1Dirección de Endemias Rurales de Malariología del Ministerio de Salud y Asistencia Social, Maracaibo, Venezuela e

²Instituto de Medicina Tropical Pedro Kouri, La Habana, Cuba.

Resumen. 

    Con la finalidad de evaluar la efectividad, persistencia en el tiempo y algunos factores que puedan afectar la acción del biolarvicida Bacillus sphaericus cepa 2362, se condujo un estudio en condiciones de laboratorio y campo con la formulación Griselef basado en bacterias esporógenas del tipo Bacillus sphaericus cepa 2362, sobre las poblaciones larvales de An. nuñeztovari Gabaldón, principal vector de la malaria en el occidente de Venezuela. Se determinaron los niveles de susceptibilidad en el laboratorio de esta especie al Bacillus sphaericus, ubicándose la CL50 en 0,07 ppm y la CL95 en 0,69 ppm. Los rangos de pH del agua, evaluados en el laboratorio, determinaron que los valores entre 7 y 9 no afectaron la acción del biolarvicida alcanzando mas del 95% de mortalidad larvaria a las 72 horas de observación. En condiciones controladas de campo se comprobó la alta susceptibilidad de larvas de An. nuñeztovari a la acción larvicida del producto, obteniéndose un 100% de mortalidad a las 72 horas de exposición. La variable radiación solar fue evaluada en estas condiciones, resultando que la misma influye en la efectividad del producto a las 12 horas de exposición, reduciéndose la efectividad en un 30%, sin embargo la presencia de la variable vegetación, redujo la efectividad del biolarvicida entre 5% y 12% en promedio. En condiciones naturales de campo se demostró que el biolarvicida fue efectivo al alcanzar un 100% de mortalidad larval en dos criaderos tratados, persistiendo el efecto hasta los 4 meses de observación, demostrando que el mismo es capaz de mantenerse en el medio, logrando mas de un 85% de reducción larval.

Palabras clave: Bacillus sphaericus 2362, bacilos, malaria, control biológico de vectores.

Abstract.  

    A study, under laboratory and field conditions, was conducted to evaluate the effectiveness, persistence in the time and some factors that can affect the larvicidal action of the Griselef formulation of the sporogenous bacteria Bacillus sphaericus strain 2362, on the larvae population of the Anopheles nuñeztovari Gabaldón, the main malaria vector in western Venezuela. The degree of susceptibility of this species to the Bacillus sphaericus was determined to be at a LD50 in 0.07 ppm a LD95 in 0.69 ppm. The pH ranges of the water, as tested in the laboratory, showed that values between 7.0 and 9.0 did not affect the action of the larvicide, producing more than 95% of mortality after 72 hours of observation. Under controlled field conditions, the high susceptibility of the An. nuñeztovari larvae to the larvicidal action of the product was demonstrated. With a dose of 5 ml/m², a 100% mortality was obtained after 72 hours of exposure. In the field, it was determined that after 12 hours, solar radiation decreased the effectiveness of the B. sphaericus in 30% and that the presence of vegetation reduced the biolarvicidal effect between 5 and 12%. Under natural field conditions, it was shown that the larvicide was effective, since a 100% larval mortality was obtained in the two treated breeding places. This effect persisted up to 4 months of observation, with more than 85% of larvae reduction, showing that it is capable or remaining in the natural environment.

Key words: Bacillus sphaericus 2362, bacillus, biological control of vectors.

INTRODUCCIÓN

    Los parásitos maláricos que afectan al humano son transmitidos por mosquitos del género Anopheles Meigen (Díptera: Culicidae); de las 500 especies de anofelinos descritas, cerca del 20% están señaladas como vectores.¹

    El deterioro de los programas antimaláricos actualmente se debe en gran parte a la resistencia generada por estos vectores a los insecticidas químicos,² debido a que la lucha contra estas especies vectoras en el mundo se ha venido realizando principalmente mediante estos métodos químicos.³ De 117 especies de mosquitos resistentes a insecticidas químicos, el 57% pertenecen al género Anopheles.⁴

    En Venezuela, las especies vectoras de malaria más importantes son: en la región Occidental, An. nuñeztovari Gabaldón; An. darlingi Root, en los estados Amazonas y Bolívar y An. aquasalis Curry en el oriente de Venezuela. Anopheles nuñeztovari ha desarrollado un comportamiento exofílico, por lo que las medidas de control químico con insecticidas de acción residual intradomiciliar se han hecho inefectivas.⁵ Esta situación ha puesto de manifiesto que la lucha antivectorial no puede basarse únicamente en el control químico. Se hace necesario la implementación de métodos más efectivos para el control de este vector como alternativa al uso de insecticidas químicos.

    A pesar de que en el ámbito mundial estos métodos se utilizan para controlar poblaciones de mosquitos Culícidos (Culicidae) y Simúlidos (Simulidae) con buenos resultados,^8-14 en Venezuela es escasa la información acerca de la factibilidad del uso de los mismos como larvicidas; solo se conocen algunos estudios con Bacillus thuingiensis, sobre larvas de An. aquasalis, en el estado Sucre del Oriente del país^15-17 y en poblaciones naturales de larvas de Aedes aegypti en Aragua.¹⁸ Sobre la factibilidad del uso de Bacillus sphaericus como agente larvicida, no se tiene ninguna información, ni del efecto que el mismo puede ejercer sobre la dinámica poblacional tanto de anofelinos como sobre otras especies de culícidos.

    El Bacillus sphaericus es un microorganismo Gram variable (puede teñirse Gram + como Gram -), aeróbico estricto, formador de esporas esféricas de allí su nombre, las cuales esporulan en un 100%. Posee unos cristales redondeados que son los productores de endotoxina. Esta toxina es la que ocasiona la muerte de la larva del mosquito.¹⁹ Al ser ingerida la toxina, ocurren cambios patológicos en las células del intestino de la larva, produciendo parálisis de la pared intestinal, cuyo mecanismo aún se desconoce.²⁰ La existencia de cepas más tóxicas que otras dependen de la expresión genética de las proteínas que forman la toxina.^21-23 Las cepas altamente tóxicas son la 1593, 2362 y 2297.²⁰ Su acción patógena depende de varios factores: dosis de aplicación, ingestión de la toxina por la larva, velocidad de alimentación de la misma y rapidez con la cual la bacteria cae al fondo del criadero y se vuelve inaccesible a los anofelinos, competencia con otras materias orgánicas, grado de contaminación del agua, presencia o ausencia de vegetación y por último de los hábitos alimentarios de las especies del género Anopheles. Esto determina que el B. sphaericus presente un amplio rango de actividad larvicida,^{10, 24} siendo particularmente efectiva para los géneros Culex y Anopheles.²⁵

    La persistencia y el reciclaje de este bacilo ha sido comprobado por varios autores los cuales refieren que el mismo puede ser influenciado por las actividades de otros insectos en el hábitat de los mosquitos,²⁶ ya que las bacterias son capaces de germinar en el intestino de larvas de Chironomus spp y otros artrópodos como la Daphnia, los cuales son los responsables de la redistribución de esporas y bacterias.²⁷

    En consecuencia, este estudio tiene la finalidad de evaluar la acción del biolarvicida Bacillus sphaericus cepa 2362 sobre larvas de Anopheles nuñeztovari el cual posee un valor potencial como método alternativo al uso de insecticidas químicos que han demostrado limitada efectividad en el control de este vector.^{5, 28}

MATERIALES Y MÉTODOS

    Para evaluar la efectividad del Bacillus sphaericus cepa 2362 se utilizó la formulación líquida Griselef (LABIOFAM) y larvas de An. nuñeztovari de III y IV estadio temprano (0-16 horas después de la muda), método utilizado por Mulla y col.²⁹ cultivadas en el laboratorio de Endemias Rurales de Malariología en Mérida.

    Para la cría de la larva An. nuñeztovari, se realizaron capturas nocturnas del mosquito con cebo humano,³⁰ siguiendo la metodología recomendada por la OMS para captura de anofelinos.³¹ Se realizaron un total de 25 capturas en la localidad de Onia del Municipio Alberto Adriani del Edo. Mérida. Después de su captura fueron llevados al laboratorio bajo condiciones adecuadas de transporte,³² las especies fueron identificadas según las claves gráficas de Cova y Sutil,³³ posteriormente fueron separados en forma individual en vasos de cartón parafinados con un algodón con azúcar al 10% para su alimentación. En el fondo del vaso se colocó un papel filtro humedecido como superficie para la postura. Los huevos obtenidos se colocaron en bandejas plásticas de 50 cm y 120 ml de capacidad. Después de la eclosión fueron alimentadas con alimento para peces (Ictiosan) y Levadura (Squibb) (50% x 50%) triturados,³⁴ hasta completar los estadios requeridos para las pruebas biológicas.

Bioensayo de Laboratorio

    Las condiciones ambientales para los bioensayos fueron: 27,5°C ± 2,5°C y fotoperíodo de 12:12 horas.

    Para determinar las Concentraciones Letales (CL50 y CL95), se realizaron diluciones del producto según las normas para bioensayos estipuladas por el Instituto Pasteur,³⁵ con la finalidad de obtener 6 concentraciones de la formulación. Estas diluciones se realizaron utilizando una pipeta graduada en microlitros, partiendo inicialmente con 100 del producto puro conteniendo 1000 ppm, de allí mediante diluciones seriadas se obtuvieron las concentraciones evaluadas: 0,01 ppm, 0,05 ppm, 0,1 ppm, 0,25 ppm, 0,5 ppm, 1 ppm. El intervalo inicial de estos bioensayos se determinó mediante la revisión de investigaciones similares basándose en los valores mayores y menores obtenidos de CL50 y CL95.^{10, 36-39}

    Se realizaron 4 réplicas por cada concentración y un control. En recipientes de vidrio estéril de 120 ml de capacidad, se agregó 80 ml de agua declorinada a pH = 7,2 y un total de 25 larvas de III y VI estadio temprano de An. nuñeztovari, contenidas en 20 ml de agua en iguales condiciones, con un volumen final de solución de 100 ml por cada réplica. El control se preparó en iguales condiciones solo que no contenía el biolarvicida. Este bioensayo se repitió en tres ocasiones diferentes, con intervalo de un mes cada uno a fin de corregir las posibles variaciones por efecto de la manipulación. La mortalidad fue observada a las 48 y 72 horas de exposición, corregida por la fórmula de Abbot⁴⁰ si esta excedía del 5% en el control. Los porcentajes de mortalidad obtenidos fueron sometidos a análisis estadístico, utilizando el paquete estadístico del programa Probit.⁴¹

    Para la determinación de los tiempos letales TL50 y TL95, se realizaron igualmente 4 réplicas en las mismas condiciones descritas y un control con la concentración de CL95 obtenida, observando la mortalidad después de 4, 12, 24, 36, 48 y 72 horas de exposición.

    Los tiempos letales (TL50 y TL95) fueron calculados a partir de la regresión: log tiempo exposición -% mortalidad; la significación de dicha regresión se determinó mediante la prueba chi cuadrado (p < 0,05) a través del análisis Probit.⁴¹

    En condiciones de laboratorio se evalúo la variable pH del agua y su influencia en la efectividad del producto, utilizando una concentración de 1ppm.

    Se realizaron igualmente 4 réplicas para cada variación de pH. Se utilizó agua a pH = 7,2, añadiendo gota a gota solución de NaOH del 10 al 20%, hasta obtener rangos variables entre 7 y 9. Cada réplica se preparó de la forma siguiente: en envases de vidrio estériles se le agregaron 100 ml de agua con el valor de pH a evaluar, se le agregó la dosis respectiva de cada biolarvicida, agitando suavemente el envase para lograr un grado de homogenización de la solución, posteriormente se agregaron 25 larvas de An. nuñeztovari de III y IV estadio temprano. El grupo control se preparó en iguales condiciones sólo que no fue sometido a cambio de pH. Los resultados se evaluaron a las 72 horas.

Ensayo en Condiciones Controladas de Campo

    Con el fin de evaluar la efectividad así como también la influencia de las variables presencia de vegetación y radiación solar del B. Sphaericus, se realizaron ensayos en condiciones controladas de campo.

    En la localidad de Caño Negro del Municipio Alberto Adriani, del Estado Mérida, Venezuela, se cavaron 4 huecos de 1m² y 20 cm de profundidad. Cada hueco fue cubierto por material plástico transparente (polietileno) para preservar el agua, a éstos se le agregaron 200 litros de agua aproximadamente, obtenida de fuentes naturales del área de trabajo. Se colocaron en cada uno, 200 larvas de An. nuñeztovari de III y IV estadio temprano, 3 réplicas, con la dosis de 5 ml/m² del producto puro disuelto en 95 ml de solución (agua natural), dosis ésta calculada según los resultados obtenidos de laboratorios, así como también las recomendaciones del fabricante¹¹ y un control bajo las mismas condiciones, pero sin tratamiento. Estos huecos se cubrieron con tapas de marcos de madera de 1m² con una malla de nylon fino de 0,89 mm cada orificio.

    Para evaluar la influencia de la variable radiación solar en la efectividad del B. sphaericus 2362 se cavaron huecos con las condiciones descritas, 3 réplicas por cada tiempo de exposición y dos controles, uno con sombra y tratamiento y otro en presencia de radiación solar sin tratamiento, con la finalidad de comparar ambos resultados. Se agregó a cada réplica una dosis de 5 ml/m² en 95 cc de solución (agua natural) y 200 larvas de An. nuñeztovari, éstos fueron expuestos a la radiación solar a intervalos de 4, 8 y 12 horas. Los huecos fueron cubiertos con tapas de 1 m² realizadas con polietileno negro las cuales se colocaban al cumplirse las horas estipuladas de exposición a la radiación solar. Las observaciones y registros de mortalidad se realizaron en las siguiente 72 horas después de los distintos horarios de exposición.

    La variable presencia de vegetación se evaluó mediante la clave empírica progresiva de abundancia de 5 términos según Margalef:⁴³

5= Masa muy abundante¹⁰⁰

4= Masa abundante⁶⁰

3= Medianamente numerosa³⁰

2= Escasa¹⁰

1= Rara¹

    La vegetación para esta prueba fue la Pistia stratiotes o lechuga de agua, especie ésta, encontrada frecuentemente en los criaderos naturales del área en estudio.

    En los huecos con las características descritas, se realizaron 3 réplicas por cada escala de presencia de vegetación y se les agregó una misma dosis 5 ml/m² y 200 larvas de igual estadio con un control en iguales condiciones de vegetación, pero sin tratamiento. La evaluación se realizó mediante la valoración de la mortalidad después del tratamiento a las 72 horas.

Ensayo en condiciones naturales de Campo

    La última etapa de la investigación planificada consistió en la aplicación en condiciones naturales del B. sphaericus 2362, para evaluar la efectividad del mismo en reservorios naturales. Para ello se midieron previamente los índices larvarios antes del tratamiento y se estableció la acción efectiva calculando posteriormente el porcentaje de reducción del total de larvas en los criaderos de mosquitos tratados, utilizando la ecuación de Mulla y col:²⁹

                                      C1 x T2

% de Reducción = 100 - ——— x 100

                                      T1 x C2

    La dosis calculada en campo fue de 10 ml/m² disueltos en 90 ml de agua natural del mismo criadero, obteniendo una solución final de trabajo de 100 ml por cada m².

    Para esta etapa se escogieron 3 criaderos, para dos réplicas y un control, los mismos se ubicaron en el Municipio Alberto Adriani, ubicado a 135 m sobre el nivel del mar con temperaturas máximas de 32°C y mínimas de 22°C (promedio 26°C) y humedad relativa entre 70 y 100% (promedio 80%), precipitación pluvial entre 1000 y 2000 mm, (promedio 1800 mm) al año.

    La aplicación del biolarvicida se realizó con equipos de aspersión Hudsong de 12 litros de capacidad a una presión de 50 psi.

    Durante los muestreos pretratamiento se determinaron las especies de mosquitos presentes, la densidad larvaria, fauna acompañante, flora existente, además se realizaron mediciones en m² del área de criadero a tratar para el cálculo de las dosis a aplicar y se midieron las variables físico químicas del agua del criadero con los kits de diagnóstico físico químicos.

RESULTADOS

Bioensayos de Laboratorio

    Durante el proceso de cría de larvas se obtuvo un 25% de producción durante la F1, éste porcentaje fue suficiente cantidad para los ensayos de laboratorio y de condiciones controladas de campo. De acuerdo al marco metodológico descrito se observaron respuestas de mortalidad deduciéndose los valores de CL50, CL95, TL50 y TL95. Al analizar el efecto de B. sphaericus sobre la mortalidad de larvas de An. nuñeztovari en condiciones de laboratorio se observó que con la concentración de 1ppm se alcanzó un 100% de mortalidad a las 72 horas de exposición, ubicándose la CL50 en 0,07 ppm y la CL95 en 0,69 ppm. Los tiempos letales se ubicaron en TL50 en 21,7 horas y TL95 a las 46,6 horas (Tabla I).

Etapa en Condiciones Controladas de Campo

    En condiciones controladas de campo se demostró la efectividad de Bacillus sphaericus al lograr el 100% de mortalidad a las 72 horas de observación. En presencia de radiación solar (Tabla III), se pudo observar que a las 12 horas de exposición a la misma, la efectividad declinó en un 30%. La variable presencia de vegetación, obtuvo con vegetación escasa y mediana un 100% de mortalidad, declinando este valor con vegetación abundante y muy abundante en un promedio de 5% y 12% (Tabla IV).

TABLA I
DETERMINACIÓN DE LA MORTALIDAD EN LARVAS DE Anopheles nuñeztovari EXPUESTAS A DIFERENTES CONCENTRACIONES DE Bacillus sphaericus
CEPA 2362

Etapa en Condiciones de Campo

    En los 2 criaderos tratados, uno permanente de 20 m² y otro temporal de 10 m², se encontraron las especies de mosquitos An. nuñeztovari en un 60%, An. oswaldoy 30% y Culex erraticus 10%, en estadios larvales del I al IV y en fase de pupa, la vegetación se encontraba en baja cantidad. Después del tratamiento con el biolarvicida se obtuvo un porcentaje de reducción larval de 100% en ambos criaderos a las 72 horas post-tratamiento, persistiendo el efecto en los 3 meses siguientes, declinando en menos de un 15% al cuarto mes de observación (Tabla V).

DISCUSIÓN

    Los resultados obtenidos señalan que esta bacteria posee una alta efectividad, ocasionando el 100% de mortalidad en las poblaciones de larvas de An. nuñeztovari, tanto en condiciones de laboratorio como de campo, a las 72 horas a una concentración de 1 ppm (Tabla I), ubicándose las dosis letales CL50 y CL95 en 0,07 ppm y 0,69 ppm respectivamente, correspondiéndose con los resultados obtenidos por la WHO⁴⁴ quienes reportaron valores de CL50 en 0,06 ppm en An. albimanus y en An. quadrimaculatus. Mulla y col.¹⁰ y Yousten y col³⁹ obtuvieron valores de CL50 de 0,06 ppm en larvas de Culex quinquefasciatus, con el producto concentrado en polvo. Estos resultados evidencian que con dosis bajas se obtienen intervalos efectivos de mortalidad larval. Por otra parte los tiempos letales obtenidos demuestran que su acción larvicida es realizada en corto tiempo.

TABLA II
EFECTO DEL pH DE LA SOLUCIÓN SOBRE LA EFICACIA DEL Bacillus sphaericus CEPA 23 62 EN LARVAS DE Anopheles nuñeztovari.

Tiempo de Observación 72 horas.

    En los diferentes intervalos de pH evaluados no se observaron diferencias significativas en la mortalidad por efecto del mismo (Tabla II). Este hallazgo tiene gran importancia en el control de criaderos de este vector ya que los mismos poseen rangos de pH dentro de estos valores en la naturaleza. Yousten y col.³⁹ refieren que manteniendo el pH controlado cercano a la neutralidad, este bacilo esporula mejor y aumenta su toxicidad ya que el incremento de esta bacteria hace que el pH aumente de la neutralidad a pH 8,5 y 9, en fase estacionaria, por lo que siempre es importante realizar un estudio previo de las características físico-químicas del agua del criadero a tratar para evitar alteraciones de los resultados esperados. Morejón¹² encontró que en criaderos con pH 8,5, nitritos 1 ppm y amonio 5 ppm, la efectividad de la formulación no fue la esperada, al parecer la estabilidad de la toxina en los criaderos ensayados fue afectada por estas variables. En este sentido es importante realizar este tipo de análisis físico químico en todo criadero previamente al tratamiento con cualquier producto biológico, para lograr la efectividad deseada.

TABLA III
EFECTO DE LA RADIACION SOLAR EN LA EFECTIVIDAD DEL Bacillus sphaericus CEPA 2362 SOBRE LARVAS DE Anopheles nuñeztovari

Tiempo de observación 72 horas.

TABLA IV
EFECTO DE LA PRESENCIA DE VEGETACION EN LA EFECTIVIDAD DEL Bacillus sphaericus 2362 EN LARVAS DE Anopheles nuñeztovari

    En el ensayo bajo condiciones controladas de campo, se demuestra que bajo la radiación solar durante las primeras 8 horas de exposición, se produjo alta mortalidad a las 72 horas. A partir de 12 horas de exposición la actividad letal del B. sphaericus 2362 se redujo en un 30%. Al comparar estos resultados con el control bajo sombra con B. sphaericus 2362 se puede inferir, que en los criaderos protegidos de la radiación solar, la efectividad y persistencia del biopreparado será más efectiva que en los criaderos expuestos al sol, recomendándose en estos casos, hacer las aplicaciones en horas nocturnas y ajustar las dosis para asegurar la permanencia de la bacteria y la ingestión de la misma por la larva del mosquito. Mulla⁴⁵ y Morejón¹² aplicando B. sphaericus 2362 en las mismas condiciones de exposición a la radiación solar, obtuvieron un resultado similar con dosis de 10 ml/m², permaneciendo hasta dos semanas la acción del producto.

TABLA V
EFECTIVIDAD DEL Bacillus sphaericus cepa 2362 EN DOS CRIADEROS NATURALES DE LARVAS DE An. Nuñeztovari.

    Al analizar la variable presencia de vegetación en condiciones controladas de campo, se observó que la misma reduce la efectividad del producto en un 12% en promedio, en presencia de vegetación muy abundante. Morejón¹² y Montero y col.^{11, 46} demostraron que la presencia de vegetación abundante no influyó en la efectividad del B. sphaericus 2362, alcanzando 100% de mortalidad en criaderos naturales de An. albimanus en Cuba.

    En el ensayo bajo condiciones de campo, en un total de dos criaderos tratados con la formulación líquida de B. sphaericus 2362 con una titulación de 3 x 10⁹ esporas /ml y con una dosis de 10 ml/m² se obtuvo un porcentaje de reducción del 100% a las 72 horas, en larvas de An. nuñeztovari. Estos resultados son similares a los obtenidos por Ramoska⁴⁷ y Mulla y col.^{10, 45, 48} quienes encontraron en criaderos naturales, con la misma dosis de 10ml/m² un 100% de mortalidad en An albimanus a las 72 horas de aplicación. Karch y col²⁵ obtuvieron iguales resultados en el control de An. gambiae. Morejón¹² obtuvo también con la misma dosis, en campos de arroz de Cuba, una alta efectividad con la aplicación de este bacilo en el control de An. albimanus. Estos resultados evidencian que el Género Anopheles en general es muy susceptible a la acción de este bacilo, observándose además que las larvas de primeros estadios fueron mas susceptibles que las de tercero y cuarto ya que estas desaparecieron primero en los criaderos naturales tratados con el biolarvicida.

    Por otra parte Karch y col.²⁵ comprobaron que esta bacteria es capaz de germinar en el intestino de larvas de algunos artrópodos, incluso en los cadáveres de larvas muertas, por lo que la persistencia y el reciclaje de esta bacteria esporógena se deba a este fenómeno.^{12, 45} El reciclaje puede ocurrir a través de la germinación y crecimiento de la bacteria en el intestino larval, seguido por la formación de nuevas esporas las cuales son liberadas cuando el cadáver de la larva se desintegra. Este reciclaje también puede verse influenciado por las actividades de otros insectos en el hábitat de los mosquitos.²⁶

    El uso de B. sphaericus cepa 2362 posee un gran beneficio de acuerdo a los resultados obtenidos durante los ensayos, por su baja dosis de acción efectiva y su efecto residual que hace que las aplicaciones sean menos frecuentes, bajando así los costos en las actividades de control vectorial, así como también la inocuidad a la fauna y flora acompañante de los criaderos, respetando el ambiente y los ecosistemas, lo que hace vislumbrar un gran futuro en cuanto al empleo de este biolarvicida para el control de la malaria en nuestro país.

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