Vector competence persistance of Venezuelan Aedes albopictus for an Asian dengue-2 strain
Yda Méndez1, Marifel Carrozza1, Darjaniva Molina P. de Fernández2, Karen Flores3 & Flor Herrera1*
1 Instituto de Investigaciones Biomédicas de la Universidad de Carabobo (BIOMED-UC). Maracay, Edo. Aragua, Venezuela.
2 Centro de Estudios de Enfermedades Endémicas y Salud Ambiental (CEEESA). Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios “Dr. Arnoldo Gabaldón” (MPPS). Maracay, Estado Aragua. Venezuela.
3 Dirección de Malariología y Saneamiento Ambiental (MPPS). Maracay, Estado Aragua. Venezuela.
*Autora de correspondencia: flormhq@gmail.com
RESUMEN
En Venezuela, existen poblaciones de Aedes aegypti (Ae. aegypti) de diferente origen geográfico y estructura genética que difieren en la competencia vectorial para el virus dengue. Debido a que, recientemente, se reportó la presencia de Aedes albopictus (Ae. albopictus), es importante también conocer la competencia vectorial de esta especie para prever el riesgo epidemiológico el cual conlleva a su propagación. Se determinó la persistencia en la competencia vectorial de Ae. albopictus de Maracay, Venezuela a una cepa asiática dengue 2. Las especies de mosquitos Ae. albopictus y Ae. aegypti fueron alimentadas con una suspensión sangre-virus dengue 2 y luego de 20 días post-exposición viral se determinó la presencia del virus por el ensayo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en las diferentes partes de los insectos: abdomen (infección), patas/alas (diseminación) y cabeza (transmisión). Los resultados muestran que la cepa Ae. aegypti es más susceptible a la infección del abdomen (60 %) que la cepa de Ae. albopictus (37,5%); sin embargo, sólo en Ae. albopictus se encontró el virus presente en las patas/alas (100%) y cabezas (33%). La cepa de Ae. albopictus estudiada podría ser más competente para la transmisión del virus dengue asiático que la de Ae. aegypti. Este hallazgo es de gran importancia epidemiológica, ya que se demuestra que este vector aún no estando en su continente de origen, puede seguir siendo un vector eficiente y con el tiempo adecuarse a las cepas virales propias.
Palabras clave: Ae. aegypti, Ae. albopictus , competencia vectorial, virus dengue asiático, Venezuela.
]]> SUMMARYIn Venezuela, there are populations of Aedes aegypti (Ae. aegypti) with different geographic origins and genetic structure that differ in vector competence for dengue virus. Since recently, the presence of Aedes albopictus (Ae. albopictus) was reported, it is also important to know the vector competence of this species to predict the epidemiological risk which would bring its spread. The objective was to determine the vector competence persistance of Ae. albopictus from Maracay, Venezuela for an Asian dengue-2 strain. The two species of mosquitoes were fed with a blood–dengue 2 virus suspension and after 20 days post-exposure to virus, the presence of the virus was determined by the polymerase chain reaction assay in different parts of the insect: abdomen (infection), legs/wings (spread) and head (transmission).The results show that the strain Ae. aegypti is more susceptible to infection in the abdomen (60 %) that the strain of Ae. albopictus (37.5%); however, only in Ae. albopictus this virus was found in the legs /wings (100%) and heads (33%). The studied strain of Ae. albopictus may be more competent vector in the transmission of the dengue 2 virus than Ae. aegypti. This finding is of great epidemiological importance as this shows that even this mosquito not being in its continent of origin, it can still be an efficient vector and eventually become adapted to the native viral strains.
Key words: Ae. aegypti, Ae. albopictus, vectorial competence, Asian dengue virus, Venezuela.
Recibido el 24/03/2015
Aceptado el 28/12/2015
INTRODUCCIÓN
El dengue es la fiebre viral hemorrágica más extensamente distribuida y una de las arbovirosis más importantes desde el punto de vista epidemiológico a nivel mundial. La enfermedad es producida por uno de los 4 serotipos del virus dengue, un flavivirus transmitido al humano por la picada del mosquito Aedes (OPS/OMS, 2010).
No existe una vacuna licenciada contra el dengue y la transmisión de la enfermedad se controla previniendo la reproducción del vector (OPS/OMS, 2010). El virus dengue se ha detectado en mosquitos Ae. aegypti capturados en diferentes localidades de Venezuela lo cual los involucra en el ciclo de transmisión del virus en nuestro país (Urdaneta et al., 2005). Ae. albopictus también está presente en Venezuela, aunque todavía no se ha detectado ninguno infectado por virus dengue (Navarro et al., 2009; Martiradonna et al., 2013).
Venezuela es un país hiperendémico para el dengue debido a la existencia de importantes poblaciones del vector Ae. aegypti todos los meses del año y a la circulación simultánea de los 4 serotipos del virus dengue (Camacho-García et al., 2012) si a este escenario, se le suma la propagación de Ae. albopictus, la situación del dengue podría empeorar en los próximos años, por lo cual resulta prioritario estudiar si este vector asiático mantiene su capacidad de transmitir el virus dengue en territorio venezolano.
La dinámica de transmisión del virus dengue está asociada a factores propios del insecto vector, como la competencia vectorial (susceptibilidad del vector a la infección, replicación, diseminación y transmisión del virus dengue) y a factores inherentes al virus; como el serotipo y genotipo viral (Black et al., 2002; Tabachnik, 2013). Además, esta dinámica se ve influenciada por factores extrínsecos y de conducta del mosquito como: la temperatura y humedad del medio ambiente, título de virus en el humano y hábitos de alimentación, los cuales influyen sobre características relacionadas con el vector como la longevidad, el período de incubación extrínseco y la abundancia del vector (Tabachnik, 2013; Gurugama et al., 2010).
]]> La hembra adulta del mosquito Aedes es hematófaga (a diferencia del macho que se alimenta solo del néctar de las flores) y por ende es el género de este mosquito involucrado en el ciclo biológico del virus dengue. El ciclo de transmisión del virus dengue se inicia cuando el mosquito Aedes se alimenta de una persona infectada con el virus en el período virémico. Si el mosquito es competente el virus se desarrolla y replica en primer lugar en el intestino medio del insecto y luego de superar algunas barreras a nivel local se disemina a través de la hemolinfa a otros órganos entre ellos las glándulas salivales del mosquito, donde el virus también debe replicarse. Finalmente, el virus se transmite a través de la saliva infectada del mosquito, cuando éste pica a un hospedador vertebrado sano (Black et al., 2002; Tabachnik, 2013). La competencia vectorial de los mosquitos es un fenómeno muy complejo que resultaría de la interacción de un gran número de genes del insecto, de interacciones genotipo x genotipo entre virus dengue y la especie de vector y diversos factores ambientales, en su gran mayoría desconocidos, que funcionan de forma coordinada (Tabachnik, 2013). Ahora bien, en condiciones ambientales controladas en el laboratorio, la competencia vectorial para arbovirus se ha asociado principalmente con barreras anatómicas, las cuales, entre otras, incluyen; la barrera de infección del intestino medio (MIB, midgut infection barrier), la barrera de escape del intestino medio (MEB, midgut escape barrier), la barrera de infección de las glándulas salivales (SIB, salivary gland infection barrier) y la barrera de escape de las glándulas salivales (SEB, salivary gland escape barrier) (Beerntsen et al. 2000). Se piensa que cada barrera para el virus dengue en Aedes está controlada por genes o grupos de genes específicos para cada una de estas. Actualmente, la base molecular de todas estas barreras se desconoce, pero se sabe que la respuesta inmune del insecto juega un rol principal en las mismas (Zhang et al., 2010).Investigaciones recientes indican que la competencia vectorial está influenciada también por interacciones genotipo x genotipo entre virus dengue y la especie de vector. Tales interacciones deben sumarse con los efectos causados de forma independiente por genes del vector y genes del virus (Lambrechts, 2011).
La competencia vectorial para la transmisión del dengue varía entre especies diferentes del mosquito Aedes (Black et al., 2002). En Venezuela, se ha reportado que cuatro poblaciones diferentes de Ae. aegypti, con distintos origen geográfico y estructura genética, difieren en la competencia vectorial para el virus dengue 1 (Pernalete et al., 2009; Herrera et al., 2006). Estudios similares no se han realizado todavía en Ae. albopictus ya que su presencia en Venezuela es muy reciente. Investigar si la cepa de Ae. albopictus de Maracay mantiene su competencia en la transmisión del virus dengue 2, es importante para entender el riesgo que implicaría su coexistencia con Ae. aegypti en el país.
MATERIALES Y MÉTODOS
Captura y cría de los mosquitos
Las larvas de Ae. albopictus fueron capturadas en la Universidad Central de Venezuela en Maracay - Edo. Aragua por personal capacitado y criadas en condiciones controladas de laboratorio (28ºC y 80% de humedad relativa) hasta obtener la generación F4 en el Laboratorio de Biología de Vectores y Reservorios del CEEESA. Aproximadamente, 250 hembras adultas (6 días de emergidas) fueron trasladadas al insectario del BIOMED para los experimentos de infección.
De la misma manera, un aproximado de 250 hembras Ae. aegypti (F4) de 6 días de emergidas (cepa La Pedrera de Maracay-Edo. Aragua) fueron criadas en la Dirección de Malariología y Saneamiento Ambiental del Estado Aragua y posteriormente transportadas al insectario del BIOMED para los experimentos de infección.
Infección y mantenimiento de los mosquitos
La infección experimental de las distintas poblaciones se logró mediante el método de alimentación artificial de papel parafinado (Rutledge et al., 1964). El alimento consistió en una suspensión de glóbulos rojos humanos (previamente lavados con PBS) mezclados con suero fetal bovino (Pernalete et al., 2009) y una suspensión de virus dengue 2 cepa 16681 con un título viral de 1,6x105 UFP/ml. Las dos cepas del vector fueron expuestas, de manera independiente, a la misma ingesta viral (5,3x104 UFP/ml) y condiciones de ensayo. El virus utilizado en este estudio corresponde a la cepa de virus dengue 2 (16681), la cual fue aislada en Tailandia (paciente fallecido por SCD) y desde entonces ha pasado por diferentes líneas de células, gentilmente donado por el Laboratorio Regional para el Diagnóstico del Dengue y otras Enfermedades Virales (LARDIDEV). La suspensión sangre-virus fue introducida en los mosquitos de forma oral; método de elección cuando se estudia la susceptibilidad a la infección por el virus dengue en distintas partes del mosquito, ya que el mismo permite evaluar las barreras más importantes del insecto.
El método consiste de un alimentador artificial de vidrio, conectado a un baño térmico de circulación mantenido a 37ºC. La superficie de papel parafinado, a través de la cual el mosquito se alimenta, es atravesada por el aparato bucal del mosquito (probóscide) al momento de la alimentación (Rutledge et al., 1964). La frecuencia con que las hembras de Aedes se alimentan con sangre está determinada por la necesidad de ingerir sangre para completar su ciclo gonotrófico (tiempo durante el cual los ovarios maduran hasta convertirse en folículos desarrollados completamente).
]]> Durante la alimentación experimental, las hembras adultas de Aedes fueron expuestas (ad libitum) por el período de 1 hora a la ingesta sanguínea, tiempo suficiente para que todas las hembras se alimenten de la suspensión sanguínea hasta quedar repletas (Vazeille et al., 2001). Luego se separaron las repletas (hembras engurgitadas: Nº de mosquitos alimentados / Nº de mosquitos expuestos) a otra jaula y se dejaron por 20 días post-exposición bajo condiciones controladas de laboratorio (28ºC, 80% de humedad relativa) mantenidas con solución de sacarosa al 10%. El período de incubación del virus dengue en el vector (desde que es ingerido hasta que el virus se desarrolla en las glándulas salivales) es de aproximadamente 7-14 días, luego de este período el mosquito competente es capaz de transmitir el virus a un nuevo hospedador susceptible (Zhang et al., 2010). Se dejaron 20 días post-exposición viral para asegurar la replicación del virus en las glándulas salivales de los vectores competentes (Zhang et al., 2010).Disección y extracción del ARN total de los diferentes segmentos de mosquitos
Pasado el período de incubación extrínseca (20 días post-alimentación), se determinó el porcentaje de hembras sobrevivientes (Nº de mosquitos sobrevivientes / Nº de mosquitos alimentados), se sacrificaron y se formaron grupos (de 10 individuos c/u) con las diferentes especies: de Ae. albopictus silvestre (8 grupos en total) y de Ae. aegypti silvestre (10 grupos). Los mosquitos fueron divididos en abdomen, (sitio donde se determinó el porcentaje de susceptibilidad a la infección oral por el virus dengue: Nº de mosquitos infectados / Nº de mosquitos expuestos), patas y alas (donde se determinó el porcentaje de diseminación viral: Nº de mosquitos con infección en las patas/alas / Nº de mosquitos infectados), y cabeza (el porcentaje de transmisión, debido a la localización en esta parte de las glándulas salivales: Nº de mosquitos con infección en la cabeza/ Nº de mosquitos infectados ).
Los distintos segmentos de los mosquitos (grupos de 10 individuos) fueron distribuidos en tubos de 1 ml previamente identificados por grupo y cepa, para luego aislar el ARN total de las diferentes partes del mosquito.
La extracción del ARN total de los mosquitos infectados con el virus dengue se realizó mediante una adaptación del método del fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (Urdaneta et al., 2005). Las muestras se procesaron por segmento (abdomen, cabeza, patas y alas) y una cepa de mosquito a la vez, para evitar la contaminación. Las muestras de ARN fueron cuantificadas a 260 y 280nm. Seguidamente, se realizó una electroforesis en gel de agarosa para verificar la calidad del mismo. Las muestras de ARN se ajustaron a 200 μg/mL.
Diagnóstico del virus dengue 2 por Transcripción Reversa acoplada a la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR)
La presencia del virus se determinó mediante el método de RT-PCR en un sólo paso para diagnóstico de dengue (Harris et al., 1998), la cual fue confirmada por el método tradicional de RT-PCR anidada (Lanciotti et al., 1992), utilizando el kit Access de Promega. La banda de dengue 2 es de 119 pb.
Análisis estadístico
Fueron aplicadas las pruebas Chi-cuadrado de independencia, mediante el programa Open Epi (Estadísticas epidemiológicas de código abierto para Salud Pública), Versión 3.03 (Dean et al., 2015).
RESULTADOS
]]> En la Tabla I, se muestra el número de individuos alimentados y sobrevivientes por grupo. La cepa de Ae. albopictus mostró un porcentaje significativamente menor de alimentación (44%) que la de Ae. aegypti (80%) bajo las mismas condiciones (P < 10-6). Con respecto a los individuos sobrevivientes luego de los 20 días post-infección, la cepa de Ae. albopictus mostró el mayor porcentaje de sobrevivientes (72%) que la cepa de Ae. aegypti (60%) y el resultado fue significativo (P= 0,013).
Otro dato importante observado cualitativamente, es que la cepa de Ae. aegypti coloca muchos más huevos que la cepa de Ae. albopictus. Este resultado se menciona, aunque no estaba programado en la metodología, porque está directamente relacionado con la densidad del vector, parámetro que a su vez influye en la capacidad vectorial de estas especies.
En la Fig. 1 se muestra el resultado de la amplificación del virus dengue 2 a partir de muestras de abdomen de diferentes cepas de mosquitos Aedes. En la Fig. 1A, se observan los resultados para la cepa de Ae. albopictus infectados experimentalmente con el virus. Los grupos 4, 7 y 8 dieron un producto de amplificación de tamaño esperado (119 pb) y por lo tanto resultaron positivos a la infección con el arbovirus. Asimismo, en la Fig. 1B, se observa que 6 grupos de los 10 examinados de la cepa de Ae. aegypti, amplificaron la banda esperada para el virus dengue 2.
La diseminación del virus dengue se determinó por detección cualitativa del ARN viral en las muestras de patas/alas de los mosquitos expuestos al virus (20 dpe). En la Fig. 2A, se observan los resultados para la cepa de Ae. albopictus. Los grupos 4, 7 y 8 presentaron la banda esperada (119 pb), lo cual indicó la diseminación del arbovirus a las patas/alas. La cepa de Ae. aegypti no mostró ninguna amplificación; por lo tanto, el virus no se diseminó en esta población de mosquitos.
La competencia vectorial para la transmisión oral del virus dengue en las dos especies de Aedes se comparó determinando la presencia del ARN viral en las muestras de las cabezas de los insectos por localizarse en este sitio sus glándulas salivales. En la Fig. 3A puede apreciarse que sólo un grupo de los tres infectados de la población de Ae. albopictus, amplificó el producto del tamaño esperado (119 pb) y por lo tanto, resultó positivo a la transmisión del virus. La cepa Ae. aegypti resultó negativa a la amplificación del virus en la cabeza (Fig. 3B).
En la Tabla II pueden observarse los porcentajes de infección, diseminación y transmisión del virus dengue 2 en las dos cepas estudiadas. En Ae. aegypti la infección fue mayor (60%) a los 20 días, que en Ae. albopictus (37,5%) aunque el resultado no fue estadísticamente significativo (P = 0,317). Se observa también que sólo en los mosquitos infectados de Ae. albopictus, el virus fue capaz de diseminarse (100%) y llegar hasta las glándulas salivales (33%).
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DISCUSIÓN
Los resultados, estadísticamente muy fuertes, mostraron que la cepa de mosquitos Ae. albopictus se alimentó mucho menos, en las condiciones experimentales, que la de Ae. aegypti. Estas condiciones simulan más un ambiente urbano que uno rural: la densidad de los mosquitos fue alta y debieron alimentarse de una misma fuente de suministro. Por lo tanto, la mayor actividad hematófaga de la cepa Ae. aegypti podría explicarse porque estos mosquitos están más adaptados a un ambiente urbano que la cepa de Ae. albopictus. Esto, posiblemente, provocó competencia entre los mosquitos de una misma cepa, por el alimento y en estas condiciones la cepa de Ae. aegypti se alimenta mejor. Un trabajo que le da apoyo a esta hipótesis, realizado en diferentes hábitats de una provincia de China, ha reportado que Ae. albopictus, adaptado a las áreas urbanas, presentó un desarrollo de larvas y pupas más rápido y una mayor tasa de sobrevivencia de larvas a adultos que los Ae. albopictus encontrados en las áreas semiurbanas y rurales (Li et al., 2014).
Otro dato que podría explicarse por ser Ae. aegypti más urbano que Ae. albopictus es el mayor número de huevos que coloca con respecto a Ae. albopictus. Este resultado debería ser estudiado exhaustivamente con ambas especies de mosquitos en condiciones naturales. Otros autores han trabajado también en ambientes urbanos (peri e intradomiciliarios) y han concluido que Ae. aegypti y Ae. albopictus pueden colocar huevos en ambos hábitats pero Ae. aegypti está mejor adaptado y coloca más huevos que Ae. albopictus (Serpa et al., 2013).
Un meta-análisis demostró que los arbovirus reducen la sobrevivencia de los vectores y la magnitud de este efecto depende, entre otros factores, de cuales vectores y virus estén interactúando así como del tipo de infección (Lambrechts & Scott, 2009). En el presente trabajo, los mosquitos Ae. albopictus alimentados tuvieron una mayor sobrevivencia, estadísticamente significativa, que Ae. aegypti lo cual sugiere que la demanda metabólica para la reproducción viral afecta más la longevidad de este último mosquito. Esto es muy importante porque la mayor longevidad aumenta la probabilidad de transmitir enfermedades (Lambrechts & Scott, 2009).
De tal manera que la relación entre los virus y sus insectos vectores no es necesariamente benigna y el grado de afectación en los mosquitos producirá diferencias en competencia vectorial entre diferentes especies y entre diferentes poblaciones de una misma especie (Lambrechts & Scott, 2009; Tabachnik, 2013).
Los resultados, aunque no estadísticamente significativos, mostraron que la tasa de infección por el virus dengue fue mayor en Ae. aegypti (60% vs 37,5%); sin embargo, la tasa de diseminación y de trasmisión del virus fue 100% y 33% en Ae. albopictus mientras que en Ae. aegypti fue 0% para ambas tasas. Estos resultados sugieren fuertemente que la cepa Ae. albopictus de Venezuela sigue siendo muy eficiente en la transmisión de cepas de virus de su mismo origen. Esto significa que, debido a la alta probabilidad de que simultáneamente circulen estos vectores y los virus, la transmisión sucederá con resultados inesperados (si es que no ya se están dando). Si a esto se le añade que Ae. albopictus tiene una gran capacidad en la transmisión transovárica (Gratz, 2004) y en adaptación a diferentes ambientes (Lambrechts et al., 2010), la diseminación y mantenimiento del virus podría ocurrir en las diferentes localidades tal como ha sucedido en otros países (Lambrechts et al., 2010).
Además, los resultados de infección experimental sugieren que la cepa Ae. albopictus de Venezuela es más competente, si bien con una asociación débil, para la transmisión viral que la cepa Ae. aegypti.
La menor competencia vectorial de Ae. aegypti por el virus dengue con respecto a Ae. albopictus es un resultado sorprendente ya que Ae. aegypti es el principal vector del dengue en nuestro país; sin embargo, esto podría explicarse si se considera que dicho mosquito, como ya se mencionó anteriormente, coloca un número muchísimo mayor de huevos que Ae. albopictus lo cual aumentaría su densidad, factor muy importante en las epidemias de dengue. Es decir, la competencia vectorial de Aedes aegypti sería menor que la del otro vector pero al colocar más huevos que Ae. albopictus compensaría esta debilidad y pasaría a tener una mayor capacidad vectorial.
En este trabajo surgen una serie de interrogantes que tendrían que ser aclaradas. En consecuencia, habría que realizar un estudio con un tamaño de muestra mucho mayor para detectar Ae. aegypti infectados con el virus dengue; asimismo, hacer estudios con otras cepas virales (especialmente autóctonas) para ver si este comportamiento es sólo de la cepa dengue 2 asiática e igualmente utilizar cepas de mosquitos de generaciones menores para ver si estas características son o no propias de mosquitos desarrollados en colonia.
]]> Obviamente, las infecciones experimentales no duplican exactamente las interacciones complejas que ocurren entre los mosquitos, los virus y el ambiente en la naturaleza. No obstante, estos resultados son un alerta para las autoridades de salud pública, con el fin que tomen en cuenta las características particulares del nuevo vector Ae. albopictus para el diseño de las estrategias de control vectorial del dengue.Conflicto de intereses
Los autores del trabajo declaramos que no existen conflictos de intereses.
AGRADECIMIENTOS
A los investigadores Guillermo Comach y Daría Camacho por donar gentilmente la cepa de virus dengue 2 (16681) utilizada en la infección experimental de los mosquitos, a la Dra. Irma Ágrela y al Dr. Carlos Espino por su valiosa orientación en los experimentos de infección y en el análisis estadístico respectivamente. Se agradece también al personal del CEEESA y de la Dirección de Malariología y Saneamiento Ambiental por el suministro de los vectores. Este trabajo fue financiado por el Ministerio del Poder Popular Para la Ciencia, Tecnología e Innovación, a través del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología; Proyecto Misión Ciencia N° 2008000911-1.
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