Key words: Beauveria bassiana, pathogenicity, toxicity, mice, infectivity.

Uno de los inconvenientes más resaltantes por el empleo indiscriminado de pesticidas de origen químico para el control de plagas, tanto de importancia agrícola como aquellos que poseen relevancia en la salud pública humana y animal, es en relación con los efectos tóxicos potenciales de éstos sobre la salud humana y de los animales, y los integrantes de la Biósfera en general (Cook et al., 1996). En este sentido, se tiene que anualmente ocurren entre 10.000 a 20.000 decesos humanos en el globo terráqueo como consecuencia de su aplicación, guarismos que se pueden incrementar hasta diez veces más, particularmente en los denominados países en desarrollo (Klein-Schwartz & Smith, 1997). Esto ha traído como consecuencia que exista un ímpetu por el uso de un enfoque más biorracional, enmarcado dentro de programas de Manejo de Integrado de Plagas (MIP), empleándose entre otros microorganismos, hongos entomopatógenos.

El hongo mitospórico Beauveria bassiana (Ascomycota: Hipocreales) puede infectar a más de 700 especies de insectos de varios órdenes, aunque se tienen aislamientos altamente específicos, siendo una de las especies entomopatógenas más empleadas a nivel mundial (Goettel & Inglis, 1997). El mismo es un excelente candidato para ser utilizado como bioinsecticida contra los triatominos vectores de la enfermedad de Chagas, debido a que establece la infección por contacto, no debiendo ser ingeridos por estos hemípteros de hábitos hematofágicos estrictos (Luz et al., 2004). Varios investigadores han probado cepas/aislamientos de este hongo con una alta virulencia contra varias especies triatominas de importancia epidemiológica (Luz et al., 2004; Cazorla, 2011).

Aunque generalmente los hongos entomopatógenos se consideran inocuos para los vertebrados y particularmente en mamíferos, no obstante, siempre se debe tener presente que éstos, y particularmente B. bassiana, han sido reportados, aunque en casos aislados, como patógenos oportunistas, tanto en humanos como animales (Zimmermann, 2007).

Desde comienzos del año 2000, el equipo de investigación del presente trabajo ha realizado ensayos tendientes a seleccionar aislamientos autóctonos de especies de hongos entomopatógenos. Dichos aislamientos deben exhibir una elevada patogenicidad y virulencia hacia las especies triatominas de mayor importancia epidemiológica en Venezuela, y adaptados a las condiciones bioecológicas de las área endémicas chagásicas del país. En este sentido, el aislamiento LF14 de B. bassiana, entre otros ensayados, ha demostrado ser, especialmente en formulaciones aceitosas, altamente virulento contra las especies triatominas Rhodnius prolixus y Triatoma maculata, vectores de la enfermedad de Chagas en Venezuela (Cazorla, 2011). Estos hallazgos lo convierten en un potencial patotipo para ser empleado en futuros programas de MIP de la tripanosomiasis americana en zonas endémicas del país, y particularmente en la región falconiana.

A pesar de que en un ensayo previo se demostró su inocuidad cuando se expusieron sus conidias a nivel dérmico en ratones (Acosta et al., 2011), no obstante, es perentorio continuar evaluando su bioseguridad y su impacto ambiental como potencial agente de control biorracional, antes de ser ensayado a nivel de campo. El presente trabajo es la continuidad de estas evaluaciones de patogenicidad/toxicidad de LF14 B. bassiana en modelos animales vertebrados, por lo que se les administró el aislamiento por vía oral a ratones albinos.

Se utilizaron 12 ratones/sexo albinos heterocigotos NMRI (Mus musculus), entre 6 y 7 semanas de edad (i.e. adultos jóvenes) por cada grupo de ensayo, incluyendo los respectivos controles, cuyos pesos no excedieron ≈20% del peso promedio para cada sexo. Los animales se alojaron individualmente en jaulas metabólicas ad hoc que permitieron la recolección de las heces. El alimento (ratarina: Protinal^_®) y el agua se esterilizaron por vapor húmedo en autoclave y suministrados ad libitum. Los animales se mantuvieron en ciclo de luzoscuridad 12-12 horas (Acosta et al., 2011).

En un intento por homogenizar las varianzas, a los porcentajes de germinación se les aplicaron una transformación angular o arcoseno (Sen^-1√x). Se implementaron las pruebas de análisis de Varianza (ANOVA) de una vía y de comparación múltiple para determinar las diferencias entre las medias de los pesos, % de germinación y cantidad de esporulación (conidias/ mL). Los datos se analizaron mediante paquete estadístico MINITAB versión 13.20 (Minitab Inc. 2000).

La supervivencia en todos los grupos fue del 100%. Todos los ratones consumieron ávidamente la ratarina tratada con las conidias del aislamiento LF14 B. bassiana, durante el periodo de exposición a esta dieta experimental.

La evaluación clínica no reveló cambios o alteraciones discernibles en piel, ojos y/o mucosas, sistemas gastro-intestinal, respiratorio, circulatorio, nervioso central y autonómico, en la actividad somatomotora de los animales, exhibiendo comportamientos de tipo activo-normal, considerado característico para la especie (Tapias & Dussan, 2000). El peso promedio corporal en ambos sexos, tanto en los animales expuestos a LF14 B. bassiana como los controles, se incrementó significativamente (P<0,0000) durante los 14 días de observación (Fig. 1). Las diferencias entre sexos tomando en cuenta el total de peso promedio ganado, fueron estadísticamente significativas (F=53,2; g.l.=1; P<0,00001), aunque cuando se hace el análisis comparativo (ANOVA) para cada sexo en particular entre los ratones inoculados y los no expuestos al hongo, las diferencias no fueron significativas (P>0,05).

El estudio micológico (aclaramiento) reveló que en los animales expuestos, tanto machos como hembras, la evacuación de las conidias del aislamiento LF14 B. bassiana ocurrió hasta la primera semana (i.e., 7 días) después de la administración fúngica, reduciéndose las cantidades de las mismas significativamente en el día 7 (P<0,00001) (Tabla I) (Fig. 2). Las diferencias del promedio de conidias/mL registradas entre sexos no resultaron estadísticamente significativas (P>0,05) (Tabla I). Las tasas promedio de germinación de las conidias para ambos sexos fue ≥99% ( ± D.S.=  99,7±0,5; rango: 99-100% en machos; 99,8±0,6; rango: 99-100% en hembras) a las 24 horas de su incubación, siendo estas diferencias estadísticamente no significativas (P>0,05).

Recuperación de conidias de animales (Infectividad)

Cuando se hace el análisis del estudio de infectividad, se aprecia que sólo se logró aislar las conidias del hifomiceto en los intestinos delgado y grueso a los días 3 y 7 de la necropsia (Tabla II).

El examen anatomopatológico correspondiente a la inspección externa y macroscópica de los órganos y cavidades de todos los grupos de estudio, incluyendo los animales controles, no reveló la existencia de alteraciones que pudieran relacionarse con la administración del hongo. El estudio histopatológico no reveló la existencia de alteraciones en los tejidos analizados, no observándose un proceso inflamatorio agudo con infiltrados de macrófagos, neutrófilos y eosinófilos, así como tampoco conidias germinadas ni evidencias fúngicas o histopatológicas de la multiplicación del aislamiento LF14 (Fig. 3).

Contrastando con su requerida y deseada alta virulencia para con el organismo "blanco" o "diana" ("target") (e.g., un insecto plaga en particular) al cual se pretende controlar, los agentes de control biológico pueden presentar potencialmente ciertas características perjudiciales no deseadas, incluyendo i) desplazamiento competitivo de microorganismos no "diana", ii) alergenicidad para humanos y otros vertebrados, iii) toxicidad para organismos no "diana", iv) patogenicidad para organismos no "diana" (Cook et al., 1996). Por ello, antes de ser utilizados "in situ" en el campo, los bioplaguicidas deben pasar por una serie de requerimientos técnicos básicos que aseguren su seguridad para la salud pública y el ambiente, i.e., su bioseguridad.

Los resultados obtenidos en el presente trabajo demostraron que la exposición por vía oral de conidias viables del aislamiento LF14 B. bassiana, aun a concentraciones tan elevadas como 1x10⁸ conidias/mL, no ocasionaron efectos tóxicos ni patogénicos discernibles de consideración sobre los ratones NMRI. Estas observaciones concuerdan con la mayoría de los estudios experimentales hechos con B. bassiana, que muestran que este hifomiceto no es significativamente tóxico ni patogénico para los vertebrados, incluyendo mamíferos y particularmente ratones (Tapias & Dussan, 2000; US-EPA, 2006; Zimmermann, 2007). Similares observaciones se han hecho con otros hongos entomopatógenos, tanto en ratones como en otros vertebrados (Mancebo et al., 2005; Toriello et al., 2006; Zimmermann, 2007).

Cuando se analiza el desarrollo de la dinámica del peso corporal, se tuvo que en todos lo tratamientos, incluyendo los animales inoculados con LF14 B. bassiana, hubo un incremento del peso promedio ganado, lo que coincide con lo que se considera normal en individuos adultos para la especie (Quesada-Domínguez, 1997). Como ya se ha considerado en otras experiencias previas (Acosta et al., 2011), esto lleva a inferir que no existe una acción directa de este hifomiceto (conidias, micelio, metabolitos secundarios) sobre la fisiología de los murinos (Tapias & Dussan, 2000). Otros investigadores han obtenido resultados similares a los del presente estudio, al exponer otros aislamientos/ cepas de B. bassiana, así como también otras especies de hongos entomopatógenos, en ratones (Tapias & Dussan, 2000; Mier et al., 2005; Toriello et al., 2006) y ratas (Mancebo et al., 2005). En relación con las diferencias observadas en los pesos promedio entre ambos sexos, se puede considerar como normal para la especie que los machos por sus características fisiológicas y morfológicas posean un mayor peso corporal (Quesada-Domínguez, 1997; Tapias & Dussan, 2000; Acosta et al., 2011).

El estudio micológico de aclaramiento reveló que las conidias del aislamiento LF14 B. bassiana pudieron recuperarse viables solamente en las heces murinas a los 1-7 días después de su inoculación, lo cual coincide con los hallazgos del estudio de infectividad al detectarse estos propágalos fúngicos a los días 3 y 7 de la necropsia en los intestinos delgado y grueso. El hecho de que se recuperaran las conidias viables en la materia fecal, indica que las mismas se eliminaron rápidamente a través del tracto gastrointestinal; por lo que éste evento asociado al hecho, entre otros posibles factores, de las variaciones de pH del tracto gastrointestinal y la temperatura de 37ºC de los ratones (Quesada-Domínguez, 1997), probablemente afectaron la germinación y desarrollo de las conidias, tal como se ha observado en ratones y ratas, tanto en otras cepas/aislamientos de B. bassiana como de otras especies de hongos entomopatógenos (Tapias & Dussan, 2000; Mier et al., 2005; Mancebo et al., 2005; Toriello et al., 2006; US-EPA, 2006). Es bien documentado que el pH y la temperatura pueden afectar el desarrollo y viabilidad de los hongos entomopatógenos (Padmavathi et al., 2003; Cazorla et al., 2007). Previo al proceso germinativo de los hongos entomopatógenos, en el interior de las conidias se requiere activar una gran variedad de procesos metabólicos, los cuales pueden afectarse por las variaciones de pH, cuyos rangos extremos entre alcalinos y acídicos puede llevar a que se cliven enlaces de hidrógeno de enzimas, bicapa lipídica y del ADN, afectándose la integridad y metabolismo celular (Padmavathi et al., 2003). La solubilidad de los iones metálicos (e.g., Mg, Fe), que son necesarios para el desarrollo y crecimiento de los hongos, puede verse disminuida a ciertos rangos de pH afectando diversas enzimas metabólicas y el proceso de germinación, además de que la permeabilidad celular podría verse afectada por estas variaciones de [H⁺]. Por sólo poner un ejemplo, a pH alcalinos puede existir deficiencias de hierro, calcio, cobre y zinc, y el magnesio y el fosfato forman complejos insolubles, mientras que a pH bajos ambos coexisten en sus formas libres (Griffin, 1994). Los daños a nivel celular que pudieran potencialmente ocasionar las variaciones de temperatura son muy amplios y diversos, incluyendo desnaturalización y desorganización de las membranas, daños a nivel del ADN con la pérdida de bases nitrogenadas y stress oxidativo, disminución del metabolismo con crecimiento limitado y la aparición potencial de mutaciones (Rangel et al., 2005). Cazorla et al. (2007) encontraron In vitro que el aislamiento LF14 B. bassiana presenta tasas de germinación <3% a 35ºC, y a 38ºC prácticamente no germinó. Esto podría llevar a pensar que las conidias de este aislamiento al adquirirse accidentalmente dentro del cuerpo de un vertebrado homeotermo no puedan proliferar, aunque pudieran sobrevivir pocos días. Sin embargo, se han descrito, aunque muy rara vez, en la literatura casos de humanos infectados por Beauveria (Zimmermann, 2007). En este sentido, resulta interesante comentar los hallazgos de Henke et al (2002), quienes reportan el aislamiento de Beauveria en un caso humano que recibió quimioterapia inmunosupresora, pero el cual no creció a 37ºC en medio de cultivo, por lo que estos investigadores sugieren que las infecciones sistémicas por B. bassiana sólo son posibles en pacientes inmunosuprimidos. Como bien lo señala Shimazu (2004), otros hongos oportunistas, e.g., Alternaria, Ulocladium, Fusarium, Sporothrix y Engyodontium, similarmente se han detectado en tejidos profundos de pacientes humanos inmunocomprometidos, y no proliferan a 37ºC en medios de cultivo. Por lo tanto, de estos resultados y comentarios, tanto de los del presente trabajo como de los otros reseñados, se puede sugerir que el límite superior de temperatura para el crecimiento y desarrollo de un hongo hifomiceto "in vitro", puede diferir del requerido "in vivo". Además, se puede inferir que a temperaturas elevadas el hongo no muere inmediatamente, estando como en un "estado quiescente", siendo posible aislarlo de los tejidos humanos (Shimazu, 2004). En el caso de los animales poiquilotermos, cabe la posibilidad de que se encuentren a mayor riesgo, debido a que poseen temperaturas corporales más bajas (Toriello et al., 2006).

La prueba oral de riesgo bio-toxicológico evaluada en el presente trabajo corresponde al Nivel I de la US-EPA, así como también otras similares ensayadas en trabajos previos por vía dérmica e inhalatoria en el modelo ratón NMRI-aislamiento LF14 B. bassiana, en las cuales tampoco se obtuvo infectividad o patogencidad (Acosta et al., 2011; Acosta et al., datos no publicados). Por lo tanto, estos hallazgos avalan el no requerimiento de implementar los siguientes niveles II, III y IV (US-EPA, 1996).

Ala luz del presente protocolo de evaluación de infectividad/patogenicidad/toxicidad, se puede concluir que aún a una elevada concentración administrada oralmenteelaislamientoLF14B.bassianaesseguropara el modelo murino NMRI. A pesar de que se espera que el mismo no sea potencialmente dañino vía alimentaria, no obstante, es recomendable que las personas que manipulen y apliquen (e.g., polvo mojable por aspersión) el producto a nivel de campo en los futuros programas de MIP de los vectores de la enfermedad de Chagas, tengan las precauciones y regulaciones pertinentes, tales como uso de camisas con mangas largas, pantalones largos, guantes impermeables, mascarillas con filtros adecuados, así como la espera de al menos 4 horas para los manipuladores de los insecticidas para entrar a las áreas tratadas (Mier et al., 2005; US-EPA, 1996).

1. Acosta M., Cazorla D., Eduarte G. & Morales P. (2011). Patogenicidad dérmica de un aislamiento autóctono del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana en ratones. Rev. Científ. FCV-LUZ. 21: 477-483.         [ Links ]

2. Cazorla D., Morales P. & Acosta M. (2007). Efectos de gradientes térmicos, salinos y pH sobre la germinación in vitro de un aislado nativo de Beauveria bassiana (bálsamo) Vuillemin, patógeno para Rhodnius prolixus y Triatoma maculata. Rev. Científ. FCV-LUZ. 17: 1-5.         [ Links ]

3. Cazorla D. (2011). El uso de hongos entomopatógenos para el control biorracional de Triatominae, vectores de la enfermedad de Chagas. Avances Cardiol. 31: 333-352.         [ Links ]

4. Cook R., Bruckart W., Coulson J., Goettel M., Humber R., Lumsden R., et al. (1996). Safety of microorganism interided for pest and plant disease control: a framework for scientific evaluation. Biological Control. 7: 333- 351.         [ Links ]

5. FONACIT (2008). Código de Bioética y Bioseguridad. Documento en línea: http://www.fonacit.gov.ve/ documentos/bioética2009. (Consultado: 2007, Octubre 10).         [ Links ]

6. Goettel M. & Inglis G. (1997). Fungi: Hyphomycetes. pp.213-249. En: Manual of techniques in insect pathology. Ed. L. Lacey. Academic Press. San Diego, California, USA.         [ Links ]

7. Griffin D. (1994). Fungal Physiology. 2nd Ed. Wiley-Liss, New York, Estados Unidos de América.         [ Links ]

8. Henke M., De Hoog G., Gross U., Zimmermann G., Kraemer D & Weig M. (2002). Human deep tissue infection with an entomopathogenic Beauveria species. J. Clin. Microbiol. 40: 2698-2702.         [ Links ]

9. Klein-Schwartz W. & Smith G. (1997). Agricultural and horticultural chemical poisoning. Mortality and morbidity in the United States. Ann. Emerg. Med. 29: 232-238.         [ Links ]

10. Luz C., Rocha L., Nery G., Magalhaes B. & Tigano, M. (2004). Activity of oil-formulated Beauveria bassiana against Triatoma sordida in peridomestic areas in Central Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 99: 211-218.         [ Links ]

11. Mancebo A., González F., González B., Riera L., Lugo S. & Bada A. (2005). Evaluación de la patogenicidad en ratas del Paecilomyces lilacinus LPL-01 utilizando vías diferentes de exposición. Rev. Toxicol. 22: 185-190.         [ Links ]

12. Mier T., Olivares-Redonda G., Navarro-Barranco H., Pérez-Mejía A., Lorenzana M., Pérez-Torres A., et al. (2005). Acute oral intragastric pathogenicity and toxicity in mice of Paecilomyces fumosoroseus isolated from whiteflies. Antonie Van Leeuwenhoek. 88: 103-111.         [ Links ]

13. Padmavathi J., Devi K. & Maheswara C. (2003). The optimum and tolerance pH range is correlated to colonial morphology in isolates of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana – a potential biopesticide. World J. Microbiol. Biotech. 19: 469-477.         [ Links ]

14. Quesada-Domínguez A. (1997). Introducción al manejo de los animales de laboratorio: roedores y pequeñas especies. Ed. Universidad Autónoma de Yucatán: Mérida, Yucatán, México.         [ Links ]

15. Rangel D., Braga G., Anderson A. & Roberts D. (2005). Variability inconidial thermotolerance of Metarhizium anisopliae isolates from different geographic origins. J. Invertebr. Pathol. 88: 116-125.         [ Links ]

16. Shimazu M. (2004). Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. App. Entomol. Zool. 39: 469-475.         [ Links ]

17. Tapias S. & Dussán J. (2000). Evaluación del grado de seguridad del hongo Beauveria Bastiana utilizado para el control biológico de insectos plaga. Actual. Biol. 22: 17-27.         [ Links ]

18. Toriello A., Pérez A., Burciaga H., Navarro-Barranco A., Pérez-Mejía M., Lorenzana-Jiménez T., et al. (2006). Lack of acute pathogenicity and toxicity in mice of an isolate of Metarhizium anisopliae var. anisopliae from spittlebugs. Ecotoxicol. Environ. Saf. 65: 278-287.         [ Links ]

19. US-EPA (United State Enviromental Protection Agency) (1996). Microbial Pesticide test guidelines. Microbial Pesticide Test Guidelines OPPTS 885.3000. Background-Mammalian Toxicity/Pathogenicity/lnfectivity. EPA 712-C-96314.Documento en línea: http://www.permanent.fdlp.gov/fbb/library/epa_885/885-3000.pdf (Consultado: 2010, Octubre 02).         [ Links ]

20. Zimmermann G. (2007). Review on safety of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Beauveria brongniartii. Biocontrol Sci. Tech. 17: 553-596.        [ Links ] ]]> 1 2011 21 477-483 2 2007 17 1-5 3 2011 31 333-352 4 1996 7 333- 351 5 FONACIT 2008 6 1997 213-249 7 1994 2nd 8 2002 40 2698-2702 9 1997 29 232-238 10 2004 99 211-218 11 2005 22 185-190 12 2005 88 103-111 13 2003 19 469-477 14 1997 15 2005 88 116-125 16 2004 39 469-475 17 2000 22 17-27 18 2006 65 278-287 19 US-EPA (United State Enviromental Protection Agency) 1996 20 2007 17 553-596