Christiane Molinos da Silva, Ángel Villegas Monter, Prometeo Sánchez García, Gabriel Alcántar González, Ma. Nieves Rodríguez Mendoza y Lucero del Mar Ruiz Posadas

Christiane Molinos da Silva. Ingeniera Agrónoma, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Uruguaiana, Brasil. Maestra en Ciencias, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasil. Estudiante de Doctorado, IREGEP, Colegio de Postgraduados, México. Dirección: IRENAT, Colegio de Postgraduados. Km. 35.5 Carr. México-Texcoco. C.P. 56230 Montecillo, Estado de México, México. e-mail: molinacea@hotmail.com

Ángel Villegas Monter. Ingeniero Agrónomo Fitotecnista, Escuela Nacional de Agricultura (ENA), México. Maestro en Ciencias en Fruticultura, Colegio de Postgraduados, México. Doctor Ingeniero Agrónomo, Universidad de Córdoba, España. Profesor Investigador, IREGEP, Colegio de Postgraduados, México. e-mail: avillega@colpos.mx

Prometeo Sánchez García. Ingeniero Agrónomo, Universidad Rusa, Moscú, Rusia. Ph.D., Universidad de la Amistad de los Pueblos, Moscú, Rusia. Profesor Investigador, IRENAT, Colegio de Postgraduados, México. e-mail: promet@colpos.mx

Gabriel Alcántar González. Ingeniero Bioquímico, Escuela Nacional de Ciencias Bioquímicas (ENCB), Instituto Politécnico Nacional (IPN), México. Maestro en Ciencias, Colegio de Postgraduados, México. Doctor en Ciencias, Universidad de Paris, Francia. Profesor Investigador, IRENAT, Colegio de Postgraduados, México. e-mail: alcantar@colpos.mx

Ma. Nieves Rodríguez Mendoza. Químico Farmacéutico Biólogo, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Maestra en Ciencias en Microbiología de Suelos y Doctora en Ciencias en Nutrición de Cultivos, Colegio de Postgraduados, México. Profesor Investigador, IRENAT, Colegio de Postgraduados, México. e-mail: marinie@colpos.mx

Lucero del Mar Ruiz Posadas. Biólogo, UNAM. Ph.D., University of Lancaster, Reino Unido. Profesor Investigador, IRENAT, Colegio de Postgraduados, México. e-mail: lucpo@colpos.mx

The osmotic potential, ionic balance and the nutrient ratios of culture medium are determinant for in vitro propagated plants growth; however, in most investigations, these factors are not considered. The effect of different osmotic potentials (-0.106, -0.113, -0.120, -0.128, -0.143 and -0.157MPa) and Ca²⁺ contents of culture medium salts on the distribution of Ca²⁺ and K⁺, and on dry biomass of explants of grapevine were evaluated. The Ca²⁺ and K⁺ concentrations were measured with a low vacuum scanning electron microscope (MEB-LV). Ca²⁺ and K⁺ translocation from stems to leaves was favored by the higher osmotic potential of culture medium (-0.106MPa), whereas the larger contents of these elements at the base of the stems were found at the most negative osmotic potential (-0.157MPa). The greater dry biomass weight (57mg) and the smaller percentage of explants with Ca²⁺ deficiency symptoms (20%) were obtained at -0.106MPa, the lower osmotic potential, and 1.5mM Ca²⁺ in the culture medium.

O potencial osmótico, o balanço iônico e as relações nutrimentais dos meios de cultura são determinantes para o crescimento e distribuição dos nutrientes das plantas cultivadas in vitro, entretanto, na maioria dos casos os primeiros não são considerados. Neste estudo, avaliou-se o efeito de diferentes potenciais osmóticos dos sais minerais do meio de cultura (-0,106; -0,113, -0,120; -0,128; -0,143 e -0,157MPa) e concentração de Ca²⁺ sobre a distribuição de Ca²⁺, K⁺ e peso de biomassa seca dos explantes de videira. A concentração iônica foi quantificada com um microscópio eletrônico de barrido de baixo vazio (MEB-LV). O maior potencial osmótico do meio de cultura (-0,106MPa) favoreceu a translocação de Ca²⁺ e K⁺ dos talos para as folhas, enquanto o potencial mais negativo (-0,157MPa) permitiu os maiores niveles nos talos. O maior peso de biomassa seca (57mg) e os menores porcentuais de explantes com os sintomas de deficiência de Ca²⁺ (20%) se obtiveram com o potencial osmótico de -0,106MPa e com a concentração de 1,5mM de Ca²⁺ no meio de cultura.

Palabras Claves / Portainjerto / Relación Ca²⁺/K⁺ / Vitis berlandieri x V. rupestris R. /

Recibido: 29/01/2004. Modificado: 01/06/2004. Aceptado: 11/06/2004.

La disponibilidad de los nutrientes influye en el crecimiento de las plantas in vitro, que está determinado por la concentración, fuente y relación iónica del medio de cultivo (Leifert et al., 1992). George (1993) atribuye a las sales inorgánicas y al azúcar sus efectos sobre el desarrollo de las plantas debido a sus propiedades osmóticas. La baja actividad fotosintética y pequeña área foliar de explantes, en condiciones in vitro, no proporcionan cantidades suficientes de carbohidratos, por lo que los elementos minerales y compuestos orgánicos del medio son esenciales (Ruzéicå et al., 2000).

El potencial osmótico del medio de cultivo tiene efecto directo en los explantes; conforme sea más negativo, menor será la absorción de agua y, por consecuencia, se dificultará la multiplicación de brotes axilares por la baja disponibilidad de los nutrientes del medio. La composición mineral de los medios de cultivo resulta fundamental, ya que tiene un efecto decisivo en el potencial osmótico y el pH del medio, así como en la nutrición de los explantes (Morard y Henry, 1998). En este sentido, George (1993) señala que las células mantenidas en un ambiente con bajo potencial osmótico pierden agua y disminuyen su potencial hídrico, alterando su morfogénesis. Por otra parte, Pierik y Steegmans (1975) indican que el crecimiento y organogénesis de los explantes se detienen cuando el potencial osmótico es más negativo que -0,3MPa debido a la baja absorción de agua.

Es notorio el efecto de los macronutrientes en los explantes, siendo estudiados con mayor frecuencia la relación NO₃^-:NH₄⁺ en los medios de cultivo (Do y Cormier, 1991; Vinterhalter y Vinterhalter, 1992). Sin embargo, el Ca²⁺ y el K⁺ son también esenciales para el desarrollo de las plantas y son antagónicos entre sí, por lo que debe haber una correcta relación entre ambos. Cabe indicar que en muchos medios de cultivo utilizados para propagación de vid hay mayor proporción de K⁺ , lo que resulta en menor calidad de brotes (Tabla I).

La demanda nutricional y el contenido en Ca²⁺ de las plantas son controlados genéticamente, además de estar afectadas por el suplemento de este nutriente (Kirkby y Pilbeam, 1984). Clarkson (1984) y Marschner (2002) indican que los desórdenes ocasionados por deficiencia de Ca²⁺ son causados principalmente por la limitada capacidad de las plantas de regular la distribución interna de este elemento a los órganos de demanda, dado que el movimiento de Ca²⁺ es principalmente acropétalo, vía xilema, y puede estar correlacionado con la cantidad de agua que se mueve en los tejidos (Choi y Lee, 2001). Además, la salinidad reduce el transporte del agua y asimilación de nutrientes (Adams y Ho, 1989; Navarro et al., 2000).

Uno de los problemas asociados con deficiencias de Ca²⁺ en los ápices de los brotes es la necrosis apical que ocurre en explantes cultivados in vitro, principalmente en especies leñosas, resultado de la baja movilidad del ion. En cultivos in vitro la alta humedad limita la transpiración y el movimiento de iones vía xilema (George, 1993).

Las investigaciones referentes a la necrosis apical con un enfoque en nutrición in vitro se han encaminado a evaluar niveles de Ca²⁺, sin considerar el balance iónico y el potencial osmótico del medio, así como las necesidades nutricionales de los explantes. Por otro lado, la técnica de espectrometría de fluorescencia de rayos-X (EPMA por Electron-Probe X-Ray Microanalysis) presenta resultados favorablemente comparados a los obtenidos mediante AES-ICP y la ventaja del proceso de no ser destructivo y consecuentemente rápido (Günter et al., 1992). El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto del potencial osmótico y el contenido de Ca²⁺ en el medio de cultivo sobre la distribución y acumulación de Ca²⁺ y K⁺, producción de biomasa, y la incidencia de necrosis apical en explantes de vid.

Se utilizaron brotes apicales (1cm) del portainjerto de vid R110 (Vitis berlandieri x V. rupestris R.), mantenidos por siete subcultivos en medio base semi-sólido compuesto por 10mM NH₄NO₃; 7,91mM KNO₃; 1,5mM MgSO₄·7H₂O; 1,25mM KH₂PO₄; 3,0mM Ca(NO₃)₂·4H₂O; 0,1mM EDTA y 0,1mM FeSO₄ 7H₂O; complementados con 1mg·l^-1 mio-inositol; 0,4mg·l^-1 tiamina; 0,5mg·l^-1 benciladenina (BA); 0,25mg·l^-1 ácido indolbutírico (AIB); 30g·l^-1 sacarosa y 7g·l^-1 agar. Los medios se ajustaron a pH 5,7 ±0,1 con HCl o NaOH y fueron esterilizados en autoclave durante 15min a 121ºC.

Los valores de potencial osmótico del medio de cultivo de los tratamientos (Tabla II) se obtuvieron a través de la ecuación de Van’t Hoff’s: Yo = -c R T, donde c: concentración de soluto en mol·l^-1, R: constante de gases, T: temperatura en ºK.

Cada tratamiento constó de 36 explantes y cada uno de éstos se consideró como unidad experimental. Se consideró como testigo el potencial osmótico del medio de cultivo para vid (-0,113MPa) propuesto por Troncoso et al. (1990) y Villegas et al. (1992). Los segmentos nodales se sembraron en tubos de ensayo de 25x150ml, con 10ml de medio de cultivo. Los tubos fueron cerrados con tapas de polipropileno y sellados con una película de Parafilm, para reducir la deshidratación del medio y los explantes. Después de la siembra, los explantes se incubaron a una a 25 ±2ºC, fotoperíodo de 16h luz e intensidad luminosa de 47,3µmol·m^-2·s^-1. Los explantes se subcultivaron cada 28 días.

Las determinaciones de Ca²⁺ y K⁺ en tallos y hojas de los explantes de vid se realizaron a los 2, 5, 7, 14, 21 y 28 días después del establecimiento del experimento (dde), mediante análisis en microscopio electrónico de barrido de bajo vacío (MEB-LV), marca JEOL modelo JSM-5900 LV con filamento de tungsteno, unido a un analizador de energía dispersiva de rayos-X (EXL, modelo LZ-4), que mide la concentración iónica y permite el análisis de muestras no conductoras y húmedas. Se consideraron tres repeticiones por tratamiento para la determinación iónica en la base del tallo y en la superficie abaxial de las hojas, que fueron analizados con una magnificación de 500x, aceleración de voltaje de 20keV y corriente de emisión de electrones de 10µA. Se obtuvieron el espectro y las imágenes en las condiciones descritas por Hodson y Sangster (1989).

Con los valores obtenidos en porcentaje de Ca²⁺ y K⁺ se calculó la acumulación de estos elementos en mM en los explantes: mg Ca²⁺/explante/0,04 y mg de K⁺/explante/0,039. Además, se determinó la concentración relativa (C_rel) de estos iones como C_{rel (Ca}²⁺_{, K}⁺₎= mM (Ca²⁺, K⁺) en el explante por mM (Ca²⁺, K⁺) utilizados en el medio de cultivo.

El peso de materia fresca de tres explantes se determinó a los 2, 5, 7, 14, 21 y 28 días dde, y posteriormente los explantes se secaron a 65ºC durante 72h para obtener el peso de biomasa seca (PBS) por explante en mg.

Se evaluaron los brotes que presentaron síntomas visuales, tales como oscurecimiento de los ápices, amarillamiento de las hojas nuevas o necrosis apical. Los brotes se clasificaron de acuerdo con la escala:

1. Explantes vigorosos, hojas de coloración verde y entrenudos largos

3. Ápices con ligeros síntomas de necrosis

4. Necrosis apical (muerte del explante).

Para el análisis estadístico, se realizó análisis de varianza y comparación de medias por Tukey (P£0,05) con el paquete de diseños experimentales FAUANL versión 1.7 (Olivares, 1990).

Se presentan los resultados obtenidos a los 28 dde, debido a que únicamente hubo diferencias significativas entre tratamientos (P£0,05) en ese tiempo. Los resultados en la Tabla III indican que los tratamientos indujeron diferencias significativas (P£0,05) en los niveles de Ca²⁺ y K⁺ en la base de los tallos de los explantes.

Las concentraciones de Ca²⁺ y K⁺ fueron diferentes en los órganos analizados, corroborando lo encontrado por Borkowska y Michalczuk (1989) que estudiaron la distribución de ⁴⁵Ca²⁺ en explantes de Prunus cerasus L. y detectaron más actividad en los tallos durante los primeros 4 días de cultivo, mientras que a partir de los 16 días se encontró más Ca²⁺ en las hojas. Los menores niveles de Ca²⁺ en la base de los tallos (3,8mg·g^-1) se encontraron en el medio con las concentraciones más bajas de Ca²⁺ (1,5mM) y mayor potencial osmótico (-0,106MPa) mientras que en las hojas se observó la mayor concentración (9,9mg·g^-1) en el mismo tratamiento. En estas condiciones el flujo de agua se favorece y con ello hay mayor asimilación y translocación de Ca²⁺ hasta los ápices de los brotes, resultados que coinciden con Choi y Lee (2001) quienes señalan que la distribución de Ca²⁺ en la parte aérea de los tejidos es afectada por el movimiento de agua y por el estrés osmótico que reducen la asimilación de nutrientes. Ruzéicå et al. (2000) mencionan que la asimilación iónica del portainjerto de cereza fue mayor en el medio de cultivo con potencial osmótico de -0,058MPa y con reducido contenido de macronutrientes, particularmente de K⁺, Ca²⁺, Mg²⁺.

Por su parte, Ruhl (1989) obtuvo un aumento en la concentración de K⁺ en raíces y tallos de vid a medida que incrementó los niveles de nitrato en el medio de cultivo, lo que coincide con lo encontrado en el presente estudio, donde la concentración de 29,91mM de NO₃^- propició la mayor cantidad de K⁺ en tallo (13,2mg·g^-1), siendo que para el Ca²⁺ no se observó el efecto directo del NO₃^-.

El contenido de Ca²⁺ y K⁺, y la relación Ca²⁺/K⁺ en las hojas no mostraron una estrecha correlación con el potencial osmótico del medio de cultivo (R²= 0,23; 0,46 y 0,45 respectivamente). Sin embargo, considerando la concentración total de K⁺ en el explante entero, la correlación aumenta hasta R²= 0,79. Singha et al. (1990) encontraron que, en la medida que se disminuyó el potencial osmótico del medio de -0,218 hasta -0,258MPa hubo incremento en los porcentajes de Ca²⁺ y K⁺ en los explantes de Cydonia oblonga Mill.

El tratamiento con el potencial osmótico de -0,157MPa y con los mayores niveles de Ca²⁺ (12mM) en el medio de cultivo dio por resultado la menor concentración de K⁺ en las hojas, lo cual comprueba el antagonismo existente entre ambos cationes. Resultados similares encontraron Peñalosa et al. (1995), en plantas de fríjol cultivadas en hidroponía.

El tratamiento con -0,113 MPa, considerado como testigo, presentó la menor relación Ca²⁺/K⁺ en las hojas (0,08). Por otro lado, se demostró que a menores niveles de Ca²⁺ y mayor potencial osmótico del medio (1,5mM y -0,106MPa, respectivamente), se incrementó la concentración de Ca²⁺ en las hojas (9,9mg·g^-1) a los 28 dde, lo cual coincidió con el mayor número de plantas sin síntomas visuales de deficiencia de Ca²⁺, corroborando la dificultad de este ion de distribuirse en la planta en condiciones salinas, reportada por Choi y Lee (2001).

En la Tabla IV se observan diferencias estadísticas significativas (P£0,05) a los 28 dde para el peso de biomasa seca (PBS) y acumulación de Ca²⁺ y K⁺ en explantes del portainjerto de vid R110 cultivados in vitro, por efecto del potencial osmótico. El PBS fue significativamente superior en el tratamiento con -0,106MPa, lo cual coincide con Singha et al. (1990), quienes estudiaron niveles de 3, 9 y 18mM de Ca²⁺ y potenciales osmóticos calculados de -0,218; -0,235 y -0,259MPa, respectivamente, en el medio de cultivo, encontrando el mayor valor de PBS (107mg) en Cydonia oblonga Mill. con el mayor potencial osmótico.

Los explantes en el medio con potencial osmótico de -0,157MPa mostraron reducción en el crecimiento, medido por el PBS (23,5mg). Sin embargo, Ruzéicå et al. (2000) encontraron el mayor peso de biomasa seca en portainjerto de cereza (100mg) en el medio de cultivo con el potencial osmótico más negativo. Esto pone de manifiesto la importancia de la especie en cuanto a la capacidad de absorción, tal como lo señalaron Brancadoro et al. (1994).

En lo referente a la acumulación iónica en planta entera, se observó que en el potencial osmótico de -0,143MPa, donde la relación Ca²⁺/K⁺ es de 1, hubo la mayor acumulación de Ca²⁺ y K⁺. Ambos elementos son fundamentales en la regulación del potencial osmótico intracelular y en la permeabilidad de la membrana, lo que determina la eficiencia de asimilación de nutrientes. Además, se pudo apreciar que en términos de acumulación iónica, los resultados difieren de lo encontrado por Troncoso et al. (1990), quienes observaron que al aumentar el N total del medio de cultivo se incrementaba la concentración de Ca²⁺ en los tejidos mientras que disminuya la de K⁺. No se puede atribuir al N o a la relación NO₃^-:NH₄⁺ los valores de Ca²⁺ o K⁺ acumulados en los explantes. En las condiciones de este estudio, se puede afirmar que el tratamiento usado como testigo (-0,113MPa) no es el adecuado para la multiplicación de vid R110, ya que en éste las plantas tuvieron las menores acumulaciones de Ca²⁺ y K⁺ (4,1mM y 6,7mM, respectivamente).

La concentración relativa es indicativa de la eficiencia de absorción y translocación de Ca²⁺ y K⁺; en este caso, el tratamiento con el menor nivel de Ca²⁺ y el mayor potencial osmótico indica valores de 6,4 para el Ca²⁺ y 1,07 para el K⁺, lo que comprueba el mecanismo más eficiente de absorción en condiciones de bajas concentraciones iónicas y mayores potenciales osmóticos, en contraste con George (1993) que encontró que un insuficiente suplemento de Ca²⁺ puede resultar en asimilación limitada del ion e inadecuado transporte hasta los ápices. La concentración relativa de Ca²⁺ presentó una tendencia potencial (y= 5,2293x^-1,2325; R²= 0,84) con relación al potencial osmótico del medio y el K⁺ no mostró una correlación conforme el potencial osmótico se hizo más negativo (R²= 0,16), sin embargo, la relación entre ambos tiene una correlación significativa con tendencia potencial (y= 5,4779x^-1,2497; R²= 0,99).

A partir de los 14 días del subcultivo empezó el amarillamiento gradual de los márgenes de las hojas más jóvenes, en tanto los síntomas más severos (muerte del explante) no se observaron en el periodo de 28 días. Los menores porcentajes (20%) de explantes con síntomas de deficiencia de Ca²⁺ se presentaron en el tratamiento con el mayor potencial osmótico y menor concentración de Ca²⁺ en el medio (1,5mM Ca²⁺ y -0,106MPa, respectivamente). Se manifestaron por el amarillamiento parcial de las hojas superiores y fue estadísticamente diferente (P£0,05) al tratamiento testigo con un potencial osmótico de -0,113MPa (Tabla V).

Además, los tratamientos que presentaron los índices más elevados de brotes sanos (80 y 70%) fueron aquellos en que se acumularon mayores concentraciones de Ca²⁺ en los explantes (9,6 y 10,2mM; Tabla IV). Al contrario de lo encontrado por Sha et al. (1985) en explantes de Solanum tuberosum, donde el aumento en el porcentaje de brotes con necrosis apical se relacionó significativamente con la reducción en el contenido de Ca²⁺ en el medio de cultivo. Para el caso de la vid, Villegas et al. (1992) encontraron mayor porcentaje de necrosis apical en portainjertos de vid en el tratamiento sin Ca(NO₃)₂. Sin embargo, observaron un comportamiento diferenciado entre los portainjertos evaluados, lo que coincide con lo observado en este experimento, visto que la necrosis apical estuvo relacionada con la concentración interna de Ca²⁺ en los explantes y no con la concentración en el medio de cultivo.

El tratamiento con el potencial osmótico del medio de cultivo de -0,157MPa y el mayor contenido de Ca²⁺ (12mM) dificultó el transporte de Ca²⁺ hacia los ápices. El tratamiento con -0,106MPa y menor cantidad de Ca²⁺ en el medio (1,5mM) propició la translocación más eficiente de este elemento a las hojas y el mayor peso de biomasa seca de los explantes; mientras que el potencial osmótico de -0,143MPa favoreció la mayor concentración de K⁺ en las hojas. El aumento en la concentración de Ca²⁺ en el medio de cultivo no disminuyó los síntomas de amarillamiento de las hojas de los explantes de vid.

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