0004-06220004-0622S0004-062220090004000080012200900122009594402406Detección de Bacillus cereus toxigénicos en productos lácteos con especias y leches deshidratadas colectadas en Costa Rica
Walter Blanco, María Laura Arias, Cristian Pérez, César Rodríguez, Carolina Chaves
Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica; Hospital Nacional de Niños Dr. Carlos Sáenz H. San José, Costa Rica; Hospital Tomás Casas, Puerto Cortés, Puntarenas, Costa Rica
RESUMEN
Bacillus cereus es un bacilo Gram-positivo de amplia distribución en la naturaleza y asociado a diversos tipos de alimentos que, bajo ciertas circunstancias causa patologías de diversa índole. Se han descrito cepas diarrogénicas y eméticas basándose en el tipo de toxinas producidas. Con el fin de determinar el riesgo de salud que representa en esta bacteria, se determinó el potencial toxigénico de cepas aisladas a partir de quesos maduros con especias, quesos crema con especias y leches deshidratadas expendidas en San José, Costa Rica, mediante un PCR múltiple con oligonucleótidos específicos para los genes codificantes de las toxinas HBL y Nhe. A partir de 45 muestras recolectadas, se obtuvieron 15 aislamientos de B. cereus, (60% provenientes de queso crema con especias, 7% de leche deshidratada y 13% de queso maduro con especias). Todas las cepas estudiadas presentaron al menos uno de los genes analizados, seis de ellas provenientes de leches deshidratadas y quesos crema, exhibieron evidencia molecular de los genes nheB, nheA, nheC, hblD, hblA y hblC lo cual permite confirmar la correlación descrita para la presencia de los operones codificantes para la HBL y la Nhe. No obstante, la no detección de un gen no puede considerarse como prueba definitiva de su ausencia dado que existen polimorfismos en las secuencias de los genes aquí analizados. Los resultados demuestran que múltiples cepas de B. cereus encontradas en lácteos comprados en Costa Rica contienen los genes necesarios para sintetizar toxinas, por lo tanto es importante el manejo adecuado de estos productos ya que eventualmente pueden representar un riesgo para la salud pública.
Toxigenic Bacillus cereus detection in lactic products with spices and dehydrated milk collected in Costa Rica.
SUMMARY
Bacillus cereus is a Gram positive rod widely distributed in nature and associated to different types of food that, under some circumstances, may cause pathology to human beings. Diarrheic and emetic strains have been described based on the type of toxins produced. In order to determine the risk to health represented by this bacteria, the toxigenic potential of strains isolated from cheese with spices, spread cheese with spices and dehydrated milk, all sold in San José, Costa Rica, were determined using a multiplex PCR technique with oligonucleotides specific for the genes coding toxins HBL and Nhe. From 45 samples collected, 15 isolates of B cereus were obtained (60% coming from spread cheese with spices 7% from dehydrated milk and 13% from cheese with spices). All the strains analyzed presented at least one of the genes analyzed; six of them, coming from dehydrated milk and spread cheese, showed molecular evidence of the genes nheB, nheA, nheC, hblD, hblA y hblC, confirming the correlation described for the presence of operons codifying for HBL and Nhe. Nevertheless, the no detection of a gene cannot be considered as a definitive proof of its absence, given the existence of polymorphism in the sequences of the genes analyzed. The results obtained show that multiple of the B cereus strains found in lactic products from Costa Rica have the necessary genes for synthesizing toxins, so the correct handling of these products is very important since they can represent a risk for public health.
Bacillus cereus es un bacilo Gram-positivo ubicuo que bajo ciertas circunstancias causa patologías de diversa índole (11,12). Este microorganismo se ha aislado a partir de productos lácteos, incluyendo leches deshidratadas (6,8), especies (1,9), comidas deshidratadas, arroz hervido, arroz frito, pastas, carne, pollo, postres, sopas, ensaladas y vegetales (3,6).
Las cepas diarreogénicas asociadas a brotes alimenticios e infecciones oportunistas sintetizan un complejo de enterotoxinas que incluyen la enterotoxina T (BcET), la hemolisina BL (HBL), la enterotoxina no hemolítica (Nhe) y la citotoxina K (CytK) (2,10), así como una toxina emética conocida como cerúlida (5). Las enterotoxinas arriba mencionadas, que son termolábiles y susceptibles a la degradación proteolítica, pueden encontrarse en los alimentos o ser sintetizadas por la bacteria dentro del intestino delgado de los humanos (3,4). La toxina emética, por el contrario, resiste más de una hora a 150ºC (14), lo cual hace que sea posible encontrarla activa en productos que durante su manufactura son sometidos a elevadas temperaturas, como es el caso de las leches deshidratadas.
En este trabajo determinamos el potencial toxigénico de cepas de B. cereus aisladas a partir de quesos maduros con especias, quesos crema con especias y leches deshidratadas expendidas en San José, Costa Rica mediante un PCR múltiple con oligonucleótidos específicos para los genes codificantes de las toxinas HBL y Nhe. Lo anterior con el fin de dilucidar si el consumo de estos productos se asocia a un riesgo sanitario.
MATERIALES Y METODOS
Colecta y manipulación de las muestras
Se analizaron 12 muestras de queso maduro con especias, 12 muestras de leche deshidratada y 21 muestras de queso crema con especias de producción nacional e importadas compradas en San José, Costa Rica (Tabla 1). Las muestras fueron transportadas al laboratorio en refrigeración, almacenadas a 4ºC y analizadas en un máximo de 24 horas post-colecta. Diferentes lotes fueron analizados por triplicado.
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Aislamiento e identificación de Bacillus cereus
Se utilizó la metodología descrita en el Compendio de Métodos para el Examen Microbiológico de Alimentos para el aislamiento de Bacillus cereus partir de productos lácteos (3). En breve, 25 g del alimento se mezclaron con 225 mL de Agua Peptonada Estéril (APE) 0,1% en un homogenizador tipo Stomacher (IUL Instruments, Barcelona). De esta suspensión se hicieron tres diluciones decimales y de cada dilución se inoculó 1 mL en 3 tubos de Caldo Tripticasa Soya (CTS) con Polimixina B (0.06 mg/m). Una alícuota de aquellos tubos que presentaron turbidez tras una incubación de 24 ± 2h a 35 ± 1ºC fue inoculada en placas de agar Manitol–Yema de huevo–Polimixina (MYP). Las colonias grandes, planas, secas, rosadas y rodeadas de un halo que aparecieron después de incubar los platos a 35 ± 1ºC por 24 ± 2h fueron identificadas presuntivamente como Bacillus cereus si daban una reacción positiva en la tinción de Gram, catalasa, fermentación de glucosa, movilidad y reducción de nitratos y una reacción negativa en las pruebas de oxidasa e indol. Esta identificación se confirmó con la batería de carbohidratos API CH50 y el software de identificación APILAB (Biomeriux®). Para descartar la presencia de Bacillus thuringiensis en la colección, se buscaron inclusiones parasporales cristalinas en cultivos esporulados teñidos con azul de Coomasie (3,75% en una mezcla 1:1 de ácido acético y etanol). Todos los aislamientos se crioconservaron a -20ºC en caldo infusión cerebro corazón suplementado con 20% de glicerol.
Detección de los genes hblA, hblD, nheA, nheB y net mediante PCR
Los genes de las enterotoxinas HBL y Nhe se detectaron mediante un PCR múltiple que utilizó ADN extraído mediante choque térmico como molde. Para esto, una colonia recuperada a partir de platos de agar MYP incubados por 24 horas a 35ºC fue resuspendida en 500 µL de solución tamponada de fosfatos ajustada a pH = 6.8 (PBS) e incubada durante 20 minutos a 95ºC. Los detritos celulares fueron removidos mediante centrifugación a 4°C por 10 min. Las reacciones de amplificación estuvieron compuestas por 2 µM de los oligonucleótidos HBLA1, HBLA2, L1A, L1B, nheA 344, nheA 843, nheB 1500 S, nheB 2269 A, nheC 2820 S y nheC 3401 A (7), 5 µL del ADN extraído por choque térmico, 25 µl del ready-to use 2X mastermix (Fermentas®) y la cantidad correspondiente de agua para alcanzar un volumen final de 50 µL. El programa de amplificación incluyó 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC por 15 segundos, un paso de alineación a 55ºC por 45 segundos y un paso de extensión a 72ºC por 2 minutos. Como control positivo se usó la cepa Bacillus thuringiensis var. aizawai HD 137 la cual presenta todos los genes para las toxinas HBL y Nhe, y como control negativo se empleó la cepa Eschericha coli ATCC 25922. Los productos de PCR se evidenciaron en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de etidio a una concentración final de 0,0005 mg/mL. Se utilizó el marcador de peso molecular 50 pares de bases (Fermentas®)
RESULTADOS
Las 45 muestras colectadas dieron lugar a 15 aislamientos de B. cereus (Tabla 2). En detalle, se aislaron B. cereus en 2 quesos maduros con especias (13.3%), 9 quesos crema con especias (60%) y 4 muestras de leche deshidratada (26.6%).
Los quince aislamientos presentaron al menos uno de los genes analizados (Tabla 3). Las cepas LD2, LD3, LD5, QC5, QC7 y QC8, provenientes de leches deshidratadas y quesos crema, exhibieron evidencia molecular de los genes nheB, nheA, nheC, hblD, hblA y hblC. En los aislamientos a partir de quesos crema QC1, QC2 y QC6 no se detectaron los genes nheC ni hblC. En la cepa de queso crema QC3 se evidenciaron los genes nheA, nheC y hblA. En las cepas LD4, Q1, Q2 y QC4, recuperadas a partir de leche deshidratada, queso maduro y queso crema, se detectaron únicamente los genes nheB y nheA. Finalmente, el aislamiento QC9 de queso crema contiene los genes nheA y nheC.
DISCUSION ]]>
El aislamiento de B. cereus en queso crema con especias (60%) y leche deshidratada (27%), resulto más frecuente que en quesos maduros con especias (13%). La elevada frecuencia de aislamiento de B. cereus a partir del primer tipo de muestra puede deberse a su alto contenido de grasa, ya que este factor confiere protección a las bacterias frente a los tratamientos reductores de la carga microbiana (14,15). De igual forma, la actividad de agua (Aw) de este producto puede favorecer la germinación de esporas (6). En el caso de las leches deshidratadas, las esporas presentes en estado de latencia pudieron haber sobrevivido los tratamientos térmicos implicados en el proceso de manufactura (6) y para los quesos con especias su menor positividad podría explicarse debido a que se analizaron quesos maduros, los cuales como es conocido, llevan un proceso durante el cual el pH de los mismos desciende a niveles que la mayoría de los patógenos no toleran.
La Nhe es una toxina que requiere la expresión de todos sus genes para que se genere un producto con actividad biológica (8,4). Basado en lo anterior, es posible inferir que 2 aislamientos (QC3 y QC9) no sintetizan toxinas activas. Por su parte, la actividad biológica de la HBL se manifiesta con tan sólo uno de los genes codificantes, sin embargo, dicha actividad se ve incrementada de forma proporcional al número de componentes expresados (2). Con base en lo anterior, es de esperar que las 6 cepas que presentaron dos genes de la HBL presenten mayor actividad biológica que la que presentó solo uno de los genes o las que no presentaron ninguno. En este trabajo se confirma la correlación descrita para la presencia de los operones codificantes para la HBL y la Nhe (7), ya que 6 de los 15 aislamientos con genes para la toxina HBL también tenían genes para Nhe. Finalmente, queremos destacar que la no detección de un gen no puede considerarse como prueba definitiva de su ausencia dado que existen polimorfismos en las secuencias de los genes aquí analizados (2,13).
Los resultados demuestran que múltiples cepas de B. cereus encontradas en lácteos comprados en Costa Rica contienen los genes necesarios para sintetizar toxinas, por lo tanto es importante el manejo adecuado de estos productos ya que eventualmente pueden presentar cepas de Bacillus cereus, con potencial patógeno, implicando un riesgo si se le brindan las condiciones apropiadas para que alcancen un número capaz de producir un cuadro clínico.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen la valiosa colaboración de nuestras compañeras Laura Villalobos Soto y Florencia Antillón Guerrero.
REFERENCIAS
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Aislamiento e identificación de Bacillus cereus 
