¹ Centro de Estudios de Enfermedades Endémicas y Salud Ambiental (CEEESA). S.A. Instituto de Altos Estudios "Dr. Arnoldo Gabaldon" (IAE-MPPS). Maracay, Venezuela

² Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.

³ Universidad Internacional SEK, Facultad de Ciencias Naturales y Ambientales, Quito, Ecuador

*Autor de correspondencia: darja2410@gmail.com

Aedes albopictus es un competente vector del virus chikungunya, zika y de la mayor parte de los virus de encefalitis equina, capaz de transmitir al menos 24 arbovirus, susceptible a la infeccion (vertical y horizontalmente) por los serotipos del virus dengue. El objetivo fue realizar un estudio preliminar sobre el comportamiento frente a insecticidas organosinteticos de Ae. albopictus de diferentes localidades de tres estados centrales del pais, durante el periodo 2012-2014. Se realizaron pruebas biologicas con botellas tratadas con insecticidas, segun el metodo del CDC e igualmente evaluacion bioquimica para identificar los mecanismos de detoxificacion enzimaticos in vitro y mecanismos de resistencia in vivo con el sinergista butoxido de piperonilo (PB). Todas las cepas evaluadas presentaron sensibilidad al DDT (200 µg/mL) y cuatro de ellas a lambdacialotrina (6,25 µg/mL), solo una, Santos Michelena (SM) presento valores de sobrevivencia. Tambien esto fue observado con: malation (100 µg/mL) con una mortalidad en 30 minutos de 42,6% para Carabobo; 46,2% Distrito Capital (DC); 69,6% Zamora y 75,5% Mario Briceno Iragorry (MBI), solo resulto sensible SM. En cuanto a fenitrotion se encontraron valores de sobrevivencia con mortalidades en 30 minutos de 72,2%; para Carabobo, 30,7% DC y 45,8% MBI; solo expresaron sensibilidad Zamora y SM. En las cepas Carabobo y DC se observo el efecto sinergico FS = 3 y FS = 1,3, respectivamente. Se presume que los valores de sobrevivencia encontrados para insecticidas organofosforados pudiera asociarse con el incremento de esterasas alfa (a) y beta (b), en menor medida por la acetilcolinesterasa insensible (AChei) y las oxidasas con la sobrevivencia a lambdacialotrina en la cepa SM, lo cual podria comprobarse en estudios futuros a realizarse sobre resistencia a insecticidas. Los resultados encontrados en el presente trabajo, constituyen la base para su inicio a corto plazo en Ae. albopictus de Venezuela y la region, a fin de contribuir en la eficacia de las medidas de control quimico de esta especie de importancia medica.

Palabras clave: Aedes albopictus, esterasas, insecticidas, resistencia, susceptibilidad.

Aedes albopictus is a competent vector of chikungunya virus, zika and most of the equine virus, capable of transmitting at least 24 arboviruses, susceptible to infection (vertically and horizontally) by serotypes of the dengue virus encephalitis. The objective was to conduct a preliminary study on the behavior against Ae. albopictus organosintetic insecticides from different locations in three central states of the country during the period 2012-2014. Bioassays with insecticide-treated bottles were performed according to the method of the CDC and also biochemical evaluation to identify the mechanisms of detoxification enzyme in vitro and in vivo mechanisms of resistance to the synergist piperonyl butoxide (PB). All strains tested showed sensitivity to DDT (200 µg/mL) and four of them lambdacyhalothrin (6.25 µg/mL), only one, Santos Michelena (SM) presented values of survival. This was also observed: malathion (100 µg/mL) with a mortality time (30 min) of 42.6% for Carabobo; 46.2% Capital District (DC); Zamora 69.6% and 75.5% Mario Briceno Iragorry (MBI) was sensitive only SM. As fenitrothion survival values encountered in the mortalities time (30 min) 72.2%; for Carabobo, 30.7% and 45.8% MBI DC; only expressed sensitivity Zamora and SM. In DC strains Carabobo and the synergistic effect was observed FS = 3 and FS = 1.3, respectively.It is presumed that the survival values found for organophosphate insecticides may be associated with increased esterase alpha (a) and beta (b), to a lesser extent insensitive acetylcholinesterase (ACHEI) and oxidases with survival to lambdacialotrine in strain SM , which could be verified in future studies to be carried out on insecticides resistance. The results found in the present work, constitute the basis for its short-term start in Ae. albopictus from Venezuela and the region, in order to contribute to the effectiveness of chemical control measures of this species of medical importance.

Keywords: Aedes albopictus, esterases, insecticide, resistance, susceptibility

Recibido el 11/06/2015 Aceptado el 18/06/2016

Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse, 1894) (Diptera: Culicidae) conocido como mosquito tigre asiático, es un insecto originario del sureste asiático responsable de la transmisión de 24 arbovirosis, entre ellas el virus dengue (DENV) (Reiter, 1998; Ibañes-Bernal, 1997), fiebre amarilla, encefalitis del este (EEEV), chikungunya (CHIKV), mayaro (Gratz, 2004) y zika (OPS & OMS, 2015). Históricamente, Ae. aegypti ha sido asociado como vector principal del virus dengue; Ae. albopictus mantiene un papel secundario en la transmisión de ciclos epidémicos en humanos. Ambas especies de mosquitos tienen un papel dual en la transmisión del virus chikungunya, una enfermedad que ha emergido recientemente en forma epidémica en Asia, países del Océano Índico y sureste de Europa (Charrel et al., 2007) y el continente Americano (OPS, 2013). Ae. albopictus posee una plasticidad genética, fisiológica y ecológica capaz de adaptarse a pequeñas cantidades de agua, tiene un rango de vuelo rara vez superior a 500 metros además se ha encontrado compartiendo nichos ecológicos con Ae. aegypti, (Hawley, 1988). Se distribuye desde su país de origen hacia el continente de África, Europa meridional, algunas islas del Océano Pacífico y América (Hawley, 1988; Moore & Mitchell, 1997; Gratz, 2004). En América se detectó la presencia de Ae. albopictus a partir de los años ochenta en países como Estados Unidos y Brasil (Forattini, 1986; Mitchell, 1995). En Venezuela, fue reportado por primera vez en la cuidad de Caracas por Navarro et al., (2009), seguidamente se ha reportado en el estado Aragua, en los municipios Santos Michelena localidad de Tiara (Ramírez et al., 2012) y Mario Briceño Iragorry (Martiradonna et al., 2013), en los estados Guárico y Monagas (Quinto et al., 2013) y más recientemente en Bolívar (Rubio-Palis et al., 2015). A esta especie se le considera uno de los vectores más invasores de la última década con la mayor dispersión geográfica a nivel mundial (Benedict et al., 2007). Al no contar aún con una vacuna efectiva para estos virus, las estrategias de control de estos vectores de enfermedades se basan principalmente en el saneamiento ambiental, la educación sanitaria, la participación social que permita lograr acciones sostenibles en el tiempo, con el fin de eliminar los hábitats y como última opción el control químico vectorial, considerándose fundamentalmente durante brotes epidémicos (Rodríguez, 2000). Sin embargo el control de las especies de mosquitos ha presentado dificultades, lo cual ha traído como consecuencia la expansión de virus a muchas áreas endémicas, por lo que el uso de los insecticidas sigue siendo crucial e indispensable, para contribuir en la reducción de los riesgos de la transmisión de las arbovirosis como el dengue y el chikungunya (Grieco et al., 2007). Los insecticidas organosintéticos de varias clases han sido usados en Venezuela para el control vectorial de mosquitos transmisores de dengue. Entre estos químicos, los organofosforados en diferentes tipos de formulaciones y en menor frecuencia los piretroides. Sin embargo combinaciones de piretroides en algunos casos con sinergistas como el butóxido de piperonilo, son formulaciones comúnmente usadas a nivel doméstico.

El uso inadecuado o excesivo de la herramienta química en el control vectorial, ha traído como consecuencia la selección de poblaciones de vectores resistentes a insecticidas, lo cual ha derivado preocupación e interés debido a que la biología de Ae. albopictus es similar a la de Ae. aegypti, es frecuentemente recolectado en recipientes naturales y artificiales donde coexisten con otras especies (Hawley, 1988); existiendo la probabilidad de que Ae. albopictus este siendo fuertemente presionado con insecticidas químicos, empleados para el control de Ae. aegypti pudiendo esto generar resistencia de una forma indirecta. La resistencia es un problema creciente que imposibilita el control vectorial de estas especies, para una mejor compresión del fenómeno es necesario el monitoreo con el fin de seleccionar los insecticidas de forma adecuada, y por ende el éxito en los programas de control vectorial. Existen estudios donde se ha reportado resistencia de Ae. albopictus a insecticidas así: en Vietnam a malatión, en Malasia a fenitrotión, en Madagascar a fenitrotion; también se ha reportado resistencia en África, India, Sur este de Asia, Filipinas y Japón al organoclorado DDT (Brown, 1986 Somboon et al., 2003, Thanispong et al., 2008, Kamgang et al., 2011, Momi & Prafulla 2014). La llegada y colonización de Ae. albopictus se data en América, en 1985 específicamente en Texas, USA (Mitchell , 1995). En el continente americano es escasa la información en resistencia de Ae. albopictus. Los casos registrados en América han sido reportados en Estados Unidos, donde encontraron resistencia al DDT y malatión, y susceptibilidad a los piretroides (Marcombe et al., 2014), otro estudio realizado en Brasil con insecticidas biológicos concluyó que Ae. albopictus presenta una respuesta diferente a Ae. aegypti (Duque & Navarro, 2005). Hasta ahora no existen casos registrados de resistencia en Sur América, por ello nos hemos planteado como objetivo estudiar la resistencia a insecticidas organosintéticos en Ae. albopictus en localidades procedentes del centro de Venezuela, con la finalidad de contar con información necesaria para su control.

La muestra para los bioensayos estuvo comprendida por mosquitos adultos de Ae. albopictus, obtenidos a partir de material inmaduro (larvas y pupas) recolectado de recipientes en los que el agua se conservó por períodos superiores a una semana, sin ser renovada como: tanques sin tapa, pipotes, latas, floreros y otros semejantes, ubicados en los solares y preferiblemente en lugares sombreados de los cementerios y algunos jardines de las diferentes localidades, seleccionadas por ser los primeros lugares en reportar la presencia de Ae. albopictus. Para ello, se aplicaron los métodos sugeridos por la Organización Mundial de la Salud, utilizando cucharones, goteros y succionadores (OMS, 1993). El material fue trasladado al Laboratorio de Biología de Vectores y Reservorios del Centro de Estudios de Enfermedades Endémicas y Salud Ambiental (CEEESA), perteneciente al Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios "Dr. Arnoldo Gabaldon" (IAE).

Las larvas colectadas fueron colocadas en cubetas plásticas rotuladas que contenían agua declorada, las condiciones de cría fueron 28ºC +/- 2ºC de temperatura, 70% +/- 5% de humedad relativa y un fotoperiodo de 12:12 (luz: oscuridad). Las larvas fueron alimentadas con un compuesto de Ictiosan® alimento para peces y levadura de cerveza. Las pupas se colocaron en envases plásticos pequeños se introdujeron en una jaula de tela tipo dopiovelo con estructura de hierro, luego fueron llevadas a un ambiente húmedo a 25ºC, una vez en la jaula pasaron a su fase adulta donde los mosquitos quedaron atrapados. En la jaula los mosquitos machos se alimentaron con solución azucarada al 10% y las hembras se alimentaron cada tres días con sangre de Columba livia (paloma doméstica).

Para las oviposturas se introdujo en la jaula un envase plástico de 250 mL el cual contenía papel absorbente blanco y un volumen de agua de 200 mL. El papel absorbente fue retirado en 72 horas y después rotulado con sus respectivos datos de origen, fecha y generación filial. Una vez seco, se almacenó en recipientes de plástico hermético. Posteriormente, un número de huevos suficientes se colocaron en agua para su eclosión y así se repitió el ciclo hasta la obtención de adultos de la generación filial 1, 2 y 3 (F1, F2 y F3) los cuales fueron utilizados para los bioensayos (Alarcon-Elbal et al., 2010)

Organoclorado: DDT (98%), organofosforados: malatión (96%) y fenitrotión (99,5%), piretroide lambdacialotrina (70%), en presentación grado técnico, sin valor comercial, y suministrados por Insecticidas Internacionales Compañía Anónima (INICA®). Los insecticidas fueron evaluados, a la dosis diagnósticas determinadas en el laboratorio de evaluación de insecticidas del CEEESA (Molina de Fernández et al., 2013).

Se realizaron siguiendo el método de las botellas del CDC (Brogdon y McAllister, 1998). Los mosquitos adultos Ae. albopictus fueron expuestos a botellas de vidrio tipo Wheaton de 250 ml, tratadas con soluciones cetónicas de insecticidas, las cuales se usaron como cámaras de prueba para detectar la resistencia o susceptibilidad a los insecticidas en mosquitos adultos. Estas fueron preparadas en el Laboratorio de Evaluación de Insecticidas del

CEEESA, IAE "Dr. Arnoldo Gabaldon" siguiendo metodología estandarizada por Figueroa et al., (2006). Los ensayos se realizaron en el Laboratorio antes referido, a temperaturas aproximadas de 25°C ± 2 y humedad relativa de 55% ± 5. Se expusieron aproximadamente 15 ± 2 mosquitos adultos hembras por botella de tres días de edad entre F1 y F3, alimentados exclusivamente con solución azucarada al 10%. Se evaluaron cuatro réplicas por cada concentración de insecticida y dos réplicas como grupo control en el cual solo se trató la botella con acetona. Cada bioensayo se realizó por triplicado el mismo día de ejecución. Se registró la mortalidad cada 15 min hasta el tiempo en el que se logró el 100% de mortalidad, de esta manera se determinó el efecto del insecticida en función del tiempo de exposición. La mortalidad en el control, entre 5 y 20% se corrigió aplicando la fórmula de Abbot (1925). Se relacionaron las variables tiempo-mortalidad, graficando los porcentajes de mortalidad en el eje de las abscisas (X) y el tiempo en el eje de las ordenadas (Y), haciendo uso de Excel® 97-2003; obteniendo la línea gráfica de la tasa de mortalidad de la cepa a cada insecticida en el mismo plano, correspondiente a la dosis diagnóstica.

La determinación de mecanismos de resistencia a insecticidas in vivo, con el sinergista Butóxido de piperonilo (PB), se realizó solo en aquellas cepas que resultaron resistentes al malatión, por lo que fueron expuestas a una mezcla del insecticida malatión (100 mμ/L) con una concentración subletal de (PB), (1 mμ/L), siguiendo el método de las botellas del CDC (Brogdon & McAllister, 1998). Se calculó el Factor de sinergismo (FS) determinado por el coeficiente de la relación de los valores del tiempo de mortalidad del insecticida solo entre el tiempo de mortalidad de la mezcla insecticida sinergista, cuyo valor mayor a uno (FS > 1) es indicativo de sinergismo, es decir de la inhibición de la actividad enzimática por el sinergista (Vassena et al., 2000).

Situación en la que el insecto se encuentra sin ningún movimiento evidente de cualquier apéndice después de la observación por un mínimo de 3 segundos.

Para determinar in vitro resistencia metabólica y no metabólica (alteración en sitio blanco ACHEi) se realizaron pruebas en placas para microtitulación. Estas consistieron en detectar la presencia de mecanismos de resistencia específicos en insectos individuales que podrían aclarar posibles causas de la resistencia. Cada mosquito fue triturado en 50 μL de solución tampón pH 7,5 y 0,05 M y se le añadió 0,5 mL de la misma solución. Se tomaron alícuotas de 50 μL de cada muestra que fueron colocadas en placas para microtitulación de 96 pocillos. Se evaluaron cinco sistemas enzimáticos que confieren resistencia a insecticidas; esterasas alfa (α) y beta (ß), acetilcolinesterasa normal (AChe), acetilcolinesterasa inhibida (AChei) y oxidasas. Los substratos utilizados en cada caso incluyen alfa y betanaftil acetato para las esterasas no específicas, el yoduro de acetiltiocolina se usó para evidenciar la presencia de la AChe y para la AChei además se utilizó el insecticida carbamato propoxur y para las oxidasas se utilizó el TMBZ (3,3`,5,5`-Tetrametil Benzidina ). Se midieron los valores de absorbancia en un lector de ELISA (Ensayo Inmuno Absorbente Ligado a Enzimas), Multiskan Plus de Fisher Scientific, empleando filtros de 405 nm para AChe y AChei, para las esterasas y oxidasas, se empleó un filtro de 620 nm (Brogdon et al., 1997; Hemingway J. 1998; Figueroa et al., 2006., Molina de Fernández y Figueroa, 2009). A los valores de absorbancia se les aplicó estadística descriptiva, Análisis de Varianza de una sola vía, no paramétrico de Kruskal Wallis a un nivel de significación del 95% (α= 0,05).

En la Fig. 1 se presentan los resultados obtenidos con el insecticida DDT (200 μg/mL ), donde se evidencia que todas las cepas evaluadas presentaron el 100% de mortalidad a los 45 min. En la Fig. 2 se presentan los resultados con el insecticida malation (100 μg/mL), encontrándose que la cepa Santos Michelena (SM) presentó el 100% de mortalidad en el menor tiempo de exposición (30 min), el resto de las cepas expresaron menores porcentajes: 42,6% para Carabobo; 46,2% Distrito Capital (DC); 69,6% Zamora y 75,5%, Mario Briceño Iragorry (MBI). Carabobo y Zamora obtuvieron el 100% de mortalidad a los 45 min; DC y MBI a los 60 min.

En la Fig. 3 se muestran los resultados con el insecticida fenitrotion (100 μg/mL), visualizándose que las cepas SM y Zamora presentaron el 100% de mortalidad en 30 min; el resto de las cepas expresaron valores de: 72,2% para Carabobo; 30,7% Distrito Capital (DC) y 45,8% Mario Briceño Iragorry (MBI). Carabobo mostró el 100% de mortalidad a los 45 min; DC y MBI a los 60 min.

En la Fig. 4 se presentan los resultados al evaluar el insecticida piretroide lambdacialotrina (6,25 μg/mL) encontrándose que cuatro de las cepas evaluadas presentaron el 100% de mortalidad a los 15 min, y la cepa SM presentó el 100% de mortalidad a los 30min.

En las Figs. 5 y 6 se presentan los resultados de la determinación de los mecanismos de resistencia a insecticidas in vivo. Al evaluar la cepa Carabobo (Fig. 5) frente al insecticida malatión solo y con la mezcla malatión + el sinergista (PB), siendo una de las cepas que presentó el menor porcentaje de mortalidad al malatión (42,6% en 30 min). Se evidenció el efecto sinérgico, al obtener en la cepa el 100% de mortalidad en 45 min con el malatión solo y con la mezcla malatión + el sinergista (PB), en 15 min obteniendo un FS=3. En la Fig. 6 se observa en la cepa DC también un efecto sinérgico con una mortalidad a los 60 min con el insecticida solo; y con el sinergista a los 45 min, se obtuvo un FS = 1,3. Los tiempos de mortalidad obtenidos al evaluar el malatión sin PB, disminuyeron como consecuencia de la acción del sinergista tanto en la cepa Carabobo como en la cepa DC.

Las esterasas elevadas han estado involucradas en la resistencia a los insecticidas organofosforados y en menor medida en la resistencia a los piretroides y carbamatos, diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05) en las cepas evaluadas indican que este mecanismo pudiera estar asociado con los valores encontrados de sobrevivencia a los organofosforados. Aun cuando no se hicieron estudios genéticos, el principal mecanismo de resistencia metabólica ocurre debido a un incremento en expresión o actividad de tres de las principales familias de enzimas dentro de las cuales están involucradas las esterasas (Hemingway & Ranson, 2000; Flores et al., 2007). Bioquímicamente, las esterasas actúan uniéndose rápidamente al insecticida secuestrando a este, antes de que llegue a su sitio de acción, lo que requiere altas cantidades de estas enzimas, desencadenando la sobreproducción enzimática y por ende el desarrollo de resistencia (Karunaratne et al., 1993). Los insecticidas organofosforados, al igual que los carbámicos ejercen su acción tóxica mediante la inhibición de la enzima acetilcolinesterasa (AChei) (Saume, 1992). Esta pareciera estar involucrada además de las esterasas como la razón de los valores encontrados en relación a las otras cepas; Carabobo, DC y Zamora. Se desconoce si los individuos que presentaron sobrevivencia a los organofosforados llegaron al país con esa característica o son producto de la presión de selección ejercida por el uso de organofosforados para el control de Ae. aegypti en la región. El sinergista PB potenció la acción del insecticida malatión; mediante la inhibición de la actividad enzimática posiblemente involucrada en el comportamiento de sobrevivencia de los individuos.

Por otra parte, los valores de susceptibilidad encontrados al DDT y al piretroide lambdacialotrina, puede relacionarse con los bajos valores obtenidos de oxidasas, solo la cepa SM que presentó altos niveles de esta enzima, posiblemente relacionados con los valores de sobrevivencia encontrados para este insecticida. Esto en concordancia con lo reportado por González y Salazar (2015), quienes realizaron estudios moleculares de la región ITS2II cromosómica y evidenciaron heterogeneidad en los tamaños de la región ITS2 de los individuos de la población de Santos Michelena (SM), de lo cual se puede inferir que: 1) Los individuos que se encuentran en SM provienen de una población invasora distinta al resto de las poblaciones estudiadas, o 2) Existe una alta tasa de variabilidad intraespecífica en la región ITS2 en esta especie de mosquitos.

Estudios sobre comportamiento frente a insecticidas en Ae. albopictus están pobremente documentados ya que los mismos se han enfocado principalmente en vectores de malaria y dengue, específicamente Ae. aegypti. Se encuentran reportados estudios principalmente en Asia y en menor frecuencia en Europa, África y América, empleando insecticidas biológicos, Bacillus thuringiensis israelensis (Duque & Navarro, 2005), y químicos tales como: temefos, malatión, fenitrotión, permertrina, lambdacialotrina, deltametrina, DDT, propoxur entre otros (Ponlawat et al., 2005; Gómez et al., 2011; Kamgang et al., 2011; Pocquet et al., 2014).

Marcombe et al. (2014), encontraron en Ae. albopictus resistencia al malatión y susceptibilidad a piretroides; el mecanismo involucrado para la resistencia al organofosforado evaluado por sobreexpresión de esterasas (β) y Glutation-S-Tranferasas (GST), reportaron resistencia al DDT, atribuyendo la resistencia a las (GST), asociadas principalmente con la resistencia a DDT (Clark et al., 1984) organofosforados y piretroides (Kostaropoulos et al., 2011; Vontas et al., 2002).

Otro estudio realizado por Kamgang et al. (2011), hallaron susceptibilidad al fenitrotion y resistencia al DDT en Ae. albopictus de África Central, pero no encontraron resistencia cruzada entre DDT y el piretroide deltametrina sugiriendo la participación de la resistencia metabólica y no modificación del sitio diana (IRAC, 2006). Pethuan et al. (2007) encontraron susceptibilidad en Ae. albopictus a los insecticidas: deltametrina, permetrina, fenitrotion y propoxur, obteniendo niveles enzimáticos muy bajos, que se corresponde a su condición de susceptibilidad a los insecticidas evaluados.

Los resultados encontrados en el presente trabajo, constituyen una referencia para el inicio de estudios de resistencia a insecticidas de Ae. albopictus en Venezuela y la región, a fin de contribuir en la eficacia de las medidas de control químico vectorial de esta especie

Los autores del trabajo declaramos que no existen conflictos de intereses.

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