Criptosporidiosis experimental en ratones albinos

tratados con Metilprednisolona

María del P. Hurtado^*,1, Elizabeth  Bruzual^**, Lucila  Arcay^***,

María A. de la Parte^* y Ana Brito^**

^*Cátedra de Microbiología, Escuela de Enfermería, Facultad de Medicina, UCV.

^**Escuela de Medicina “José María Vargas”, Facultad de Medicina, UCV.

^***Instituto de Zoología Tropical, Facultad de Ciencias, UCV

Resumen

Cryptosporidium spp., es un coccidio intracelular de distribución mundial responsable de un síndrome entérico en el hospedador inmunocompetente e inmunocomprometido. Se estudio la influencia inmunosupresora de la metilprednisolona (MP) en la evolución de la criptoporidiosis experimental en ratones de laboratorio. Se utilizaron dos grupos de cuatro ratones machos jóvenes cada uno; el primer grupo incluyó cuatro ratones infectados y tratados en forma interdiaria con MP a dosis de 16 mg/kg de peso durante cuatro semanas y el segundo grupo (control) cuatro ratones infectados y no tratados. El inóculo fue preparado a partir de Cryptosporidium spp. obtenido de un paciente con criptosporidiosis intestinal, administrando un volumen de 0,1 mL a través de una sonda oro-esofágica. Cada semana, se recogieron muestras de heces para realizar diagnóstico de criptosporidiosis intestinal mediante la coloración de Kinyoun. Se estudió la diseminación visceral del parásito tomando semanalmente un animal de cada grupo para necropsia, obteniéndose muestras de cada órgano para estudio histopatológico. Las formas parasitarias observadas, en tejidos, fueron como sigue: ooquistes, esporozoítos falciformes, formas sexuales, merozoítos libres y trofozoítos. Durante las cuatro semanas de estudio, la forma parasitaria predominante fue la de merozoíto libre. Se observó diseminación tisular en tráquea, glándula tiroides, intestino, bazo y ganglio linfático. No se observó el parásito en esófago, hígado, riñón y pulmón. En el grupo control la presencia del parásito se mantuvo limitada al intestino. La supervivencia de los animales fue del 100% en ambos grupos durante el período de estudio. La respuesta observada en los animales tratados con MP se expresó de manera evidente en la diseminación tisular del parásito en órganos distintos del aparato digestivo, efecto no demostrado en los animales infectados y no tratados.  Sin embargo, el número total de formas parasitarias cuantificadas, no presentó diferencias notables durante las cuatro semanas que duró el experimento, pero si pudo demostrar que no es necesario un alto grado de inmunosupresión para que Criptosporidium spp. produzca formas  extra-intestinales de la criptosporidiosis.

Palabras clave:  Cryptosporidium, Salud pública, Ratones, Inmunodepresores, Heces

Experimental Cryptosporidiosis in Albino Mice Treated with Methylprednisolone

Cryptosporidium spp. is an intracellular coccidium distributed worlwide, which is responsible for an enteric syndrome in the immunoincompetent and immunocompromised host. This investigation was conducted to study the immunosuppressing influence of methylprednisolone (MP) during the course of experimental cryptosporidiosis in albino mice. A total of eight young male albino mice were studied and alloted into two groups: Group I: four infected mice treated every other day with a oral dose of 16 mg/kg of body weight of MP given through a stomach tube for four weeks; Group II (Control Group): four infected but untreated mice. A volume of 0.1 mL of an inoculum prepared from Cryptosporidium spp., obtained from stools of a patient with enteric cryptosporidiosis was given via a stomach tube. Every week, stool samples were collected for a diagnosis of intestinal cryptosporidiosis using the Kinyoun staining. The visceral dissemination of  the parasite was studied by sampling weekly one animal of each group, and  obtaining necropsy samples of each organ for histopathological examination. The parasitic forms observed in tissues were as follows: oocysts, falciform sporozoites, sexual forms, free merozoites, and trophozoites. The parasitic forms that prevailed during the experiment were the free merozoites. Parasitic dissemination to trachea, thyroid gland, intestine, spleen, and lymphatic ganglion was seen. In contrast, the parasite was not observed in esophagus, liver, kidneys and lungs. In Group II, the presence of the parasite was confined to the intestines. Mice survival was 100% for both groups during the study period.The results show that the observed response of animals treated with MP was evident with the parasite dissemination in organs other than the digestive tract, effect not shown in animals from Group II.  Nonetheless, the total number of parasitic forms did not show overt differences during the duration of the experiment, although it was demonstrated that a high degree of immunosupression is not required to allow for the Cryptosporidium spp. dissemination in the extraintestinal forms of this disease.

Key words: Cryptosporidium, Public health, Mice, Immunosuppressants, Faeces

Recibido: 05/08/10 - Aprobado: 15/12/10

Introducción

El alto potencial oportunista de Cryptosporidium spp. y la cronicidad y gravedad eventual de la infección en individuos inmunocomprometidos, han acentuado su importancia como un problema de salud pública global (Chacín-Bonilla y Cheng, 2008).

Además del síndrome diarréico clásico, se han asociado otras manifestaciones clínicas a la criptosporidiosis (Current y García, 1991; de la Parte-Pérez et al., 2005) por su capacidad de diseminación a órganos y tejidos, especialmente en el hospedador inmunosuprimido, habiendo sido demostrada la presencia de este coccidio en muchos órganos y sistemas de la economía, además del intestino. Entre los más frecuentemente descritos están la vesícula y el árbol biliar, el hígado, el páncreas y el sistema respiratorio, principalmente, especialmente en pacientes con infección por VIH/SIDA (Vakil et al., 1996; Montero et al., 2001; Souza et al., 2004; Corti et al., 2008).

Para estudiar la criptosporidiosis en el hospedador inmunocomprometido, se planteó utilizar un modelo animal experimental de inmunosupresión (Wang et al., 2001) que permitiese inferir el comportamiento de esta parasitosis en el humano, por lo que se decidió utilizar la metilprednisolona (MP) como agente farmacológico inmunosupresor (Boumpas et al.,1993).

Los corticosteroides son moléculas que disminuyen la linfopoyesis de los linfocitos B, e intervienen en el desarrollo ontogénico y selección del repertorio de los linfocitos T. Además, tienen una acción anti-inflamatoria importante ya que inhiben muchas funciones de los linfocitos TH1 y macrófagos e igualmente reducen la producción de citocinas TH1. También, afectan la recirculación de células principales y accesorias y pareciera que incrementan el número de células TH2 e inducen la apoptosis de timocitos durante su maduración (Mora de Orta y Corado, 2003).

Los efectos antiinflamatorios e inmunosupresores de los glucocorticoides son ejercidos mediante acción sobre las células del sistema inmune. A nivel de monocitos y macrófagos, inhiben la producción de interleucinas (IL), entre ellas: IL-1, IL-6 y el factor de necrosis tumoral a (TNF-a). Sobre linfocitos T y B, con predominio de acción sobre los linfocitos T, afectan la producción de citocinas (IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, TNF-a, factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos (GM-CSF) y el interferón gamma (Krenski et al., 2003; Schimmer y Parker, 2003).

La metilprednisolona es un glucocorticoide el cual, entre sus principales características está el efecto anti-inflamatorio importante e inmunosupresor, actuando sobre linfocitos, macrófagos, basófilos y células endoteliales. Ha sido utilizada como droga de primera línea para el control del rechazo agudo en la terapia de trasplantes de órganos, principalmente renales y hepáticos (Volpin et al., 2002). También es de utilidad en el control de enfermedades autoinmunes y se describe su uso en casos de complicaciones neurológicas del lupus eritematoso sistémico (Boumpas et al., 1993).

En la terapia con glucocorticoides se han utilizado diversos regímenes de administración.  Se reportan dosis de 1 a 1,5 g/d (Boumpas et al., 1993) de aproximadamente 14 a 21 mg/Kg/peso/d) como dosis inmunosupresora (Schimmer y Parker, 2003); mientras que otros investigadores comparan esquemas de tratamiento con altas dosis de inicio y duración variable (Volpin et al., 2002). También, se ha estudiado el mejor momento de inicio de la terapia inmunosupresora en modelos murinos para lograr la mayor tolerancia del trasplante en el tiempo (Wang et al., 2001). Por todo ello, en el uso de estas drogas inmunosupresoras se debe considerar la dosis, la duración del tratamiento y el momento del inicio de la terapia en los casos de trasplante de órganos. Estos autores concluyen que los resultados de la inmunosupresión con MP muestra inhibición de ambos, la tolerancia espontánea y el rechazo del trasplante hepático en el modelo murino (Wang et al., 2001).

El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de la metilprednisolona en el desarrollo de la criptosporidiosis experimental en hospedadores murinos inmunocomprometidos, mediante la observación de las formas parasitarias presentes, la diseminación del parásito en los tejidos estudiados, su presencia en las heces de ambos grupos y su correlación con los hallazgos de esta parasitosis en el humano inmunocompetente e inmunocomprometido.

Materiales y Métodos

Se utilizaron ocho ratones machos jóvenes pertenecientes a la cepa NMRI con peso promedio de 27,48 g divididos en dos grupos de cuatro ratones por tratamiento. Los animales, durante todo el período que duró el experimento, fueron alojados en jaulas en el bioterio del Instituto de Biología Experimental de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela, bajo condiciones de temperatura, humedad, alimentación y régimen de luz-oscuridad de acuerdo con los lineamientos establecidos por Fondo Nacional de Ciencia Tecnología e Innovación (FONACIT), para el cuidado de los animales en bioterios.

Inóculo

Se preparó a partir de heces provenientes de un caso de criptosporidiosis humana, preservadas en dicromato de potasio al 2,5%, las cuales se centrifugaron a 2000 g/5 min. La operación de centrifugación fue repetida resuspendiendo el precipitado en agua destilada, hasta aclarar el sobrenadante.  Seguidamente, el precipitado fue resuspendido en sacarosa (Sheather, 1953), volviendo a centrifugar una sola vez. Posteriormente, se tomó el menisco con pipeta y de este material se ajustó la densidad parasitaria a 1 x 10³ parásitos/mL, en un volumen de 0,1 mL administrado a cada animal mediante una sonda oroesofágica.

Se conformaron dos grupos: el primer grupo de estudio incluyó cuatro ratones infectados y tratados con MP a dosis de 16 mg/Kg de peso corporal, administrada por la vía oral mediante una sonda oroesofágica, a partir del día de la infección y posteriormente en forma interdiaria durante las cuatro semanas que duró el experimento. El segundo grupo (control) incluyó 4 ratones infectados y no tratados con MP. 

Se mantuvo la observación diaria de los individuos de ambos grupos mientras que duró el estudio, el ejemplar que mostraba menor actividad física, fue seleccionado para sacrificio mediante inhalaciones de éter en cámara de sacrificio para anestesia inhalatoria. También, se recolectaron las heces de cada uno de ellos para la determinación de la presencia del parásito en las mismas y el diagnóstico de criptosporidiosis.

Para el estudio de la diseminación visceral del parásito se realizó necropsia y se tomaron muestras de diferentes regiones del tracto digestivo, aparato respiratorio, bazo, riñón, glándula tiroides y ganglios linfáticos para el estudio histopatológico. Las muestras fueron fijadas en formol al 10% e incluidas en parafina, luego se realizaron cortes de 4 µm de espesor, los cuales fueron teñidos de acuerdo a la técnica descrita por Kinyoun (1915).

De cada muestra de heces se preparó un extendido, el cual fue sometido a coloración por el método de Ziehl-Neelsen modificado para la observación microscópica de Cryptosporidium spp.

 Resultados

 La cuantificación de las formas parasitarias observadas, se realizó mediante la observación de 20 campos a 1000 X y su registro determinado en forma de número total y porcentajes correspondientes. 

Durante el período de estudio en las heces de los animales de ambos grupos se pudo evidenciar la presencia de estructuras ácido resistentes compatibles con ooquistes de Cryptosporidium spp.

 Diseminación tisular de Cryptosporidium spp.

Las formas parasitarias observadas en tejidos fueron: ooquistes, esporozoítos falciformes, formas sexuales, merozoítos libres y trofozoítos. Durante las cuatro semanas de estudio la forma parasitaria predominante fue la de merozoíto libre (Tabla 1).

Se observó diseminación tisular en tráquea, glándula tiroides, intestino, bazo y ganglio linfático (Figuras 1, 2 y 3). No se observó el parásito en esófago, hígado, riñón y pulmón. En el grupo control la presencia del parásito se mantuvo limitada al intestino. Las formas parasitarias observadas en los tejidos de los animales del grupo control corresponden a formas de localización intestinal.  La supervivencia de los animales de ambos grupos fue del 100% durante el período de estudio.  

Discusión

En esta investigación se quiso establecer un modelo animal de inmunosupresión, que permitiese comprender el comportamiento de este Coccidio, el cual puede causar diarreas en sujetos inmunocompetentes e inmunocomprometidos y estar presente también en portadores asintomáticos (de la Parte-Pérez et al., 2005).

De manera general está establecido que diversos agentes químicos, incluidos los glucocorticoides, modifican la resistencia del hospedador ante las infecciones parasitarias. La MP, corticosteroide sintético con efectos antiinflamatorios e inmunosupresores a la dosis administrada, permitió elaborar un modelo experimental de inmunosupresión en ratones, para el estudio de la diseminación tisular del parásito.

 En la terapia con glucocorticoides se han utilizado diversos regímenes de administración, pulsos (Shinn et al.,1999), altas dosis de inicio y duración variable (Volpin et al., 2002) e incluso altas dosis únicas (Miller y Schaefer, 2006), aunque todos los estudios tuvieron objetivos diferentes al presente trabajo, por lo que no son comparables.

La MP ha mostrado su eficacia en el control del rechazo en transplantes de médula ósea (Shinn et al., 1999) así como en el de órganos sólidos (Volpin et al., 2002), tanto como en el estudio de la inmunosupresión y recuperación de la actividad inmune en roedores, frente a la infección experimental por Cryptosporidium spp. (Miller y Schaefer, 2006).

En este estudio, la respuesta observada en los animales tratados con MP se expresó de manera evidente en la diseminación tisular del parásito en órganos distintos del aparato digestivo, efecto no demostrado en los animales infectados y no tratados. Los efectos inmunosupresores de la MP se evidenciaron por la diseminación del parásito en el grupo tratado, comparado con los controles, en cuyo grupo el parásito se mantuvo confinado al intestino.

Cryptosporidium spp. presentó diseminación a tráquea, glándula tiroides, intestino, bazo y ganglio linfático y no se evidenciaron formas parasitarias en pulmón, riñón e hígado en los animales tratados con MP. Las criptosporidiosis extra-intestinales están bien descritas en los pacientes inmunocomprometidos, especialmente aquellos con VIH/SIDA (Vakil et al.,1996; Montero et al., 2001; Souza et al., 2004; Corti et al., 2008).

Por otra parte, el efecto inmunosupresor de la MP no afectó la supervivencia de los animales de ambos grupos.

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