Ana Karina Marcano*, Elizabeth Valdivieso* y Maira Oropeza C.*
* Estudiante de Postgrado en Botánica y Profesores, respectivamente. UCV. Instituto de Biología Experimental. E-mail: anak_marcano@yahoo.com
RESUMEN
Uno de los sistemas de propagación in vitro más utilizado en el cultivo de la caña de azúcar, Saccharum sp., es la embriogénesis somática. Durante este proceso ocurren cambios en la expresión de las proteínas que pueden ser determinados mediante el análisis de patrones isoenzimáticos, permitiendo estos la evaluación temprana de los cultivos embriogénicos antes de que los cambios morfogenéticos se hagan evidentes. En el trabajo se estudió la presencia de la actividad fosfatasa ácida (ACP) a partir de callos embriogénicos (E) y no embriogénicos (NE) de caña de azúcar. Con el fin de detectar esta actividad se realizaron electroforesis en geles de poliacrilamida al 10% en condiciones nativas, incubándose luego el gel en presencia de los sustratos a-naftil fosfato y b-naftil fosfato a pH ácido. Paralelamente, se determinó la misma actividad en ensayos enzimáticos a punto final, con ligeras modificaciones. Los perfiles electroforéticos mostraron una única banda en ambos extractos, no observándose diferencias significativas en la intensidad de las mismas. No obstante, el ensayo enzimático reveló una mayor actividad fosfatasa ácida (1,5 veces) en los extractos de callos E que en los NE. Estos resultados preliminares sugieren que esta actividad podría utilizarse como marcadora de los procesos de diferenciación que ocurren durante el cultivo in vitro.
Palabras Clave: Caña de Azúcar; Saccharum sp.; embriogénesis somática; fosfatasa ácida.
Determination of acid phosphatase activity from embryogenic and non embryogenic sugarcane (saccharum sp.) calluses
SUMMARY
Somatic embryogenesis is one of the in vitro propagation systems used more extensively for sugarcane Saccharum sp., culture. During this process changes in the protein expression patterns are observed and they can be determined using isoenzimatic analysis. This approach allows early evaluation of the embryogenic potential before the morphogenetic changes become evident. In this work, the acid phosphatase activity (PAC) from embryogenic (E) and non embryogenic (NE) calluses of sugarcane was studied. Gel electrophoresis was performed using polyacrylamide 10% gels under native conditions, followed by incubation with a-naftil phosphate and ß-naftil phosphate solutions at acid pH. The same activity was determined on enzymatic assays to end point according to Gottlieb and Dwyer (1981), with some modifications. Electrophoretic profiles showed just one band of the same intensity in each extract. Nevertheless, enzymatic assays revealed a higher acid phosphatase activity (1,5 times) in E callus extracts that in the NE. These preliminary results suggest that acid phosphatase activity could be used as a marker for differentiation processes during in vitro culture.
Key Words: Sugarcane; Saccharum sp.; somatic embryogenesis; acid phosphatase.
]]> RECIBIDO: febrero 20, 2006.INTRODUCCIÓN
La caña de azúcar, Saccharum sp., es un cultivo de importancia económica tanto a nivel mundial como en Venezuela, ya que no sólo se utiliza en la obtención de azúcar, sino también en la producción de alcohol, papel, madera, alimentación animal, etc. Uno de los sistemas de propagación in vitro más utilizado en el cultivo de la caña de azúcar es la embriogénesis somática. Durante este proceso pueden ocurrir cambios en el patrón de expresión de las proteínas, por lo que es necesaria la búsqueda de marcadores bioquímicos que permitan el estudio temprano de los eventos morfogenéticos que ocurren durante la embriogénesis en plantas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Inducción del callo: Para inducir la formación de callos se usaron secciones de hojas jóvenes de plantas de caña de azúcar (Saccharum sp.) de la variedad V75-6, las cuales se sembraron en un medio de cultivo que contenía sales MS (Murashige y Skoog 1962) suplementado con 30 μM de Dicamba, incubándose en oscuridad a 25 ± 1 ºC durante 1 mes, según Marcano et al. (2002).
Extracción de proteínas: Después de 60 días de cultivo, se separó manualmente el callo embriogénico (E) del no embriogénico (NE), 1 g de callo se macero y resuspendió en 6 ml de tampón de extracción (50mM TRIS-HCL (pH 8), 5 % (v/v) glicerol, 0,1 mM EGTA, 0,2 KCL, 1,5% (v/v) PVP y 1% b-mercaptoetanol). El contenido de proteínas solubles se determinó mediante el método de Bradford (1976).
SDS-PAGE: La corrida electroforética se realizó en geles de poliacrilamida al 10% en condiciones nativas, según Laemmli (1970).
Determinación de la Actividad fosfatasa ácida (ACP) en geles: Se llevó a cabo según el método señalado por Glasmann et al. (1988).
Actividad Enzimática: Se realizó el ensayo a punto final, según lo descrito por Gottlieb y Dwyer (1981) con ligeras modificaciones.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
]]> El ensayo enzimático a punto final realizado para determinar diferencias en la actividad fosfatasa ácida en extractos de callos E y NE de caña de azúcar, reveló una mayor actividad (1,5 veces) en el tejido E con respecto al NE (ver Cuadro).CUADRO. Actividad enzimática de extracto de callos E y NE de caña de azúcar. La actividad esta expresada en moles/h/mg de proteínas con un n= 3.
| Extracto de Callo | Actividad Enzimática Específica |
| No embriogénico | 1,876 ± 0,27 |
| Embriogénico | 2,847 ± 0,44 |
Con relación a la determinación de la actividad ACP en geles de poliacrilamida en condiciones nativas, se detecto una única banda en ambos extractos, no observándose diferencias significativas en la intensidad de las mismas (ver Figura), bajo las condiciones de tiempo y pH utilizadas en este ensayo.
]]>
Las diferencias en la actividad ACP entre callos E y NE descritas en este trabajo sugieren que dicha actividad podría utilizarse como marcadora de los procesos de diferenciación que ocurren durante el cultivo in vitro. Estos resultados concuerdan con lo observado por Menéndez-Yuffá y García (1986) quienes detectaron una mayor expresión de la actividad ACP en callos E de café con respecto a los callos NE.
BIBLIOGRAFÍA
1. BRADFORD, M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72:248-254. [ Links ]
2. GLASMANN, B., G. de los REYES and G. S. KHUS 1988. Electrophoretic variation of isozymes in plumules of rice (Oryza sativa L.) a key to the identification of 76 alleles at 24 loci. IRPS Nº 134, November. [ Links ]
3. GOTTLIEB, M. and D.M. DWYER. 1981. Leishmania donovani surface membrane acid phosphatase activity of promastigotes. Exp. Parasitol. 52:117-128. [ Links ]
4. LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685. [ Links ]
5. MARCANO, A.K., P. GUEVARA, M. OROPEZA y E. GARCÍA. 2002. Optimización del proceso de embriogénesis somática en variedades venezolanas de caña de azúcar. Acta científica Venezolana 53:251-257 [ Links ]
6. MENÉNDEZ-YUFFÁ, A. y E. GARCÍA. 1996: Análisis de patrones isoenzimáticos en callos embriogénicos y no embriogénicos de café. fyton. 58:15-22. [ Links ]
7. MURASHIGE, T. and F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15:474-497. [ Links ] ]]>