M Alvarez1, M Escorche2 y C Müler3.
1 Profesor Asociado, Sección de Microscopía Electrónica, Instituto Anatómico "José Izquierdo", FM - UCV.
2 Cátedra de Toxicología, Facultad de Farmacia UCV.–
3 Estudiante Pasante de la Escuela de Biología incorporada a la Sección de Microscopía Electrónica. E-mail: alvarezm@ucv.ve
RESUMEN: El presente trabajo estudia la toxicidad del AlCl3 sobre la fibra periférica de ganglio espinal de embrión de pollo cultivado en gota pendiente. Una estructura del sistema nervioso, hasta el momento, escasamente valorada como un blanco para el Aluminio. Una solución stock de AlCl3 750µM fue diluida en solución Tyrodes y aplicada, de manera aguda, a los cultivos de 24 horas en una concentración final de 75µM. Los resultados fueron obtenidos siguiendo el esquema de la microscopia digital. La Microscopia Electrónica fue ejecutada de acuerdo a los pasos convencionales. Los resultados muestran una disminución del movimiento de la membrana ondulante, con retracción de la misma y formación de filopodios. Las células acompañantes no presentan signos de retracción. Se resalta la presencia de formaciones varicosas a lo largo de la fibra, mayor electrondensidad mitocondrial y vesículas axoplásmicas de mayor tamaño. Se demuestra que el AlCl3 altera la estructura de la fibra periférica del ganglio espinal de embrión de pollo en cultivo, comprometiendo el proceso de transporte axonal. Se involucra a las mitocondrias como organelos subcelulares claves en la toxicidad del AlCl3. Habrá que realizar subsecuentes investigaciones orientadas a profundizar sobre la fijación de Aluminio a la estructura mitocondrial y el efecto neuro-tóxico del AlCl3.
Palabras Clave: Toxicidad del Cloruro de Aluminio, Fibra periférica de ganglio espinal, Embrión de pollo, Cultivo primario gota pendiente, Mitocondrias.
ABSTRACT: The effect of AlCl3 on peripheric branches of spinal ganglia of chick embryo in hanging drop culture was carried out. The sock solution of AlCl3 750µM in Tyrodes solution was applied, in acute exposure, on 24 h cultures to final concentration of 75µM. The main stages in the examination of digital microscopy data and electron microscopy was used. The results show decrease of wave motion and retraction of undulating membrane with filopodia formation. The accompanying cells not present retraction signs. The varicose shape, very dense mitochondria matrix and large cytoplasm vacuole was observed. Our studies demonstrate that morphology of peripheric branches of spinal ganglia "in vitro" is modified by AlCl3 acute exposure, and that is a correlation exists between the axonal transport suppression and mitochondria alteration. This suggests that mitochondria’s are important sub-cellular organelle in the aluminium neuronal injury.
Key Words: Aluminium chloride toxicity, Peripheric branches of spinal ganglia, Chicken embryo, Hanging drop culture, Mitochondria.
Fecha de Recepción: 21/09/2004 Fecha de Aprobación: 28/10/2004
]]> INTRODUCCIÓNPor mucho tiempo el aluminio ha sido considerado como un elemento de poca importancia desde el punto de vista toxicológico. Sin embargo, en los últimos años han sido presentadas evidencias, clínicas y experimentales, que demuestran que el aluminio es un potencial agente tóxico. El aluminio y los distintos compuestos que con él se conforman, interfieren en una gran variedad de procesos celulares y metabólicos del sistema nervioso y han sido implicados en la patogénesis de severos desordenes neurodegenerativos entre los que se destacan Alzheirmer’s, Parkinson entre otros (Perl y Brody 1982, Ludoph 1996, Xieu y col, 1996, Jeffery y col, 1996). Esta situación ha dirigido la investigación hacia el desarrollo de modelos experimentales que permitan entender los eventos celulares involucrados en la generación de daños tóxicos producidos por el aluminio ya que, a pesar de ser ampliamente aceptada su acción neurotóxica, poco se conoce cómo se produce dicha acción. La caracterización, estructural y ultraestructural, de las fibras periféricas y centrales de ganglio espinal de embrión de pollo (Barasa y col, 1970), así como el cultivo de moto neuronas del ganglio espinal embrionario (Fessessework y Borrows, 1997), son modelos experimentales que han permitido evaluar de manera eficiente la neurotoxicidad de numerosos agentes químicos. Particularmente, el uso de moto neuronas de ganglio espinal ha sido un modelo experimental eficientemente utilizado en el estudio de la neurotoxicidad del aluminio (Tanridag y col, 1999). Mas recientemente el uso de líneas celulares humanas de origen neural, ha permitido analizar la toxicidad diferencial del aluminio y las implicaciones en la neurodegeneración (Campbell y col, 2001). El presente trabajo tiene como objetivo estudiar la acción tóxica del cloruro de aluminio (AlCl3), por exposición aguda, sobre fibras periféricas de ganglio espinal embrionario cultivado en gota pendiente. Se analizan los cambios morfológicos de las fibras periféricas "in vitro", a través de la observación continua en video-cámara, durante distintos tiempos de exposición al AlCl3. Se evalúa también, la expresión ultraestructural de las fibras periféricas al haber concluido el tiempo de exposición al AlCl3.
MATERIALES Y MÉTODOS
Embriones de pollo de 11 días de desarrollo (Hamburger y Hamilton, 1992), obtenidos por incubación (37ºC y 85% humedad relativa) de huevos fértiles provenientes de la región de La Morita, San Antonio de los Altos, Estado Miranda, fueron expuestos a través de las técnicas convencionales de manipulación embrionaria (Freshney, 1994). Una vez expuestos los embriones, se procedió a la obtención de la cadena de ganglios espinales, ubicados lado a lado del extremo lumbar del embrión. Para ello se disecaron las porciones central (pc) y periférica (pp), que conecta la estructura ganglionar (Figura 1). Los ganglios aislados fueron explantados en una mezcla de extracto y plasma embrionario, en una proporción 1:1 de acuerdo a la técnica de la gota pendiente (Álvarez y col, 2001). Transcurridas 24 horas de cultivo, se procedió a poner en contacto directo con la solución de AlCl3 (Sigma, Chemical CO, St Louis, USA) aquellos cultivos seleccionados de acuerdo al grado de desarrollo del área de crecimiento obtenido. Otros cultivos fueron seleccionados como grupo control. Una solución stock de AlCl3 750µM fue diluida en solución Tyrodes y aplicada a los cultivos en una concentración final de 75µM. Dicho contacto fue realizado bajo control de temperatura a 37ºC. Los resultados fueron obtenidos a través del esquema siguiente: a) adquisición de imágenes b) esquema de conversión c) procesamiento de la imagen que incluye análisis y exposición (Ladic, 1998). La adquisición de las imágenes fue realizada a través de un microscopio OLYMPUS BX50 de contraste de fase con cámara CCD video color OLYMPUS U-CMAD-2 incorporada y a través del programa de captura Imagen Setting ubicado en un computador de plataforma INDY Silicon Graphics, conectado al microscopio. El esquema de conversión se realizó a través del programa Media Converts incorporado a la INDY. Por último, los programas Imagen Work, CuteFTP 2.0, Adobe Photoshop 5.0 y Microsoft Power Point, incorporados en un PC Intel inside Windows XP, permitieron el análisis y exposición final de las imágenes. Una vez transcurrido el tiempo de exposición al AlCl3 , las muestras fueron procesadas con las técnicas convencionales para Microscopía Electrónica. Para ello los cultivos fueron sumergidos en glutaraldehido 2,5%, para ser fijados durante 30 minutos. Seguidamente fueron lavados en solución Tyrode y postfijados con tetróxido de osmio (OsO4) 1% durante 60 minutos. Luego fueron sometidos a serie creciente de alcoholes 30, 50, 70, 95% para ser deshidratados a 4ºC. Los cultivos fueron removidos y cortados en secciones iguales conteniendo las áreas de crecimiento de las fibras periféricas. Los distintos fragmentos fueron colocados en uranilo / etanol 12 horas y luego fueron embebidos en resina epóxica, para luego ser cortados con cuchilla de diamante. Los cortes fueron contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo y observados en un microscopio Hitachi 300, 80Kv. Los datos de las mediciones morfométricas realizadas, fueron procesados con el programa Microsoft Excel aplicando la estadística básica para el calculo del promedio de las muestras, controles y tratadas, y el cálculo del crecimiento exponencial de comparación entre ambas.
Figura 1
(a) Ganglio espinal. Porción central (pc), porción periférica (pp). Embrión de pollo de 11 días de desarrollo. b) Representación gráfica de las prolongaciones o fibras periféricas crecidas in vitro c) Área de crecimiento del cultivo de ganglio espinal en gota pendiente. Explante (ex). Barra 1cm = 100µm.
RESULTADOS
Una secuencia de imágenes digitalizadas ilustra el comportamiento y las características morfológicas de las fibras periféricas en contacto directo con el AlCl3, (Figura 2). A bajos aumentos (Figura 2a), se observa un área de crecimiento que contiene una población de delgadas expansiones o fibras provenientes del ganglio espinal obtenidas luego de 24 horas de cultivo. Seguidamente se pueden observar unas estructuras alargadas en forma de bastones con un acentuado movimiento de tipo ondulatorio en la extremidad de la fibra (Figura 2a’). También, se resalta la relación entre las fibras del extremo periférico del ganglio espinal y unas células acompañantes (Figura 2a’’), en las cuales se destaca el amplio y extendido citoplasma (recuadro) que las caracteriza. Durante la fase inicial de contacto con el AlCl3, se considera como tiempo cero (T0) el tiempo de un minuto contacto (T0=1’) en el cual se describen las características morfológicas y se considera como la fase de control de la experimentación. Para corroborar las características iniciales, se contrastan con el grupo control tratado con solución Tyrodes. A mayor magnificación, se resalta una estructura membranosa ubicada en el extremo terminal de las prolongaciones del ganglio o fibras periféricas con un movimiento ondulatorio provenientes de éstas. A medida que transcurre el tiempo de contacto con el AlCl3, se observa un proceso de retracción de la membrana ondulante con disminución de los movimientos ondulatorios y ocurre la formación de estructuras con características de filopodios que se visualizan con mayor detalle en la región terminal de la fibra transcurrido el tiempo de cuarenta y cinco minutos, T3=45’ (flecha). Los filopodios se muestran también a lo largo de la fibra al cumplirse una hora, T4=60’ de interacción con el AlCl3. Cabe resaltar que las células acompañantes, cercanas a las fibras, no presentan ningún tipo de señal de retracción de la estructura citoplasmática ni formación de filopodios. Concomitantemente a la retracción de la membrana ondulante, el cuerpo de la fibra presenta un aspecto varicoso con la presencia de pequeñas protuberancias (Figura 3a.flecha). Cortes longitudinales de las fibras periféricas describen características ultraestructurales de las fibras controles (Figura 3b) y tratadas (Figura 3c). En el control se resalta el contenido neurofibrilar de las prolongaciones periféricas del ganglio espinal, las cuales se visualizan como estructuras semejante a hebras de hilo que corren paralelas o entrecruzadazas a lo largo del neuroplasma (flecha). Se resalta también la presencia de numerosas vesículas axoplasmáticas o cuerpos vesiculares de variables tamaños (asteriscos).
Figura 2
]]> Secuencia de imágenes digitalizadas de fibra periférica de ganglio espinal en contacto temporal con el AlCl3
Tiempo cero T0 = 1 minuto de contacto con AlCl3 (T0 = 1’). T2 T3 T4 a) Población fibrilar en cultivo de gota pendiente. a’) Extensión o fibra periférica a’’) Células acompañantes. Se resalta la célula acompañantes durante el tratamiento. Barra 1cm = 10µm.
Figura 3
a) Aspecto del cuerpo de la prolongación o fibra periférica luego de una hora de contacto con AlCl3; b) Corte longitudinal del cuerpo de la fibra periférica; c) Corte longitudinal del cuerpo de la fibra periférica tratada con AlCl3.
a) Se resaltan las estructuras abultadas o varicosidades (flecha) y los filopodios (doble flecha).
b) Se resaltan el aspecto fibrilar (doble flechas), las mitocondrias y los cuerpos vesiculares (asterisco).
Barra 1 cm = 0,02 µm.
]]> c) Se resaltan la densidad mitocondrial. Barra 1 cm = 0,025 µm.Numerosas mitocondrias, dispuestas a lo largo del eje principal de la fibra, resultan evidentes. Las mitocondrias se presentan con matriz diferencialmente electrón denso, con zonas electrón transparente en el interior de la matriz. En contraste con la ultraestructura de las fibras tratadas con AlCl3 , el contenido neurofibrilar se hace más electrondenso (flecha). Los cuerpos vesiculares se presentan igualmente numerosos, sin embargo, de mayor tamaño aparente y con cierto contenido denso (asterisco). Las mitocondrias se presentan como cuerpos en forma de bastones de menor tamaño aparente, con mayor electrón-densidad donde no se distingue la porción interna de la matriz. El efecto de contraste producido fotográficamente resalta esta característica (Figura 4). Mediciones morfo-métricas realizadas sobre los cuerpos vesiculares, controles y tratados, demuestran que dichas estructuras presentan una tendencia exponencial al incremento del tamaño en las fibras tratadas respecto a los cuerpos vesiculares en la fibra control (Figura 5).
Figura 4
a) Se resalta el efecto de contraste sobre una área contentiva de mitocondrias y cuerpos vacuolares. Control (a) y Tratados con AlCl3. (b) Mayor electrón densidad en el interior de la matriz interna de las mitocondrias Se representa de manera gráfica la tendencia exponencial en el incremento del tamaño de las vesicular citoplasmáticas en la fibra tratada con AlCl3.
DISCUSIÓN
En el presente trabajo se ha investigado el efecto agudo de AlCl3 sobre las prolongaciones o fibras periféricas de ganglio espinal de embrión de pollo, obtenidas por cultivo primario en gota pendiente. El análisis microscópico indica que, el AlCl3 induce una variedad de señales morfológicas vinculadas con una alteración de la actividad de conducción axonal de la fibra periférica del ganglio espinal. Otras investigaciones con exposiciones agudas de agentes como la vincaleucoblastina (VLB) y la colchicina, compuestos alcaloides que producen depolimerización de estructuras microtubulares, han permitido evaluar la vinculación entre la actividad de conducción y las características estructurales de las fibras periféricas (Barasa y col, 1970). Cabe resaltar que la actividad de conducción axonal de las fibras periféricas en cultivo ha sido relacionada, desde hace mucho tiempo, con las características estructurales de las dendríticas de células neuronales del ganglio espinal (Tennyson 1965, Filogamo y Barasa 1966). A pesar de este conocimiento, dicha relación ha sido poco manipulada experimentalmente. Solo en décadas más recientes, se ha intervenido esta relación anátomo-funcional con la aplicación intracraneal de aluminio en animales de experimentación y se han expresado cambios en la morfología de las dendritas relacionadas con el bloqueo del transporte axonal (Boegman y Bates 1984). El presente trabajo representa un ejemplo del efecto del AlCl3 sobre estructuras periféricas del sistema nervioso, hasta el momento, escasamente valoradas como sitios afectados por el Aluminio. Cabe resaltar que con la retracción de la membrana ondulante, se detiene la ingesta de fluidos o proceso de pinocitocis el cual ha quedado establecido que se lleva a cabo a nivel de la membrana ondulante de la fibra periférica ganglionar (Barasa y col, 1970). La interrupción en el proceso de pinocitocis, podría estar relacionado con una reducción del movimiento del material citoesqueletal y acumulación del mismo. Una acumulación similar a la acumulación intracelular de neurofilamentos producida por la colchicina (Bizzi y col, 1983). La presencia de varicosidades en el cuerpo de la fibra ganglionar y el incremento aparente del tamaño vesicular encontrado en nuestros resultados apoya este planteamiento. En otro tipo de célula nerviosa en cultivo, se ha sugerido que el aluminio altera proteínas del citoesqueleto tales como MAP2 y NF, conduciendo así a la interrupcion del transporte y degeneración celular (Langui y col, 1988, Jonson y col, 1992). Si ocurre de igual manera en la fibra periférica de ganglio espinal embrionaria, quedaría por ser demostrado. Por otra parte, estudios "in vivo" e "in vitro" han enfatizado que el aluminio induce respuestas de estimulación e inhibición de variados procesos en diversos tipos celulares (Exley y Birchall, 1992). Sin embargo, los sitios celulares que actúan como blancos para el aluminio poco se conocen. Al respecto cabe resaltar que las mitocondrias han sido involucradas como estructuras claves en la toxicidad de aluminio. Estudios recientes indican que el aluminio se enlaza a la membrana interna mitocondrial generando un colapso del gradiente electroquímico, la acumulación del Ca++ y la oxidación de nucleotidos de piridina (Toninello y col, 2002). Más recientemente se ha demostrado atrofia mitocondrial en el hipocampo de ratas jóvenes sometidas al tratamiento crónico con el Gluconato de Aluminio (Miu y col, 2003, 2004). Nuestros resultados se suman a este planteamiento, ya que la condensación mitocondrial mostrada así lo sugiere. La presente investigación demuestra que el AlCl3 altera la estructura de la fibra periférica del ganglio espinal de embrión de pollo en cultivo. Se compromete así la relación anátomo-funcional de la estructura fibrilar periférica a través de modificaciones en el proceso de circulación en el interior de la fibra, e involucra a las mitocondrias como organelos subcelulares claves en la toxicidad del AlCl3. Habrá que realizar subsecuentes investigaciones orientadas a profundizar sobre la relación propuesta.
AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Mirian Brito por la lectura y sugerencias sobre el texto. A la Sra Marianela Rodríguez IMT, por su colaboración en los cortes para Microscopia Electrónica. Apoyo del Proyecto CDCH Nº 09-34-4979-2002.
]]> REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS1. Alvarez M, Stojanovic A, Garcia J, Anselmi G. El glucantime induce cambios en la morfología y organización de la actina de mioblastos cardiacos cultivados en gota pendiente. ¿L-carnitina previene estos cambios?. Inf Med 2001; 3: 691-702. [ Links ]
2. Barasa A, Maccotta V, Filogamo G. Etude au microscope électronique des prolongements, periphérique et central, des cellules de ganglions spinaux d’embryons de poulet cultivés in vitro. Bulletin de l’Association des Anatomistes. Turín. Italy. 1970; 147: 115-122. [ Links ]
3. Bizzi A, Crane R, Yin M, Autilio-Gambetti L, Gambetti P. The axonal transport of neurofilaments is impaired in aluminium intoxication. J Exp Neurol. 1983; 41:331. [ Links ]
4. Boegman RJ y Bates LA. Neurotoxicity of aluminium. Can J Physiol Pharmacol. 1984; 62: 1010-1013. [ Links ]
5. Campbell A, Hamai D, Bondy SC. Differential toxicity of aluminium salts in human cell lines of neural origin: implications for neurodegeneration. Neurotoxicology. 2001; 22 (1): 63-71. [ Links ]
6. Exley C y Birchall JD. The cellular toxicity of aluminium. J Theor Biol. 1992; 159: 83-98. [ Links ]
7. Filogamo G, Barasa A. Accrescimento in vitro dei prolungamenti, periferico e centrale, dei neuroni dei gangli spinali. Boll Soc It Biol Sper. 1966; 41: 1112-1114. [ Links ]
8. Freshney RI. Disaggregation of the tissue and primary culture. In:Culture Animal Cells. Publicaciones; Wiley-Liss 3era Edición. Capitulo 9: 127-147. [ Links ]
9. Fessessework G, Burrows E. Evaluation of chick embryo spinal motoneuron cultures for the study of neurotoxicity. Natural Toxins. 1997; 5: 115-120. [ Links ]
10. Freshney RI. Disaggregation of the tissue and primary culture. In Culture of Animal Cells. Third Edition. 1984; cap 9: 127-148. [ Links ]
11. Hamburger V, Hamilton HL. A series of normal stages in the development of chick embryo. Develop Dynam.1992; 195(4): 231-272. [ Links ]
12. Jeffery EH, Abreo K, Burgess E, Cannata J, Greger JL. Systemic aluminium toxicity; effects on bone, hematopoietic tissue and kidney. Journal of Toxicology and Environmental Health. 1996; 48: 649-665. [ Links ]
13. Johnson GVW, Watson AL, Lartius R, Uemura E, Jope RS. Dietary aluminium selectively decrease MAP-2 in brain of developing and adult rat. Neurotoxicology. 1992; 13: 463-474. [ Links ]
14. Ladic AL. The use of internet graphics software for the processing and display of digital microscopy data. In Cell Biology: A LABORATORY HANDBOOK, Second Edition. Academic Press. 1998; 3: 189-205. [ Links ]
15. Langui D, Anderson BH, Ulrich J. Effects of aluminium chloride on culture cells from rat brain hemispheres. Brain Res. 1988; 438: 67-76. [ Links ]
16. Ludolph AC. Animal model for motor neuron diseases: research directions. Neurology. 1996; 4 (Suppl 4): 228-232. [ Links ]
17. Perl DP, Brody AR. Alzheimer’s disease: X-ray spectrometric evidence of aluminium accumulation in neurofibrillary tangle-bearing neurons. Science. 1982; 208: 297-299. [ Links ]
18. Miu AC, Andreescu CE, Vasiu R, Olteanu AL. A behavioural and histological study of effects of long-term exposure of adult rats to aluminium.I Int. J. Neurosci. 2003; 113(9): 1197-1211. [ Links ]
19. Miu AC, Olteanu AI, Miclea M. A behavioural and ultrastuctural dissection of interference of aluminium with aging. J Alzheimers Dis. 2004; 6(3):315-328. [ Links ]
20. Tanridag T, Coskun T, Hürdag C, Arbak S, Aktan S, Yegen B. Motor neuron degeneration due to aluminium deposition in spinal cord: a light microscopical study. Act Histochem. 1999; 101: 193-201. [ Links ]
21. Tennyson VM. Electron microscopic study of the developing neuroblasts of the dorsal root ganglion of the rabbit embryo. J Comp Neurol. 1965; 124: 267-318. [ Links ]
22. Toninello A, Clari G, Mancon M, Tagnon G, Zatta P. Aluminum as a inducer of mitochondrial permeability transition. J Biol. Inorg Chem. 2000; 5(5): 612-123. [ Links ]
23. Xieu CM, Mattson MP, Lovell MA, Yokel RA, Intraneuronal aluminium potentiates iron-induced oxidative stress in cultured rat hippocampal neurons. Brain Res. 1996; 743: 271-277. [ Links ] ]]>