, el producto GRISELESF fue mucho menos efectivo que los restantes, obteniéndose valores de reducción larvaria muy bajos que fluctuaron entre 12,44 % y 62,80 % (Tablas IV, V, VI, VIII y IX). Con este producto a la dosis de 2,5 Kg/ha, los porcentajes de reducción larvaria después de 8 y 16 días de la aplicación, fueron de solo 42,82% y 48,06% respectivamente (Tablas VIII y IV). Estos resultados, hacen prácticamente inviable y muy poco rentable el uso periódico de GRISELESF (formulación líquida) contra An. aquasalis en este tipo de ambiente. Por tal razón, se concluye que esta formulación no debe ser utilizada contra larvas de An. aquasalis en hábitats de manglares y tampoco en Venezuela; hasta tanto no se pruebe en otros ambientes y contra otros vectores de malaria que pudieran ser más susceptibles, como Anopheles pseudopunctipennis Theobald, Anopheles darlingi Root, y An. marajoara Galvao & Damásceno. En Venezuela, GRISELESF-Cepa 2362 formulación líquida, ya había sido evaluado contra larvas de Anopheles nuneztovari (Rojas et al., 2001). Según Rojas et al. (2001), se utilizó una formulación líquida de B. sphaericus (GRISELESF-Cepa 2362) contra Anopheles nuneztovari en el estado Mérida, obteniéndose 85% de reducción larvaria por 4 meses. Las causas de estas grandes diferencias pueden tener relación con variables como: la especie de mosquito, tipo de hábitat, altitud, temperatura, tipo de formulación (sólida, líquida, soluble, etc.), densidad de larvas y sus depredadores, parámetros físicos y químicos del criadero, cantidad de materia orgánica, temperatura del agua y precipitación. En el estado Sucre en ambos casos, las variables bióticas y abióticas del hábitat impactarían por igual, tanto a las parcelas tratadas con VECTOLEX
® como en las tratadas con GRISELESF, puesto que en Río Chiquito Abajo, las evaluaciones se efectuaron de forma simultánea en un mismo ensayo para ambas formulaciones (2,5 Kg/ha). Por otro lado, no hay que olvidar que estas formulaciones (GRISELESF-Cepa 2362 y VECTOLEX® WDG) tienen propiedades físicas y químicas distintas. Otro factor muy importante que debería ser bien estudiado en condiciones controladas para cada formulación comercial, es la capacidad de ingestión y la velocidad de ingestión de partículas del producto por parte de larvas de diferentes especies de mosquito; ya que este aspecto puede tener gran influencia al ocasionar un menor o mayor grado de susceptibilidad de cada especie al B. sphaericus. Al respecto, alguna formulación comercial pudiera ser menos "apetecible" para larvas de una u otra especie de mosquito. La presencia de "fago-estimulantes" es un factor que debería ser incluido como tema de investigación por los fabricantes del producto GRISELESF-Cepa 2362 formulación líquida, con el objeto de mejorar la calidad del mismo.CONFLICTOS DE INTERESES
Los Autores manifestamos que no ha habido conflictos de intereses en la realización de este trabajo.
AGRADECIMIENTOS
A todo el personal técnico y obreros de Malariología del estado Sucre, adscritos a las demarcaciones A y B y muy especialmente a la doctora Letty González Rebolledo, Ex Jefe de La Gerencia de Malariología y Saneamiento Ambiental de Carúpano, estado Sucre, debido a su invalorable cooperación y constante apoyo logístico para la realización del trabajo de campo. A Segundo Rosales y Julio Pérez por su amistad y apoyo logístico. Al doctor Russell Gardner por suministrarnos las muestras de los productos formulados de B. sphaericus: VECTOLEX
® CG-7,5% y VECTOLEX® WGD-51,2%. Este trabajo fue financiado por el MPPCTI a través de FONACIT, Proyecto Misión Ciencia 2008000911, Sub-Proyecto Malaria 2008000911-3 y por el Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios "Dr. Arnoldo Gabaldon", Dirección de Investigación.REFERENCIAS
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