Maria García Amado*, Mónica Contreras*, Samanthy Cedeño W*. Abu Al Soud**, T. Wadstrom**, Pulchérie Gueneau*.
*Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Miranda, Venezuela.
**University, Lund, Sweden.
Para cualquier información o separata contactar a la: Dra. Pulchérie Gueneau. Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Miranda, Venezuela. E-mail: pgueneau@ivic.ve
RESUMEN
Reportamos el caso de un paciente que sufre de síntomas recurrentes de dispepsia desde el año 1997, pero no esta infectado por Helicobacter pylori, el agente etiológico de la gastritis en humanos. El diagnostico de H. Pylori fue realizado por tres métodos: histología, test de ureasa rápido en biopsia gástrica y test de HpSA (Meridian Diagnostics, Italy) en heces. La detección de Candidatus W. africanus fue realizada a partir de ADN de jugo gastroesofagal colectado con un Enterotest (HDC, USA), utilizado un ensayo de PCR con cebadores específicos para el genero Helicobacter. El producto amplificado fue analizado mediante un gel de electroforesis en gradiente desnaturalizante (DGGE) y posteriormente fue secuenciado. Encontramos que este paciente está infectado con Candidatus Wolinella africanus, un posible nuevo patógeno del tracto digestivo humano, el cual ha sido reportado por primera y única vez en Diciembre 2003 en pacientes Surafricanos con cáncer de esófago.
SUMMARY
We reported the case of a patient who suffers of recurrent symptoms of dyspepsia since 1997, but is not infected by Helicobacter pylori, the etiological agent of gastritis in humans. Diagnose of H. Pylori was made by three methods: histology, fast ureasa test in gastric biopsy and HpSA test (Meridian Diagnostics, Italy) in feces. The detection of Candidatus W. africanus was made from DNA of gastroesophageal juice collected with a Enterotest (HDC, USA), using a PCR test with specific boots for Helicobacter gender. The amplified product was analyzed by means of an electrophoresis gel in denatured gradient (DGGE) and later sequenced. We found that this patient is infected with Candidatus Wolinella africanus, a possible new pathogen of the human digestive tract, which has been reported for the first and only time in December 2003 in south African patients with esophageal cancer.
Fecha de Recepción Sep. 2005- Fecha de Revisión Abr. 2006- Fecha de Aprobación. Jun. 2006
]]> INTRODUCCIÓNEl género Wolinella esta representado actualmente por una sola especie encontrada en el rumen de bovinos denominada Wolinella succinogenes (Wolin et al. 1961). El género Wolinella pertenece a la subclase épsilon de las proteobacterias y junto con el género Helicobacter forman la Familia Helicobacteraceae.
Originalmente Wolinella succinogenes fue descrita como un simbionte del rumen de bovinos. La secuencia del genoma de Wolinella succinogenes mostró que ésta especie posee un gran número de genes de virulencia homólogos con Helicobacter pylori y Campylobacter jejuni, lo cual cuestiona su carácter de organismo no patógeno (Baar et al 2003). Recientemente en Sudáfrica, se describió una posible nueva especie de Wolinella asociada a cáncer de esófago, mediante la secuencia parcial del gen del ARNr 165 (Bohr et al 2003). Los autores no pudieron cultivar esta especie y la denominaron Candidatus Wolinella africanas. El objetivo de este estudio es reportar la presencia de Candidatus Wolinella africanus en el jugo gastro-esofagal de un paciente venezolano.
MATERIALES Y MÉTODOS
Paciente: El paciente es una mujer venezolana de 27 años de edad que muestra síntomas de dispepsia desde 1997. La paciente fue informada de los objetivos de nuestro estudio, donó muestras de heces y jugo gástrico, y autorizó la publicación de los resultados.
Métodos de detección de la infección por H. pylori: Los métodos utilizados para detectar una posible infección por H. pylori en el paciente fueron: histología y test de ureasa rápido en biopsia gástrica (Pacheco 2001), test de detección de antigenos en heces HpSA (Meridian Diagnostics, Italia), y detección por PCR en ADN de jugo gastro-esofagal con cebadores específicos del gen urea (Domínguez-Bello et al. 2001), y detección en ADN de jugo gastro-esofagal por PCR-DGGE con cebadores específicos del genero Helicobacter (Domínguez-Bello et al 2001, Al-Soud et al,, 2003).
Método de detección de la infección por Candidatus Wolinella africanus: La detección de Candidatus Wolinella africanus fue realizada utilizando ADN de jugo gastro-esofagal colectado con un Enterotest (FIDC, USA) (Domínguez-Bello et al. 2001). Las condiciones de PCR, DGGE y secuenciación fueron descritas por Al-Soud y colaboradores (Al-Soud et al. 2003). El fragmento obtenido por PCR-DGGE fue secuenciado y la secuencia fue comparada con las secuencias de la base de datos GenBank utilizando el programa BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Brevemente, se amplifica una región del gen del ARNr 16S con cebadores específicos del género Helicobacter, y el producto amplificado es analizado en un gel de electroforesis en gradiente desnaturalizante (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE), el cual separa los amplicones por su contenido en CC, y permite detectar infecciones múltiples por diferentes especies de un mismo género. El patrón de movilidad en el gel esta compuesto por amplicones obtenidos con los mismos cebadores a partir ADN de diversas especies conocidas de Helicobacter, incluyendo H. pylori. Las bandas separadas se extraen del gel y se secuencian directamente.
RESULTADOS
El caso reportado en este estudio es de una mujer venezolana de 27 años de edad con síntomas de dispepsia desde el año 1997. Todos los métodos de diagnóstico específico para H. pylori y para Helicobacter sp. fueron negativos, y la paciente nunca recibió ningún tratamiento antibiótico contra H. pylori. Los síntomas de dispepsia reaparecen periódicamente al menos una vez al año y son tratados con ranitidina.
La Figura 1 muestra los resultados de la detección de la infección por Helicobacler sp. por PCR en un gel de electroforesis en gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE) (Al-Soul et al. 2003). En la muestra del paciente que nos interesa, aparece una banda (señalada con una flecha roja) con un contenido de CC diferente al patrón de referencia (M) compuesto por amplicones obtenidos de diversas especies de Helicobacter, incluyendo H. pylori. La secuencia de la banda es idéntica (99% identidad) con la secuencia parcial del gen del ABNr 16S de Candidatus W. africanus.
]]> Figura 1. Resultados de la detección por Helicobacter spp. Por PCR en un gel de electroforesis en gradiente desnaturalizante (PCR-DGGE). El asterisco rojo indica el pozo donde fue colocada la muestra de la paciente y la flecha roja indica la banda que fue secuenciada y es 99% idéntica a la secuencia de Cadidatus Wolinella africanus. El patrón de referencia (M) está compuesto por amplicones obtenidos de diversas especies de Helicobacter que se señalan a la derecha del gel. Los demás pozos contienen muestras de otros pacientes, infectados con diferentes especies de Helicobacter.CONCLUSIÓN
Candidatus W. africanus ha sido detectado por PCR en pacientes de Sudáfrica con cáncer de esófago y puede ser un nuevo patógeno gástrico emergente (Bohr et al. 2003). Nuestros resultados indican que Candidatus W. africanus esta presente en una paciente venezolana con síntomas de dispepsia, la cual no está infectada con H. pylori. Sería recomendable determinar la prevalencia de este microorganismo en Venezuela y tratar de cultivar esta bacteria para poder caracterizarla microbiológicamente y bioquímicamente.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFÍCAS
1.- Al-Soud WA, Bennedsen M, On SL, Ouis LS, Vandamme P, Nilsson HO, Ljungh A, Wadstrom T. 2003. Assessment of PCR-DGGE for the identification of diverse Helicobacter species, and application to faecal samples from zoo animais to determine Helicobacter prevalence. J Med Microbiol. 52(Pt 9):765-71. [ Links ]
2.- Baar C, Eppinger M, Raddatz G, Simon J, Lanz C, Klimmek O, Nandakumar R, Gross R, Rosinus A, Kelier H, Jagtap P, Linke B, Meyer F, Lederer H, Schuster SC.2003. Complete genome sequence and analysis of Wolinella succinogenes. Proc NatI Acad Sci U S A. 100(20):11690-5. [ Links ]
3.- Bohr UR, Segal L, Primus A, Wex T, Hassan H, Ally R, Malfertheiner P. 2003. Detection of a putative novel Wolinella species in patients with squamous cell Carcinoma of the esophagus. Helicobacter. 8(6):608-12. [ Links ]
4.- Pacheco, NI 2001. Detección molecular de infección por Helícobacter pylori y del gen bacteriano asociado a virulencia cagA, en pacientes Venezolanos. Tesis de maestría, Caracas, Venezuela! -68. [ Links ]
5.- Domínguez-Bello, MG., C. Cienfuentes, R. Romero, P. García, L. Gómez, V. Mago, N. Reyes y P Gueneau 2001. PCR detection of Helicobacter pylori in string-absorbed gastric juice. FEMS Microbiol. Lett, 198 :15-16. [ Links ]
6. - Wolin MJ, Wolin EA, Jacobs NJ. 1961. Cytochrome-producing anaerobic Vibrio succinogenes, sp. n. J Bacteriol. 81 :911-7. [ Links ] ]]>