¹ Laboratorio de Enzimología de Parásitos (LEP). ³Laboratorio de Inmunología de Parasitosis (LABINPAR). Facultad de Ciencias, Universidad de los Andes. Mérida-Venezuela.

RESUMEN

Es cada vez mayor la evidencia experimental y clínica de que el sistema inmune interviene activamente en la patogénesis y el control de la progresión tumoral. Una respuesta antitumoral efectiva depende de la correcta interacción de diversos componentes del sistema inmune, como las células presentadoras de antígeno y diferentes sub-poblaciones de células T. Sin embargo, los tumores malignos desarrollan numerosos mecanismos para evadir su reconocimiento y eliminación. Diversos estudios reportan que estructuras asociadas a tumor tales como los antígenos Tn y sialil-Tn se expresan en algunos parásitos protozoarios y helmintos, planteando numerosas interrogantes a nivel de la interacción parásito-hospedador. Considerando que existe una correlación negativa entre ciertas infecciones parasitarias y el desarrollo de cáncer, los antígenos de O-glicosilación incompleta obtenidos de parásitos podrían ser potenciales estructuras miméticas para la inducción de respuestas cruzadas contra antígenos tumorales. Actualmente, el área de la glicobiología del cáncer tiene muchas expectativas para encontrar solución a uno de los grandes problemas de salud que afecta a la población tanto desde el punto de vista económico como social.

Palabras clave: O-glicosilación, cáncer, parásito, antígenos asociados a tumor.

Key words: O-glycosylation, cancer, parasite, tumor associated antigens.

INTRODUCCIÓN

La glicosilación es la modificación más frecuente en las proteínas y ocurre por la unión de una o más cadenas oligosacarídicas a la secuencia aminoacídica (Rosete et al., 2008). Dicho proceso le otorga diferentes características estructurales y funcionales a las proteínas, confiriéndoles mayor estabilidad ante las condiciones fisicoquímicas del medio y contribuyendo en su correcto patrón de plegamiento (Freire et al., 2002). Por otra parte, los carbohidratos cumplen funciones muy importantes en el reconocimiento biológico, uniéndose a diferentes moléculas (como las lectinas), mediando interacciones célula-célula y célula-matriz. La glicosilación es una modificación post-traduccional que genera una gran diversidad, dada la variedad de glicanos que se pueden producir a partir de un número relativamente limitado de monosacáridos. El patrón de glicosilación de una proteína es dependiente del tipo celular que la produce y puede modificarse ante diversas situaciones fisiológicas o ante la presencia de enfermedades, lo que ha llevado a un importante desarrollo de la glicopatología (Mendes et al., 2013; Gruszewska & Chrostek, 2013).

Existen dos tipos de glicosilación de proteínas dependiendo del lugar de adición de los carbohidratos: la N-glicosilación y la O-glicosilación. La mayoría de las glicoproteínas presentan glicosilación de tipo N, caracterizada porque la unión de la cadena oligosacarídica a la secuencia peptídica se establece mediante un enlace entre una N-acetilglucosamina (GlcNAc) y un residuo de asparagina. A diferencia de la N-glicosilación, la O-glicosilación se encuentra determinada por la unión de un residuo de N-acetilgalactosamina (GalNAc) a residuos de serinas o treoninas presentes en el esqueleto polipeptídico formando así el antígeno Tn (GalNAc-Thr/Ser) (Tang et al., 2012). La complejidad estructural de las cadenas oligosacarídicas de tipo O es mucho mayor que las de tipo N, debido a la existencia de ocho cores (donde se encuentran los carbohidratos más cercanos al sitio de unión con la cadena polipeptídica) que se originan mediante la acción de glicosiltransferasas específicas que actúan de manera secuencial (Julien et al., 2005; Ju et al., 2008; Varki et al., 2009; Ju et al., 2011).

A partir de los cores formados, las cadenas sacarídicas se elongan o ramifican dando como resultado estructuras más complejas. Las ramificaciones que parten de N-acetilglucosamina (GlcNAc) con enlace β1,6 generan el antígeno H, mientras que las ramificaciones que sufren tanto el antígeno Tn como el antígeno T por acción de diversas enzimas sialiltransferasas (STs) o fucosiltransferasas (FucTs) dan origen a los antígenos de Lewis. (Ju et al., 2008; Bouanene et al., 2011).

El mecanismo de inmunoedición comprende tres fases: eliminación, equilibrio y escape (Fig. 1). En la fase de eliminación, los componentes del sistema inmune innato y adaptativo actúan de forma simultánea para detectar y destruir células tumorales. En el caso de que la eliminación sea parcial, se genera un estado de equilibrio temporal en el cual las células tumorales pueden permanecer quiescentes o continuar acumulando cambios para modular la expresión de antígenos específicos de tumor o antígenos inducidos por estrés. A medida que ocurre este proceso el sistema inmune ejerce una presión selectiva para destruir los clones tumorales susceptibles. En la fase de escape, la continua presión ejercida sobre las células genéticamente inestables lleva a la generación de variantes tumorales que ya no son reconocidas por el sistema inmune o que son insensibles a sus mecanismos efectores (Dunn et al., 2004).

El escape tumoral puede ser promovido por mecanismos inducidos por la propia célula tumoral tales como la perdida de antígenos tumorales, de proteínas del MHC clase I o el desarrollo de resistencia citotóxica, dando lugar a variantes de células tumorales poco inmunogénicas. Adicionalmente, los tumores pueden promover un estado de inmunosupresión en el microambiente en el cual se encuentran debido a la liberación de moléculas tales como VEGF, TGF-β o galectina-1 (Camby et al., 2006; Wakefield & Hill, 2013). Por otra parte, las células tumorales pueden reclutar componentes del sistema inmune que suprimen los mecanismos efectores antitumorales tales como células T reguladoras, células supresoras de origen mieloide o macrófagos tipo M2 (Ostrand-Rosenberg et al., 2012). Por lo tanto, el equilibrio entre células efectoras inmunosupresoras y antitumorales (macrófagos M1, células T CD8+ y CD4+) pueden definir el pronóstico y el impacto de la quimioterapia e inmunoterapia (Quezada et al., 2011).

Dentro de las alteraciones moleculares más distintivas de las células cancerígenas se encuentra la elongación incompleta de las cadenas sacarídicas con uniones de tipo O. Este fenómeno determina que algunos cores presentes en las células normales y que se encuentran enmascarados por la adición de azucares, queden expuestos en la superficie celular formando antígenos carbohidratos asociados a tumor (TACAs) (Ono & Hakomori, 2004). Hasta el momento no se conocen completamente los mecanismos bioquímicos por los cuales las moléculas glicosiladas sufren alteraciones durante la carcinogénesis; no obstante, es posible que se deba a una modificación en la regulación de la expresión de glicosiltransferasas que catalizan las etapas iniciales de la O-glicosilación (Gallegos et al., 2008). El estudio de la relación entre estas glicosiltransferasas y el cáncer ha cobrado relevancia debido a que al ser las primeras enzimas en actuar sobre un sustrato como es el centro proteico de las mucinas, pueden definir muchas de las características antigénicas de estas moléculas.

Ha sido ampliamente demostrado que los TACAs pueden modelar el fenotipo maligno de las células tumorales o suprimir la inmunidad antitumoral contribuyendo al crecimiento del tumor (Freire & Osinaga, 2012). De hecho, sialil-Tn o TF en células de carcinoma pueden inducir la disminución del contacto célula-célula y el incremento de la adhesión a la matriz extracelular, migración e invasión (Glinsky et al., 2003; Pinho et al., 2007). Además sialil-Tn expresado en la mucina MUC1 afecta la capacidad de las células dendríticas de estimular la respuesta Th1 (Carlos et al., 2005). Finalmente, las mucinas producidas por las células cancerígenas también pueden favorecer la progresión del tumor a través de la inducción de la expresión de COX-2 por monocitos activados en un mecanismo que resulta en la disminución de la producción de IFN-g por parte de las células T CD4+ (Yokoigawa et al., 2007).

Durante el proceso de invasión de las células tumorales a órganos distantes, estas deben interactuar con el endotelio vascular; dicho proceso permite la extravasación de las células tumorales desde la circulación sanguínea favoreciendo así la difusión del tumor. Durante este proceso de adhesión, los TACAs son factores claves que interactúan de forma específica con diferentes lectinas presentes en las células endoteliales. En efecto, se ha propuesto que los antígenos de Lewis (sLex o sLea) expresados en la superficie de las células malignas participan en la adhesión mediada por selectinas al endotelio vascular, favoreciendo la extravasación (Portela et al., 2011). Estos datos son apoyados por el hecho de que estos antígenos están altamente expresados en diferentes adenocarcinomas humanos y la expresión de las selectinas E y P incrementa significativamente en las células endoteliales de pacientes con cáncer (Thurin & Kieber-Emmons, 2002; Mathieu et al., 2004).

Los TACAs afectan la respuesta de las células T o B al obstaculizar la presentación o procesamiento antigénico y la proliferación de células T (Shurin et al., 2001; Ryan et al., 2010). Aunque las células presentadoras de antígeno (APCs) son capaces de procesar glicoproteínas a glicopéptidos y presentarlos en el contexto de moléculas del MHC clase I y II, dicho mecanismo es altamente dependiente de la complejidad y tamaño de las cadenas hidrocarbonadas así como del sitio en el cual se encuentran (Lisowska, 2002; Hanisch & Ninkovic, 2006).

Los carbohidratos presentes en proteínas y lípidos pueden modular la inducción de una respuesta inmune antitumoral efectiva. Evidencias experimentales muestran que el TCR de las células T CD4+ es capaz de reconocer TACAs unidos a glicopéptidos que son presentados en el contexto de moléculas del MHC clase II de las APCs (von Delwig et al., 2006). Este hecho es de gran importancia teniendo en cuenta que algunos péptidos derivados de mucinas tienen una baja capacidad inmunoestimuladora y llegan a ser altamente inmunogénicos cuando están unidos a cadenas cortas de carbohidratos. En algunos casos, el TCR presenta reacción cruzada con el glicopéptido y el péptido mientras que en otros casos es específico para el glicopéptido que contiene el TACA. De hecho, se ha observado que la introducción del antígeno Tn dentro de un péptido derivado de la hemoglobina induce una respuesta de células T CD4+ específica para Tn (Galli-Stampino et al., 1997).

TACAs específicos de células T CD8+ también han sido descritos. Xu et al. (2004), reportaron la inducción de una respuesta citotóxica específica contra el antígeno TF unido a un péptido derivado del virus Sendai. Estas células fueron capaces de destruir aunque con baja eficiencia células de melanoma B16 transfectadas con MUC1, independientemente del esqueleto peptídico que porta el antígeno TF pero restringido al MHC clase I. Además de su participación en el procesamiento y presentación antigénica los TACAs pueden afectar el desarrollo de una respuesta inmune estimuladora mediante la inducción de tolerancia (Freire & Osinaga, 2012).

Un tipo de estrategia se basa en suministrar al paciente células dendríticas (CDs) autólogas cargadas ex vivo con antígenos tumorales, las cuales migran al ganglio linfático donde presentan y activan a las células T (Tuma, 2011). Aunque también es posible el cargado in vivo de la CD "in vivo DC targeting", de esta manera se inmunizan los animales con los antígenos tumorales de interés fusionados a moléculas con capacidad de unirse y ser internalizados por las CDs mediante sus receptores de superficie FcgR o DEC205 (Proudfoot et al., 2007). Cabe destacar que en las estrategias terapéuticas antes descritas la identificación de antígenos tumorales es esencial para potenciar el sistema inmunológico contra células tumorales, demostrando la importancia en el estudio e identificación de los mismos.

Debido a que los carbohidratos provocan una respuesta débil de anticuerpos se han explorado diversos métodos para aumentar la inmunogenicidad de dichas moléculas (Jeschke et al., 2005). La estrategia más empleada consiste en conjugar estos antígenos con una proteína transportadora inmunogénica tal como la albúmina bovina sérica (BSA) o la metaloproteína presente en la hemolinfa del gasterópodo Megathura crenulata (KLH). Tn y Sialil-Tn son antígenos presentes en el 90% de los carcinomas, razón por la cual han despertado gran interés a nivel terapéutico y se han realizado numerosos esfuerzos en el desarrollo de inmunoterapias que los involucren (Ando et al., 2008; Julien et al., 2009). Diversos estudios señalan que ratones inmunizados con glicopéptidos Tn sintéticos desarrollan una respuesta inmunoprotectora antitumoral (Lo-Man et al., 1999; Freire & Osinaga, 2003a) cuya eficacia depende de la densidad de residuos Tn consecutivos en el inmunógeno, obteniéndose un mayor efecto inmunoprotector cuando los glicopéptidos presentan tres residuos Tn consecutivos (Lo-Man et al., 2001). Kuduk et al. (1998), observaron que tres residuos Tn consecutivos unidos de forma covalente a la KLH o la BSA más el adyuvante QS-21 estimularon la producción de títulos elevados de IgM e IgG contra Tn en ratones, estos anticuerpos fueron fuertemente reactivos frente a la línea de cáncer de colon LCS positiva para Tn sin mostrar ningún efecto cuando se empleó la línea celular LSB que no expresa Tn. El efecto inmunoprotector dependiente del número de residuos consecutivos no está restringido al Tn, puesto que también ha sido observado con el antígeno sialil-Tn; el cual conjugado a KLH ha sido empleado con éxito para inmunizar pacientes con cáncer de mama de alto riesgo (Gilewski et al., 2007; Miles et al., 2011).

A pesar de la eficacia de estas vacunas en modelos pre-clínicos, el estudio en pacientes es limitado puesto que el uso de moléculas portadoras acarrea diferentes inconvenientes como la producción considerable de anticuerpos contra la proteína transportadora y la heterogeneidad química en la composición del conjugado final (Freire et al., 2006). Una alternativa eficaz a este tipo de estrategia comprende el uso de péptidos antigénicos múltiples (MAP) (Kowalczyk et al., 2011; Zhang et al., 2012) los cuales no requieren de la proteína transportadora, sin embargo; la síntesis química y purificación de dichas moléculas es compleja y su costo es extremadamente elevado, lo cual hace difícil su explotación a gran escala.

O-GLICOSILACIÓN INCOMPLETA EN PARÁSITOS: IMPLICACIONES EN CÁNCER

En algunos parásitos se expresan antígenos de O-glicosilación incompleta o TACAs, hecho que llama la atención y plantea numerosas interrogantes a nivel de la glicobiología parasitaria, de la relación parásitO-hospedador y de las eventuales relaciones entre la biología de algunos parásitos y las células cancerígenas (Thors et al., 2006). La presencia de TACAs en parásitos ha tomado gran importancia en la investigación del cáncer, ya que en los últimos años se ha determinado que existe una correlación negativa entre algunas infecciones parasitarias y la prevalencia de la enfermedad. Es por ello que se plantea la generación de una posible reacción cruzada para los antígenos asociados a tumor en individuos que han sido infectados por estos parásitos, indicando así el potencial uso de dichos antígenos en terapias inmunológicas contra el cáncer.

El tremátodo Schistosoma mansoni expresa una glicoproteína rica en Thr/Ser en las células epiteliales del tracto reproductivo del gusano hembra, además de ser el primer parásito en el que se identificó la estructura Tn en el esquistosómulo y en el gusano adulto (Thors et al., 2006). En el cestode Echinococcus granulosus se han identificado los antígenos Tn y sialil-Tn, estos antígenos están presentes tanto en el parénquima como en el tegumento, encontrándose altos niveles de Tn en la fracción de excreción/secreción, lo que sugiere que el antígeno puede participar en mecanismos de interacción con el hospedador (Alvarez-Errico et al., 2001). En dicho parásito también ha sido identificada un proteína tipo mucina denominada C137 que se expresa en la capa germinativa de la pared del quiste hidatídico (Casaravilla & Díaz, 2010). En cuanto a su estructura la proteína tiene 58 residuos aminoacídicos organizados en tres diferentes regiones: el extremo N-terminal rico en residuos ácidos con un péptido señal, una región tipo mucina con 14 posibles sitios de O-glicosilación y el extremo C-terminal el cual posee varios aminoácidos hidrofóbicos (Casaravilla & Díaz, 2010). Resulta interesante destacar que la secuencia del péptido C137 es muy distinta a la de las mucinas humanas con ausencia de secuencias primarias conservadas entre ambas proteínas.

Teniendo en cuenta el hallazgo de que los antígenos Tn y sialil-Tn se expresan en numerosos parásitos helmintos, Freire et al. (2003c) estudiaron la presencia de dichas estructuras en el protozoario Trypanosoma cruzi, encontrando que los epimastigotes del parásito expresan sialil-Tn. Adicionalmente, los autores evaluaron la actividad ppGalNAc-T (enzima que cataliza la primera etapa de la O-glicosilación) y caracterizaron los glicopéptidos resultantes de la glicosilación in vitro, los resultados obtenidos mostraron que los extractos de epimastigotes tienen actividad ppGalNAc-T, los glicopéptidos sintetizados por la actividad ppGalNAc-T in vitro son reconocidos por anticuerpos y por lectinas anti-GalNAc y el análisis de la composición de carbohidratos de estos glicopéptidos reveló la presencia exclusiva de GalNAc.

Existen mecanismos biológicos compartidos entre las células cancerígenas y algunos parásitos tales como el fenotipo invasor, que requiere de la capacidad para establecer adhesiones célula-célula y célula-matriz, desarrollar proteólisis y presentar motilidad (Freire et al., 2002). Tres de las moléculas relacionadas con el proceso de invasión y metástasis por las células cancerígenas (integrinas, metaloproteasas de matriz y el receptor de la quimiocina RANTES), también pueden participar en mecanismos de invasión por parásitos (Lauwaet et al., 2000). Por otro lado, tanto las células malignas como algunos parásitos protozoarios (Plasmodium y Leishmania) tienen la capacidad de desarrollar mecanismos de resistencia a diferentes drogas de uso terapéutico (Pérez et al., 2002).

Adicionalmente, ciertos parásitos generan estrategias de regulación o evasión del sistema inmune similar a las mencionadas anteriormente para células tumorales. Se ha descrito que la respuesta inmune frente a infecciones parasitarias mediadas por helmintos tiene componentes anti-inflamatorios caracterizados por un aumento en la producción de citocinas como IL-10 y TNF-β, promoviendo así la generación de células T reguladoras y por lo tanto la evasión a la respuesta inmune (Zambrano-Villa et al., 2002; Maizels et al., 2004). Además de estos mecanismos biológicos compartidos entre células cancerígenas y parásitos, se han observado similitudes a nivel estructural. El antígeno Sm23 expresado en la superficie de Schistosoma mansoni presenta una gran homología a nivel de secuencia y estructura con respecto al antígeno ME491 presente en melanomas, entre otros tipos de tumores malignos (Wright et al., 1990). Así mismo, recientemente se ha descrito que la proteína tropomiosina de Trichinella spiralis presenta similitudes con antígenos de la línea celular tumoral de mieloma SP2/o (Gong et al., 2011).

Diferentes factores biológicos pueden favorecer el desarrollo de cáncer, entre ellos el virus de la hepatitis B (Nguyen-Truong et al., 2013), el de Epstein-Barr (Zhu et al., 2013) y algunos subtipos del virus del papiloma humano (VPH) (Racey et al., 2013). También se ha observado una relación inequívoca entre ciertas infecciones parasitarias y algunos tipos de cáncer, siendo plenamente establecido que Opisthorchis viverrini es un agente causal de colangiocarcinomas humanos, mientras que el parásito hepático Clonorchis sinensis es considerado como una causa muy probable (Watanapa & Watanapa, 2002). Además, diversos estudios sugieren el desarrollo de diferentes tipos de cáncer asociados a Schistosomiasis (Abdel-Rahim, 2001). Las bases moleculares acerca de la función de algunos parásitos en los procesos carcinogénicos no han sido completamente dilucidadas, siendo posible la participación de la reacción inflamatoria anti-parasitaria con generación de especies reactivas del oxígeno que pueden causar daño e inestabilidad genética en las células normales vecinas; sin embargo, se ha observado un fenómeno opuesto: la disminución en la incidencia de cáncer de colon inducido por 1,2 dimetilhidrazina (DMH) en ratas en fase crónica de la infección por T. cruzi (Oliveira et al., 2001).

Hill et al. (2010), utilizando dos modelos de cáncer en ratas (cáncer de colon inducido por DMH y cáncer de mama inducido por nitrosometilurea) encontraron que la inmunización con extractos de T. cruzi durante la carcinogénesis induce una respuesta protectora anti-tumoral que determina el desarrollo de un menor número de lesiones malignas en los animales inmunizados en comparación con los no inmunizados. También se evaluó la posibilidad de generación de protección ante el desarrollo de tumores mediante la inmunización con un extracto proteico de epimastigotes de la cepa Dm28c de T. cruzi en modelos murinos. Para ello administraron células tumorales de colon o pulmón (líneas celulares CT26 y LL2 respectivamente) a ratones previamente inmunizados con dicho extracto. En el modelo de cáncer de colon se observó una reducción en el tamaño del tumor en los ratones inmunizados respecto a los del grupo control, mientras que en cáncer de pulmón la inmunización con T. cruzi previno la aparición de tumores en un 60% de los animales tratados. A partir de estos resultados se estudiaron los mecanismos efectores del sistema inmune implicados en dicha respuesta anti-tumoral, sugiriéndose que las células T CD8+ y células NK (Natural Killer) con capacidad citotóxica están implicadas.

Mel’nikov et al. (2004), observaron que ratones Balb/c infectados con la cepa CH4 de T. cruzi e inoculados con el linfoma L5178Y-R al mes post-infección, desarrollaron una actividad antitumoral la cual inhibió el crecimiento y metástasis del linfoma. Adicionalmente, el ensayo de citotoxicidad demostró una completa inhibición de la proliferación celular cuando células del melanoma B16/BL6 fueron cultivadas en presencia de medio condicionado de melanoma-T. cruzi.

Estudios realizados por nuestro grupo de investigación (Rodríguez-Bonfante et al., 2008; Pérez-Aguilar et al., 2013; Bonfante-Cabarcas et al., 2013) en los que ratones C57/BL6 fueron infectados con la cepa YBM de T. cruzi y posteriormente inoculados con la línea celular del melanoma B16/BL6 a los 15 días post-infección, mostraron una reducción significativa del volumen del tumor, siendo el efecto mucho mayor en ratones en fase aguda de la infección. La reducción del volumen del tumor se correlacionó con la dosis del inóculo y el nivel de parasitemia. In vitro el medio condicionado VerO-T. cruzi tuvo efecto citotóxico; disminuyendo la proliferación de células de melanoma, confirmando así que T. cruzi inhibe el desarrollo del melanoma maligno en ratones C57/BL6 y sugiriendo que el fenómeno está relacionado con antígenos secretados/excretados con propiedades tumoricidas e inmunogénicas. Además del efecto citotóxico demostrado in vitro y dado que el antígeno sialil-Tn es capaz de inducir una respuesta inmune contra células cancerígenas y ha sido detectado en la superficie de T. cruzi, se pudiese pensar que el sialil-Tn del parásito está involucrado en la inducción de una respuesta inmune cruzada la cual inhibe el crecimiento del tumor, lo cual representaría un mecanismo adicional de supresión.

La expresión de Tn y sialil-Tn podría influir en la biología parasitaria y en el desarrollo de nuevos procedimientos de inmunoterapia, ya que está demostrada la eficiencia de la inmunidad antitumoral inducida por estos antígenos, particularmente cuando se presenta en residuos consecutivos. El hecho de que estos antígenos de O-glicosilación incompleta se expresen en diversos parásitos plantea preguntas interesantes sobre los mecanismos involucrados en su formación, en la participación que puedan tener en la relación parásitO-hospedador y en las posibles influencias que las infecciones parasitarias puedan tener en el tipo de respuesta antitumoral que pueda desarrollarse. Considerando la correlación negativa entre ciertas infecciones parasitarias y el desarrollo de cáncer, los antígenos de O-glicosilación incompleta obtenidos de parásitos podrían considerarse potenciales herramientas para la inducción de una respuesta inmune cruzada protectora contra el cáncer.

La identificación de TACAs en T. cruzi, podría contribuir al desarrollo de nuevos protocolos de inmunización utilizando fracciones parasitarias o de proteínas purificadas y la posterior evaluación de la respuesta antitumoral, evitando así el uso de extractos proteicos totales los cuales tienen composición variable y avanzando de esta forma en la creación de una vacuna antitumoral basada en péptidos parasitarios.

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