Norka Alexandra De Lima Méndez*, Maira Oropeza C.**, Andreina Pérez* y Iselen Esther Trujillo Díaz*
Trabajo financiado bajo el proyecto S1 99000106 por aportar el financiamiento de esta investigación.
* Profesores. Universidad Nacional Experimental Simón Rodríguez (UNESR). Laboratorio de Biotecnología Agrícola. Centro de Estudios de Agroecología Tropical (CEDAT). Instituto de Estudios Científicos y Tecnológicos (IDECYT). San Antonio de Los Altos. Apdo. 47925. Caracas 1010A. Venezuela. E-mail: norka11@hotmail.com
** Profesoras. Universidad Central de Venezuela. UCV. Laboratorio de Biotecnología Vegetal. Centro de Botánica Tropical. Facultad de Ciencias. Instituto de Biología Experimental IBE. Apartado 47114. Los Chaguaramos. Caracas 1041A. Venezuela. E-mail: moropeza@ciens.ucv.ve
RESUMEN
En Venezuela, las leguminosas cubren un área aproximada de 180.000 km2 ubicadas sabanas tipo pastizales naturales lo que las hace el principal sustento en la alimentación de la ganadería de carne de la región y de más del 60% del país. Stylosanthes capitata Vog., en específico, posee una alta capacidad de fijar nitrógeno atmosférico y un sistema radicular muy profundo, contribuyendo a la fertilidad y estabilidad de los suelos compactos. Sin embargo, su principal desventaja está en que su tasa reproductiva para la obtención de semillas es muy baja. Ello ha propiciado el establecimiento de varios procesos de regeneración in vitro, los cuales se han desarrollado con gran éxito, obteniéndose gran cantidad de plantas. A pesar de estos avances, esta metodología no ha sido evaluada respecto a la estabilidad genética de las plantas regeneradas, la cual puede determinarse a través del uso de marcadores moleculares. En el trabajo, se estudió la estabilidad genética de plantas de S. capitata Vog., a partir de comparaciones de patrones de bandas de ADN amplificado al azar (RAPDs) entre la planta madre y las plantas “in vitro”, probándose 9 iniciadores de la serie OPC del 15 al 23 (Invitrogen) en un volumen final de reacción de 25 µl. Los resultados obtenidos mostraron amplificaciones de bandas nítidas y reproducibles originando fragmentos de ADN comprendidos entre 21220pb hasta 5000pb y los patrones de bandeo evidenciaron una alta estabilidad genética de las plantas regeneradas a partir del cultivo “in vitro”.
Palabras Clave: ADN; leguminosas; cultivo “in vitro”; estabilidad genética.
Analysis of genetic stability of micropropagated plants of Stylosanthes capitata Vog., using rapds markers
SUMMARY
]]> Legumes in Venezuela cover an area of an approximately 180.000 km2, forming natural pasture savannas that act as a principal source of animal feeding and represents more than 60% of soils all over the country. Stylosanthes capitata Vog., has a high capacity to fasten nitrogen from the atmosphere, and very deep root systems that contribute with the fertility and stability of compact soils. However, the main disadvantage from these plants is their low sexual reproductive ratio, this has led to, the establishment of various in vitro regeneration processes which have been well developed and have permitted the production of big amounts of plants. Despite, all these advances this methodology, has not been evaluated regarding the stability of genetic regenerated plants of in vitro Stylosathes capitata Vog., which can be determinated by the use of molecular markers. In this research, genetic stability of Stylosanthes capitata Vog., was determined via RAPDs comparing DNA banding patterns of in vitro plants with mother plant. DNA extraction was made following Doyle and Doyle protocol, modified by Oropeza in 2001. For amplification, 9 arbitrary primers from the series OPC 15 to 23 (Invitrogen)were used, in a final volume of 25µl reaction. The results obtained demonstrated that all primers tested, produced sharp and reproducible bands originating DNA fragments ranging from 21220pb to 2000pb with a high genetic stability for regenerated plants from in vitro tissue culture.Key Words: DNA; Legumes; Tissue culture; Genetic stability.
RECIBIDO: febrero 20, 2006.
INTRODUCCIÓN
Las leguminosas se encuentran ampliamente distribuidas en todo el mundo. Dentro de ellas, el género Stylosanthes (Aeschynomae Papilionoide) esta conformado por unas 30-40 especies, todas localizadas en las zonas templadas de las regiones tropicales y subtropicales de Suramérica, Latinoamérica, África, Asia y Australia (t´Manneje, 1984). De estas 3040 especies sólo 3 son nativas de África (S. erecta; S. fructicosa; y S. suborbiculata) y sólo una proveniente de Asia (S. sundaica), lo que indica que las restantes 35 especies se encuentran en Suramérica, principal-mente en Brasil, Colombia, Venezuela, etc. (Williams y Gardner, 1984).
Stylosanthes, específicamente en Venezuela se ubica hacia la región de los llanos (180,000 km2) en sabanas tipo pastizales naturales, con una gran adaptación a zonas áridas y condiciones adversas, condiciones típicas de suelos pobres, por lo que los requerimientos de nutrimentos necesarios para la planta son muy bajos. Sin embargo, presentan como una importante desventaja, su tasa reproductiva muy baja, la cual interfiere con su perpetuación como especie, lo que ha justificado la búsqueda de estrategias alternativas de propagación, entre las cuales se menciona el establecimiento de procesos de regeneración in vitro, como la micropropagación (Devarumath et al., 2002).
Algunos trabajos relacionados con la regeneración in vitro de leguminosas incluyen la propagación, han desarrollado gran cantidad de plantas in vitro. Sin embargo, las plantas micropropagadas podrían sufrir ciertas modificaciones en el genoma y producir plantas in vitro diferentes a la planta original. Por lo que la utilización de marcadores basados en polimorfismos de ADN amplificados al azar (RAPDs) aparecen como una alternativa eficiente para realizar la evaluación de plantas in vitro específicamente en éste género (Kazan, 1993).
Desde un punto de vista práctico, la facilidad y rapidez con que los RAPDs pueden ser utilizados para la identificación de polimorfismos en cultivares de la especie S. capitata Vog., pueden detectar un cambio en una sola base en el sitio de unión con el iniciador o la inserción y delección en la región limitada por el iniciadores y también proveen una estrategia alternativa para el marcaje de sitios en el genoma que podrían ser obviados en el mapeo genéticos (Caetano-Anolles et al., 1991; Martín et al., 1991).
Kazan y Manners (1993), identificaron el mapa genético para el género Stylosanthes a partir de cruces adecuados, establecieron una metodología y determinaron la reproducibilidad de los RAPDs y así como realizaron la caracterización genética de loci seleccionados por estos marcadores. Y una de las formas de evaluar la eficacia de cualquier proceso de micropropagación in vitro está dado por la estabilidad genética de las plantas micropropagadas con respecto a la planta madre y una de las metodologías más adecuadas es la evaluación a partir de marcadores moleculares.
El objetivo de este trabajo estuvo dirigido analizar la estabilidad genética de plantas de S. capitata Vog., regeneradas in vitro utilizando marcadores RAPDs, y para ello se desarrollaron una serie de pasos previos como: el ensayo de diferentes metodologías para obtener un ADN apto, determinar la concentración de ADN (ug ul-1) idónea para la óptima amplificación por RAPDs de estos fragmentos de ADN y comparar patrones de amplificación entre una planta madre y las plantas de S. capitata Vog., regeneradas por procesos in vitro.
]]> MATERIALES Y MÉTODOSMaterial Vegetal
Las plantas madres de S. capitata Vog., se obtuvieron en la Estación Experimental “La Iguana” ubicada en Valle de la Pascua estado Guárico Venezuela. Se tomaron plantas en estado vegetativo y en floración y éstas fueron llevadas a vivero en donde se hicieron fertilizaciones y fumigaciones periódicas para su mantenimiento. Igualmente se tomaron plantas obtenidas por organogénesis indirecta en trabajos previos dentro del laboratorio. Estas se obtuvieron en medios MS (Murashige y Skoog, 1962) suplementado con BA (0,5 mg l-1) con un pH en el medio de 5,8 previo a ser esterilizados en autoclave a 120 Atms de presión. Las plantas in vitro fueron mantenidas en cuartos de crecimiento entre (24 ± 2ºC) bajo (16H) de fotoperíodo continuo. Después de haber obtenido cierta cantidad de plantas regeneradas in vitro de S. capitata Vog., se procedió a tomar una muestra al azar para ser analizadas a partir de marcadores moleculares RAPDs.
Extracción de ADN de Stylosanthes capitataVog
Se utilizó (0,1 g) de tejido foliar de cada planta, in vitro e in vivo, previa-mente macerado en un mortero frío con nitrógeno líquido, para la extracción del ADN se utilizó el protocolo de Doyle y Doyle (1990), modificado por Sambrook et al. (1989), para la determinación de la concentración de los ADNs se procedió a la cuantificación por espectrofotometría de la concentración y la pureza de los extractos se dedujo a partir de la relación entre las absorbancia 260/280 nm. Adicionalmente, para corroborar la calidad y la concentración de los ADNs aislados se empleó la técnica de electroforesis en geles 0,8% de agarosa), en (1X) buffer TBE (Tris-borato) y se utilizó bromuro de etidio (0,01ug ul-1) para efectos de tinción. Los extractos originales de cada una de las muestras, se llevaron a una concentración de (50 ng µl-1) en buffer (TE) para las reacciones de PCR.
Análisis a partir de marcadores moleculares RAPDs
Los análisis con marcadores RAPDs fueron llevados a cabo utilizando un set de (9) iniciadores de secuencia nucleotídica arbitraria (>15pb) Invitrogen, Operon Technologies, Inc., Alameda CA, USA. serie OPC (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23), tal como se aprecia en el Cuadro 1. La reacción en cadena de la polimerasa se realizó según Kazan et al. (1993), conteniendo 100ng de ADN a una concentración de (50 ng µl-1). Para un volumen final de reacción de (25 µl), se mezclaron: (10X) buffer de reacción (20 mM) Tris-HCL (pH 8,0), (100 mM) KCL, (0,1 mM) EDTA, (1 mM) DTT, (50%) glycerol, (0,5%) Tween® (20 y 0,5) Nonidet® - P40, (2 mM) MgCl2, (0,2 mM) dNTP’s, (10 picoM) del iniciador, (100 ng) de ADN, (1,0 U) por reacción de Taq Polimerasa de Promega y agua destilada estéril.
Las reacción de amplificación se realizó según Sambrook et al. (1989) bajos las siguientes condiciones de ciclado: Desnaturalización de la molécula por 1 minuto a 94 ºC; 3 ciclos de alineación y alargamiento o extensión de 30seg a 35 ºC; de 1:30 min a 72 ºC y un tercer ciclo de 35 repeticiones de 15 seg a 94 ºC; 35 ºC por 30 seg y finalmente 1:30 min a 72 ºC en la fase de elongación. Los productos de amplificación fueron separados en geles de agarosa (1,8%) Promega USA en buffer (1X) TBE (Trisborato) y se utilizó bromuro de etidio (0,5 ug ml-1) para efectos de tinción y finalmente analizados utilizando un equipo Gel-Doc 2000 (Bio Rad, USA). Todas las reacciones fueron repetidas al menos una vez y sólo se consideraron las bandas nítidas y reproducibles.
IPara establecer si existen o no diferencias a nivel del genoma entre las plantas madres (donadoras de explantes) y las plantas regeneradas in vitro, de S. capitata Vog., in vitro se utilizó el método de RAPDs William y Gardner (1984). Para este análisis, se realizaron amplificaciones del ADN extraído de (12) plantas escogidas al azar, de una población generada a partir de un proceso de organogénesis directa.
]]> RESULTADOS Y DISCUSIÓNDe acuerdo a esta investigación, la obtención de los 11 diferentes ADNs se determinó a partir de la combinación de varios métodos: Sambrook (1989); Doyle y Doyle (1990) y Oropeza (2001). Con la utilización de esta combinación se obtuvieron ADN´s aptos para su amplificación por PCR. En la Figura 1 se muestran ADNs genómicos extraídos de 4 plantas regeneradas in vitro en un gel de agarosa (0,8%) y en el Cuadro 2 se muestra la pureza de los ADNs aislados con valores se absorbancia entre (1,8 y 2,0), lo que indica que están libres de polisacáridos, ácido ribonucleico (ARN) y/o cualquier elemento que interfieran con la amplificación de los marcadores tipo RAPDs.
Con los iniciadores seleccionados se logró obtener patrones de amplificación para las 11 muestras, utilizando los iniciadores OPC 15 al 23 (Cuadro 1). Las amplificaciones de los ADNs de las 10 plantas regeneradas in vitro, y 1 planta madre, con las condiciones de ciclado establecidas por Kazan et al. (1992), generaron un total de (95) fragmentos de ADN nítidos y reproducibles, con un peso molecular que va desde 1000pb hasta 15000pb. El rango total del número de fragmentos obtenidos fue entre 4 bandas (OPC 17) y 14 bandas (OPC 20 y 22) con los iniciadores (OPC 15, 16, 18, 19, 21y 23) se obtuvieron un promedio de 11 fragmentos de ADN por cada iniciador (Ver Cuadro 3).
Por otro lado, de los (9) iniciadores probados todos generaron patrones con bandas monomórficas en las (11) plantas, confirmando la uniformidad genética de las plantas regeneradas in vitro (Figuras 2). Un ejemplo de los productos de amplificación generados con los iniciadores (OPC 18, 20 y 22) revelaron patrones de bandas que van desde 1000pb hasta 20000pb (Figuras 2). Finalmente del total de 95 bandas obtenidas en la amplificación con los 9 iniciadores utilizados en las 11 plantas analizadas fueron bandas monomórficas y ninguno de los iniciadores utilizados produjo patrones de bandas polimórficas (0%).
Los resultados demuestran que los marcadores RAPDs pueden ser utilizados para determinar la estabilidad genética de plantas de S. capitata Vog., obtenidas por procesos in vitro, aunque solo se probaron 9 iniciadores con muy pocos ADNs de plantas (11), se observó un muy bajo nivel de polimorfismo en las plantas regeneradas comparado con la planta madre, lo que determinaría como un indicio de estabilidad genética de plantas in vitro de S. capitata Vog. Sin embargo, con los resultados aquí señalados, no se puede asegurar que existe una verdadera estabilidad genética en las plantas regeneradas, ya que es necesaria la utilización de una mayor cantidad de plantas y aumentar el número de iniciadores para determinar si realmente el proceso de micropropagación utilizado es estable genéticamente.
Estos resultados se contraponen a lo expuesto por dos autores Brown et al. (1993); Rani y et al. (1995), que apoyan la hipótesis de la ocurrencia de un cierto grado de variabilidad genética inducida por el cultivo de tejido; estos consideran que si existe una variabilidad que es generada por el proceso de cultivo in vitro, y por ello esta se debe verificar con el fin de evaluar los procesos de micropropagación (Chen et al., 1998).
]]> Sin embargo, algunos estudios de estabilidad genética de plantas, micropropagadas de Picea mariana (Isabel et al., 1993), P. Abies (Fourre et al., 1997), y algunas otras especies (Rani y Raina, 1998) han hecho gran énfasis en que las plantas regeneradas por procesos in vitro, pueden no ser exactamente iguales al genotipo madre, pero esto no indica que estas sean diferentes en su fenotipo. Tal es el caso del estudio realizado por Devarumah et al., en el 2002 con plantas micropropagadas de té proveniente de China e India, sólo dos de los clones obtenidos presentaron una estabilidad genética completa durante el proceso de micropropagación, lo que en el contexto de la comercialización indicó que aunque las plantas no eran genéticamente idénticas, no hubo diferencias significativas en cuanto a las características comerciales del té.Por otro lado, los resultados concuerdan con los realizados por Rani et al. (1995), en el cual determinaron la estabilidad genética de 23 plantas de Populus deltoides regeneradas por procesos de micropropagación, para ello utilizaron 11 marcadores y como resultado obtuvieron que sólo 5 de los iniciadores generaron polimorfismos entre 6 plantas regeneradas, mientras que el resto de las plantas fueron monomórficas para los demás iniciadores, demostrando entonces una cierta estabilidad genética de las plantas micropropagadas (Rani et al., 2000).
En conclusión, en este trabajo se pudo establecer la metodología para el análisis de la estabilidad genética de plantas de S. capitata Vog., obtenidas por procesos de micropropagación. Los patrones obtenidos con los 9 iniciadores seleccionados (OPC 15-al 23), no revelaron variaciones en ninguna de las plantas regeneradas comparadas con la planta madre, lo que permitió considerar que los marcadores RAPDs son idóneos para detectar variaciones por procesos in vitro y evaluar la estabilidad genética de la plantas.
Se recomienda para investigaciones futuras aumentar tanto el tamaño de la muestra de plantas in vitro e in vivo como el número de iniciadores a utilizar para con el fin de establecer una verdadera existencia de la estabilidad genética de estas plantas y la información pueda ser generalizada para el proceso de micropropagación en la especie S. capitata. Vog.
AGRADECIMIENTO
A la Estación Experimental “La Iguana” por donar el material vegetal utilizado en esta investigación. A la Universidad Nacional Experimental “Simón Rodríguez” y a la UCV –IBE por permitir el desarrollo de esta investigación.
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