Henry Gómez ¹, Raiza Fernández ¹*, Zully Benzo ², Federico Galarraga ¹, Jesús Hernández ³, Antonio Roschman-González ⁴

RESUMEN

Los líquenes pueden ser empleados como biomonitores para la investigación y el control de la contaminación del aire, por comportarse como instrumentos válidos para evaluar la calidad del aire afectada por emisiones provenientes de fuentes móviles o fijas. En este contexto, esta publicación pretende recopilar abundante información sobre el progreso de las investigaciones relativas al uso de los líquenes como biomonitores de la calidad del aire, con énfasis en la determinación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). El objetivo de esta revisión es recopilar los resultados de investigaciones que en esta materia se han desarrollado, posteriores al año 2001, cuando se realiza la publicación de Conti & Cecchetti (Biological monitoring: lichens as bioindicators of air pollution assessment – a review). La presente revisión señala las líneas más importantes en el estado del arte del conocimiento en este campo, evaluando las aplicaciones metodológicas de los líquenes (muestreo, tratamiento físico y químico, instrumentación analítica, herramientas estadísticas y perspectivas futuras) al igual que las ventajas/desventajas con respecto a los métodos de monitoreo convencionales.

Palabras clave: Contaminación atmosférica, Monitoreo biológico, Líquenes, Bioacumulación, Hidrocarburos aromáticos policíclicos.

Lichens can be used as a biomonitors for research and control of air pollution since they are valid instruments for assessing air quality affected by emissions from mobile or fixed sources. In this context, this paper manages to collect extensive information about the progress of research on the use of lichens as biomonitors of air quality, with emphasis on the determination of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). The aim of this review is to compile the results of research in this area that have been developed after 2001, when performing the publication of Conti and Cecchetti (Biological monitoring: lichens as bioindicators of Pollution assessment - a review). This review discusses the most important lines in the state of the art knowledge in this field, assessing the lichens methodological applications (sampling, physical and chemical treatment, instrumental analysis techniques, statistical tools and future prospects) and their advantages / disadvantages with respect to conventional research methods.

Keywords: Air pollution, Biological monitoring, Lichens, Bioaccumulation, Polycyclic aromatic hydrocarbons.

En este sentido, diversos países del mundo (Argentina, Eslovenia, España, Estados Unidos, Francia, Italia, Portugal, entre otros) han continuado el desarrollo de investigaciones con el fin de examinar en detalle el potencial de los líquenes como bioindicadores de la presencia de metales y biomonitores de la calidad del aire (Carignan et al. 2002; Jeran et al. 2002; Bennett & Berson, 2005; Carreras et al. 2009).

Del mismo modo, países como Brasil y Venezuela se han incorporado recientemente al estudio de tan importante tema, especialmente en zona urbanas, con énfasis en evaluar el potencial de los líquenes como biomonitores de la contaminación del aire por metales y HAP (Saiki et al. 2006; Figuereido et al. 2007; Fuga et al. 2008; Fernández et al. 2011).

A diferencia del elevado número de estudios en los cuales han sido empleados líquenes como bioindicadores/ biomonitores de metales pesados (Branquinho et al. 1999; Bernasconi et al. 2000; Nimis et al. 2001; Conti & Cecchetii, 2001; Jeran et al. 2002; Scerbo et al. 2002; Carreras & Pignata, 2002; Zschau et al. 2003; Garty et al.2003; Tuncel et al. 2004; Williamson et al. 2004; Bennett & Berson, 2005; Cloquet et al. 2006; Monnet et al. 2006; Bergamaschi et al. 2007; Brunialti & Frati, 2007; Carreras & Pignata, 2007; Godinho et al. 2008; Rusticelli et al. 2008; Sorbo et al. 2008; Basile et al. 2008; Branquinho et al. 2008; Conti et al. 2009), son escasas las investigaciones que reportan el empleo de líquenes como bioindicadores/ biomonitores de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP). A nivel internacional encontramos menos de treinta (30) publicaciones referidas a la determinación de este grupo de compuestos en líquenes, siendo ocho los países pioneros en esta línea de investigación: España, Italia, India, Canadá, Polonia, Portugal, Suecia y Venezuela

Al igual que para el resto de las especies químicas, los mecanismos propuestos para la incorporación de estos contaminantes al tejido biológico son la deposición húmeda y deposición seca de partículas, así como la absorción de compuestos en fase gaseosa ya sea disueltos en agua o como aerosoles (Blasco et al. 2006, 2008; Augusto et al. 2009; Shukla et al. 2010; Satya et al. 2012).

El empleo de líquenes como indicadores biológicos de HAP ha tenido aplicación principalmente en zonas urbanas, tomando como criterio de selección de las estaciones de muestreo los distintos niveles de flujo vehicular en las principales calles y avenidas. En algunos casos se ha diseñado la toma de los líquenes de acuerdo a la cercanía o lejanía de la autopista principal a la zona de estudio, debido a que la actividad de los vehículos a motor es una de las principales fuentes de HAP (Owczarek et al. 2001; Guidotti et al. 2003; Shukla & Upreti, 2009; Augusto et al. 2009; Guidotti et al. 2009; Shukla et al. 2010; Gómez, 2010; Fernández et al. 2011; Blasco et al. 2011; Satya et al. 2012). Diversos estudios se han efectuado en zonas rurales o remotas (Migaszewski et al. 2002; Blasco et al. 2006, 2008; Shukla et al. 2010; Blasco et al. 2011), zonas industriales (Augusto et al. 2009; Satya et al. 2012) y mineras (Naeth & Wilkinson, 2008).

En la mayoría de las investigaciones han sido efectuados muestreos de tipo pasivo, es decir se colectan y analizan los líquenes desde sus ecosistemas naturales (Owczarek et al. 2001; Migaszewski et al. 2002; Blasco et al. 2006, 2008; Naeth & Wilkinson, 2008; Shukla & Upreti, 2009; Augusto et al. 2009; Shukla et al. 2010; Fernández et al. 2011; Blasco et al. 2011; Satya et al. 2012), la razón del empleo de este tipo de muestreo radica en que en su mayoría estas investigaciones corresponden a estudios de tipo piloto (evaluaciones preliminares) en los cuales uno de los objetivos es probar la factibilidad del uso de líquenes como biomonitores y/o bioindicadores de la contaminación atmosférica en dichas localidades. Hasta el presente, sólo Guidotti et al. (2003; 2009) y Gómez (2010) han trasplantado los biomonitores de su ecosistema natural (localidad de referencia) a zonas urbanas, exponiéndolos a dicha atmósfera por más de 3 meses, para evaluar variaciones en la concentración de los HAP en el tiempo.

En caso del biomonitoreo activo (método de transplante) los procedimientos deben ser muy bien estandarizados debido a que muchos otros factores pueden afectar la respuesta de los líquenes a los contaminantes en un área donde usualmente los líquenes no crecen (Gómez, 2010). En este sentido, es recomendable protegerlos una vez trasplantados de la incidencia directa de la radiación solar, colocarlos entre 2 y 5 m de altura respecto al suelo, preferiblemente a la misma altura, y garantizar que el área superficial expuesta de los biomonitores sea lo mayor y más homogénea posible en todas las localidades estudiadas (Pignata et al. 2008).

Cuidados adicionales en la toma de las muestras para el análisis de los HAP, son el no fumar cerca de las muestras para evitar su contaminación y secar las muestras a temperatura ambiente antes de ser guardadas, con el fin de prevenir su descomposición (Migaszewski et al. 2002). En relación con la edad de los líquenes a colectar, Blasco et al. (2006; 2007; 2008) indican que estos deben corresponder a todas las edades (de forma aleatoria). Por otro lado, Shukla et al. (2010) señalan haber tomado líquenes con talos entre 3 y 5 cm de diámetro, delimitando así la edad de los mismos, para así minimizar cualquier varianza en el muestreo introducida por este factor.

Con respecto al número de muestras tomadas por cada localidad o estación de muestreo, Guidotti et al. (2003; 2009) y Gómez (2010) posicionan los líquenes en al menos 2 árboles (forofitos), para de esta forma tener en cuenta la dispersión intralocal de los HAP, mientras que Owczarek et al. (2001) y Blasco et al. (2006, 2007, 2008) muestrearon en cada punto al menos 4 árboles diferentes. En este sentido, Naeth & Wilkinson (2008), tomaron 3 muestras líquenes terrícolas ubicados a 10 m entre ellas, teniendo en cuenta dicha variabilidad intralocal (debida a diferencias sutiles en la posición en que se encuentran ubicados los líquenes).

En la mayoría de las publicaciones se ha reportado el empleo de líquenes con talo de morfología foliácea y/o fruticulosa (Owczarek et al. 2001; Migaszewski et al. 2002; Domeño et al. 2006; Blasco et al. 2006, 2007 y 2008; Naeth & Wilkinson, 2008; Shukla et al. 2009; Augusto et al. 2009; Guidotti et al. 2003 y 2009; Shukla et al. 2010; Gómez, 2010; Fernández et al. 2011; Blasco et al. 2011) debido principalmente a la facilidad que presenta este tipos de líquenes para ser removidos del sustrato, en comparación con los de morfología tipo crustáceo, que se presentan mucho más adheridos al sustrato. Adicionalmente los líquenes crustáceos son más resistentes a la contaminación debido a su menor superficie lo que trae como consecuencia una menor acumulación de las especies de interés (Vareschi, 1953). Entre las especies de talo foliáceo utilizadas como bioindicadores/biomonitores de contaminación por HAP, destacan: Dermatocarpon vellereum Zschacke, Heterodermia angustiloba (Müll. Arg.) D.D. Awasthi, Hypogymnia physodes (L.) Nyl, Lobaria pulmonaria (L.) Hoffm., Parmelia sulcata Taylor, Parmotrema hypoleucinum (J. Steiner) Hale, Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale, Phaeophyscia hispidula (Ach.) Essl., Phaeophyscia orbicularis (Neck.) Moberg, Physcia adscendens (Fr.) H. Olivier, Pyxine coralligera Malme y Xanthoria parietina (L.) Beltr; entre las de talo fruticuloso: Cladina arbuscula (Wallr.) Burgaz, Usnea sp., Flavocetraria nivalis (L.) Kärnefelt & A. Thell y Flavocetraria cucullata (Bellardi) Kärnefelt & A. Thell; entre las que poseen características intermedias foliáceo-fruticulosas están: Evernia prunastri (L.) Ach., Pseudevernia furfuracea (L.) Zopf y Ramalina farinacea (L.) Ach.; con características intermedias crustáceo-escuamulosos: Acarospora bullata Anzi, Aspicilia praeradiosa (Nyl.) Poelt & Leuckert y Dimelaena oreina (Ach.) Norman; y con talo crustáceo: Rinodina sophodes (Ach.) Massal.

Otro criterio importante para la selección de la especie de liquen a emplear es la abundancia de dicha especie en la zona de estudio. La mayoría de las investigaciones emplean líquenes que viven o crecen sobre la corteza de los árboles (corticícolas) (Owczarek et al. 2001; Migaszewski et al. 2002; Domeño et al. 2006; Blasco et al. 2006, 2007 y 2008; Guidotti et al. 2003 y 2009; Augusto et al. 2009; Shukla et al. 2010; Gómez, 2010; Fernández et al. 2011; Blasco et al. 2011; Satya et al. 2012). Naeth & Wilkinson (2008) utilizan líquenes que crecen sobre el suelo o la tierra (terrícolas) y Shukla et al. (2010) toman líquenes que viven sobre las rocas (saxícolas). En este aspecto, cabe destacar que el parámetro altura respecto al suelo, mencionado en la etapa de muestreo, es mucho más fácil de controlar en los organismos epífitos que en aquellos que crecen directamente en la roca o en el suelo.

En el periodo de tiempo comprendido desde la toma de los líquenes y su tratamiento físico y químico en el laboratorio, las muestras deben ser debidamente preservadas a baja temperatura con el objeto de evitar al máximo la pérdida de los HAP más volátiles y protegidas de la radiación solar para evitar la fotólisis de los compuestos de interés. En este orden de ideas, Migaszewski et al. (2002) reportan que las muestras fueron colocadas en frascos oscuros de vidrio y refrigeradas a -10 °C. Domeño et al. (2006) y Blasco et al. (2006; 2007; 2008; 2011) preservaron los líquenes en papel de aluminio, y hasta el momento del análisis, los almacenaron en viales de vidrio sellados y a una temperatura de 4 ºC; por su parte, Shukla & Upreti (2009), Shukla et al. (2010) y Satya et al. (2012) indican que los líquenes fueron envueltos en papel de aluminio y mantenidos a baja temperatura hasta el momento de los análisis y previeron realizar los análisis a menos de una semana de la recolección de las muestras, lo cual es recomendable en el estudio de este tipo de compuestos, ya que permite minimizar los riesgos asociados con su elevada inestabilidad fisicoquímica. Augusto et al. (2009) colocaron las muestras en botellas de vidrio marrones, protegidas de la luz del sol, e inmediatamente las almacenaron a 4 °C; Gómez (2010) mantuvo los líquenes envueltos en papel de aluminio y a bajas temperaturas, con el objeto de evitar al máximo la pérdida de los HAP más volátiles y la fotólisis de los mismos. Asimismo, Fernández et al. (2011) mantuvieron las muestras a -20 °C en frascos de vidrio ámbar hasta su análisis.

Otro aspecto a destacar es el referido al tratamiento físico de las muestras el cual no ha sido estandarizado, por lo que cada autor reporta pasos distintos para esta etapa de los análisis. Owczarek et al. (2001) efectuaron un lavado de las muestras para eliminar el polvo, las mantuvieron por 48 h a una temperatura de 45 °C y las pulverizaron en un mortero de ágata. Migaszewski et al. (2002) secaron las muestras a temperatura ambiente (sobre 16 °C), fueron lavadas 3 veces con agua deionizada para remover las partículas minerales y de polen y secadas nuevamente a temperatura ambiente, para posteriormente disgregarlas manual o mecánicamente y las tamizaron hasta tener un tamaño < 0,063 mm. Guidotti et al. (2003; 2009) secaron los líquenes a 40 °C por 48 h en una estufa; las muestras fueron limpiadas, removiendo material extraño como polvo, restos de hojas, insectos y guijarros empleando un microscopio. Luego fueron pulverizadas en un mortero de ágata; dicho procedimiento fue seguido también por Gómez (2010) y Fernández et al. (2011), los cuales adicionalmente emplearon nitrógeno líquido en la pulverización de las muestras. Fernández et al. (2011) incluyen previo al secado de los líquenes el lavado o enjuague de los mismos empleando agua deionizada y agitando suavemente, sin embargo, Gómez (2010) recomienda prescindir de dicho paso debido a que en el mismo se tienden a perder HAP, tanto asociados con las partículas, como con la fase gaseosa. Por su parte, Domeño et al. (2006) y Blasco et al. (2006; 2007; 2008; 2011), una vez en el laboratorio, eliminaron restos de corteza o de otros materiales que pudieran haber quedado adheridos a los líquenes y los secaron a una temperatura de 35 ºC de 3 a 4 días; una vez secos, fueron triturados y homogeneizados hasta tener una muestra pulverizada. Asimismo, Satya et al. (2012) dejaron secar los líquenes al aire.

En este sentido, el método de extracción convencional HAP en muestras ambientales ha sido el empleo del aparato Soxhlet (Naeth & Wilkinson, 2008; Augusto et al. 2009; Shukla & Upreti, 2009 Shukla et al. 2010 y Satya et al. 2012), tomando como referencia principal los métodos 3540 de la United States-Environmental Protection Agency (US-EPA) (16-24 h, 300 mL de solvente). Este método suele considerarse como un procedimiento exhaustivo para extraer los contaminantes a partir de las matrices sólidas, sin embargo constituye el método de referencia que valida cualquier otro método de extracción. Shukla & Upreti (2009), Shukla et al. (2010) y Satya et al. (2012) utilizan como solvente 100 mL de diclorometano durante 16 h (método 8310 de la US-EPA), mientras que Augusto et al. 2009 utilizan 200 mL de acetonitrilo por 24 h, en ambos casos fueron tratados 2 g de la muestra de liquen. Por su parte, Migaszewski et al. (2002) utilizan como solvente en la extracción de los compuestos orgánicos diclorometano haciendo uso del aparato Soxtec, el cual es un equipo que realiza la extracción en continuo y por condensación, más eficiente que el aparato Soxhlet tradicional, en términos de rapidez, exactitud y precisión, pudiendo analizar varias muestras de manera simultánea y automatizada.

Owczarek et al. (2001), Guidotti et al. (2003; 2009), Gómez (2010) y Fernández et al. (2011) emplean como metodología de extracción la técnica de extracción estática asistida por ultrasonidos. La elección de dicha técnica fue hecha tomando en cuenta las ventajas que la misma ofrece en términos de tiempo y cantidad de solvente empleado, en comparación con el método de extracción convencional (Soxhlet). Owczarek et al. (2001) utilizan como solvente diclorometano, efectuando la extracción por duplicado, durante 20 min para 1 g de muestra. Guidotti et al. (2003; 2009) emplean como solvente 30 mL de ciclohexano en 2 g de muestra, por 30 min, realizando dicho procedimiento por duplicado con el mismo sólido residual, para posteriormente combinar los extractos. Asimismo, Fernández et al. (2011), siguiendo el procedimiento anteriormente mencionado, extraen 2 g de liquen con 30 mL de la mezcla ciclohexano:diclorometano (4:1 v/v) empleando un baño de ultrasonido a temperatura ambiente por 30 min, realizando dicho procedimiento por duplicado con el mismo sólido residual, para posteriormente combinar los extractos. Gómez (2010) logra reducir el tiempo de extracción a 15 min y emplea como solvente la mezcla hexano:diclorometano (3:2 v/v), para la misma cantidad de sólido y solvente empleada por Fernández et al. (2011).

La contribución más significativa en términos de tiempo de extracción, cantidad de solvente y masa de muestra requerida para la cuantificación de los HAP fue la aportada por Domeño et al. (2006), quienes con el objeto de optimizar dicha etapa del tratamiento de la muestra, compararon tres métodos de extracción orgánica distintos. Entre dichos métodos están la técnica de extracción DSASE (Dynamic Sonication-Assisted Extraction Method), extracción Soxhlet y extracción estática con ultrasonido; las tres fueron aplicadas para una misma cantidad de muestra (0,2 g de liquen) y el mismo solvente (hexano fue el de mayor rendimiento para la mayoría de los 16 HAP con la técnica DSASE, en comparación con metanol, diclorometano y tolueno). En esta investigación se obtuvo que las tres técnicas presentan porcentajes similares de recuperación, para los 16 HAP listados por la US-EPA, y que la principal ventaja que proporciona la técnica DSASE, viene dada en términos de tiempo y de consumo de solvente. La técnica DSASE fue implementada posteriormente por Blasco et al. (2006; 2007; 2008; 2011). Dicha comparación de solventes también es efectuada por Gómez (2010), coincidiendo con Domeño et al. (2006), en que el hexano mejora la desorción desde la matriz liquénica de la mayoría de los HAP bajo estudio, así como el arrastre de dichos compuestos por los poros del sólido (mayor afinidad, debida a la polaridad del mismo). Esto quiere decir que el hexano es más eficiente en la extracción de los compuestos de interés (aromáticos), además de ser mucho más selectivo que el diclorometano, lo cual contribuye a reducir las interferencias al momento del análisis instrumental.

En sus respectivas investigaciones, Guidotti et al. (2003; 2009), Shukla & Upreti (2009), Shukla et al. (2010), Gómez (2010), Fernández et al. (2011) y Satya et al. (2012) emplean para la etapa de limpieza o purificación de los HAP, el método 3630 de la US-EPA, el cual consiste en la preparación de una columna de sílica gel para purificar sustancias no polares. Dichos autores llevaron a cabo la purificación o separación de los HAP (de otos compuestos orgánicos) empleando como fase estacionaria sílica gel activada. Guidotti et al. (2003; 2009) y Satya et al. ( 2012), usaron como eluentes para la separación de los HAP, 25 mL de pentano, para separar los compuestos saturados, seguido de 25 mL de la mezcla diclorometano: pentano (2:3, v/v), para obtener la fracción de los compuestos aromáticos. Gómez (2010) y Fernández et al. (2011) realizan la activación de la sílica gel dejándola en la estufa a 80 ºC durante 16 horas, previas a su uso. Posterior al empacado de la columna, se añadieron los 2 mL del extracto. Se comenzó la elusión con 25 mL de hexano. Seguidamente con 40 mL de mezcla hexano-diclorometano (2:3, v/v). La purificación puede ser efectuada empleando otras fases estacionarias, un ejemplo de esto es la metodología aplicada por Domeño et al. (2006) y Blasco et al. (2006), los cuales utilizaron alúmina activada a 550 °C por 5 h, eluyendo los analitos con 20 mL de la mezcla hexano:diclorometano (3:1). Augusto et al. (2009) utilizan una columna de florisil y 30 mL de acetonitrilo como eluente. Cabe destacar el método de extracción en fase sólida (SPE, por sus siglas en inglés), empleado por Blasco et al. (2007; 2008; 2011), en el cual utilizan como fase estacionaria florisil y cartuchos de NH2-SPE (en una mini columna), y como eluentes 0,5 mL hexano y 2 mL de la mezcla hexano: diclorometano (65:35). Esta técnica de purificación, es por mucho la más eficiente en términos del bajo consumo de tiempo y solventes, en comparación con el método convencional de cromatografía en columna.

La caracterización y cuantificación de HAP es efectuada mediante las técnicas Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC, por sus siglas en inglés), acoplada a detector de fluorescencia y/o UV-visible, y Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC/ MS, por sus siglas en inglés). Ambas técnicas permiten la separación de un elevado número de moléculas con características estructurales similares, lo que las hace idóneas en este tipo de análisis. Los HAP comúnmente cuantificados son los 16 que han sido listados por la US-EPA como contaminantes principales: naftaleno, acenaftileno, acenafteno, fluoreno, fenantreno, antraceno, fluoranteno, pireno, criseno, benzo[a]antraceno, benzo[b]fluoranteno,benzo[k]fluoranteno,benzo[a] pireno,dibenzo[a,h]antraceno,benzo[g,h,i]perileno e indeno[1,2,3-cd]pireno, teniendo en cuenta sus niveles de toxicidad y la abundancia natural de los mismos. Migaszewski et al. (2002) incluyen en su estudio la determinación de benzo[e]pireno y perileno.

Owczarek et al. (2001), Migaszewski et al. (2002), Domeño et al. (2006), Blasco et al. (2006; 2007; 2008; 2011) Naeth & Wilkinson (2008) y Guidotti et al. (2003; 2009) utilizaron la técnica de Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC/MS) para la cuantificación de los HAP, referida en el método 8270 de la US-EPA. La gran eficiencia de columnas capilares sobre las empaquetadas permite el análisis de un gran número de analitos. Entre las columnas empleadas pueden mencionarse la HP-5MS (25 m x 0,20 mm x 0,33 μm) (Migaszewski et al. 2002), DB5-MS (30 m x 0,250 mm x 0,25 μm) y factor four VF5-ms (60 m x 0,250 mm x 0,25 μm) (Domeño et al.2006; Blasco et al. 2006; 2007; 2008 y 2011) y HP-5MS (25 m x 0.25 mm x 0.25 μm) (Guidotti et al. 2009). La fase estacionaria de la columna HP-5MS está basada en (5 %-fenil)-metilpolisiloxano, la Factorfour VF5-ms basada en 95% polidimetilsiloxano y 5% difenilsiloxano y la DB5- MS en 5 % fenil metil-polisiloxano.

Todos los autores coinciden en el empleo del método SIM (Selective Ion Monitoring, por sus siglas en inglés), empleando las masas características de cada uno de los compuestos, lo cual permite eliminar interferencias debido a la detección de otros compuestos en los mismos tiempos de retención de los HAP. En cuanto a los límites de cuantificación (LOQs), Owczarek et al. 2001 señalan un valor de 4 ng/g para todos los HAP; Domeño et al. (2006) y Blasco et al. ( 2006; 2007; 2008; 2011) reportan límites de detección (LODs) comprendidos entre 21 y 32 ng/g; Guidotti et al. (2003) reportan LOQs entre 0,5 y 3,6 ng/g y Guidotti et al. (2009) LOQs de 1 ng/g para todos los HAP.

Augusto et al. (2009), Shukla & Upreti (2009), Shukla et al. (2010), Gómez (2010), Fernández et al. (2011) y Satya et al. (2012) emplearon la técnica Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) para la cuantificación de los HAP, referida en el método 8310 de la US-EPA. La columna cromatográfica utilizada para este tipo de compuestos es la fase reversa C-18. Cabe mencionar la columna simétrica hecha por Waters específica para HAP (250 nm x 4,6 mm x 5 μm) (Shukla & Upreti, 2009; Fernández et al. 2011; Shukla et al. 2010; Satya et al. 2012) y la 799250D-584 Lichrospher 100 RP-18 (5 μm, 250 nm x 4 mm) marca HP (Gómez, 2010). Augusto et al. (2009) utilizaron dos columnas acopladas para mejorar la separación de los analitos (Agilent C-18 y Phenomenex C-18).

Shukla & Upreti (2009), Shukla et al. (2010) y Satya et al. (2012) utilizan el detector UV-visible para la cuantificación de todos los HAP estudiados, seleccionando como longitud de onda 254 nm. Dicha longitud de onda también es seleccionada por Fernández et al. (2011) y Gómez (2010). Adicionalmente, Fernández et al. (2011) emplean la longitud de onda de 208 nm, debido a que en líneas generales los HAP de bajo peso molecular presentan una mayor sensibilidad ante 208 nm y los de mayor peso molecular a 254 nm. Sin embargo, en el caso de fluoranteno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo[g,h,i]perileno, la sensibilidad fue mayor ante 208 nm. La aplicación de detectores de fotodiodos en serie (UV) permite optimizar la longitud de onda para cada HAP. Es importante señalar que la detección por UV-visible tiene numerosas desventajas, en términos de selectividad, sensibilidad y en no poder discriminar interferencias de la matriz, especialmente en matrices complejas, como es el caso de los líquenes. Por otra parte, el detector de fluorescencia es más selectivo (muchos componentes de la matriz no fluorecen) y sensible. Gómez (2010) utilizó como longitud de excitación 340 nm y de emisión 425 nm y Fernández et al. (2011) como longitud de excitación 375 nm y de emisión a 425 nm. A pesar de ello, no todos los HAP comúnmente estudiados fluorecen (naftaleno, acenaftileno, acenafteno, fluoreno, fenantreno, criseno e indeno[1,2,3-cd]pireno no fluorecen), por lo que Augusto et al. (2009), Gómez (2010) y Fernández et al. (2011) emplearon ambos detectores (UV-visible y fluorescencia) acoplados para la cuantificación de los HAP. En cuanto a los LODs, Shukla & Upreti (2009) y Shukla et al. (2010) publican límites de detección comprendidos entre 10 y 30 ng/g, Fernández et al. (2011) encuentran LODs entre 8 y 519 ng/g, así como LOQs entre 250 y 1730 ng/g, dependiendo del HAP analizado, mientras que Satya et al. (2012) reportan LODs entre 8 y 50 ng/g y LOQs entre 10 y 107 ng/g para todos los HAP.

En cuanto al tratamiento estadístico de los datos experimentales, resalta el empleo de estadística multivariada, específicamente de Análisis de Componentes Principales (ACP) (Shukla & Upreti, 2009; Blasco et al. 2008; Gómez, 2010; Fernández et al. 2011), con el objeto de sintetizar la información, reduciendo el número de variables trabajadas, perdiendo la menor cantidad de información posible, para así facilitar la interpretación de los datos. Owczarek et al. (2001), Blasco et al. (2008) y Augusto et al. (2009) efectúan pruebas de correlación de Pearson; Owczarek et al. (2001) con la finalidad de evaluar el grado de correlación entre los diferentes contaminantes determinados en los líquenes (metales-HAP y entre los distintos HAP); Blasco et al. (2008) con el objeto de establecer relaciones presentes entre el índice de pureza atmosférica (IPA) y la concentración de HAP en los líquenes; y en el caso de Augusto et al. (2009) entre la concentración de los HAP en muestras de líquenes y la concentración de HAP en muestras de suelo. Por otro lado, Blasco (2008), Augusto et al. (2009), Gómez (2010), Blasco et al. (2011) y Satya et al. (2012), realizan un análisis de varianza de una vía (ANOVA), el cual permite comprobar en el caso de Augusto et al. (2009) las diferencias significativas entre los perfiles de HAP en los diferentes medios, en el caso de Blasco (2008) y Blasco et al. (2011) las diferencias significativas entre los perfiles de HAP en distintas especies de líquenes, mientras que Gómez (2010) y Satya et al. (2012) determinan la presencia o no de diferencias significativas en la concentración de los compuestos estudiados entre las distintas localidades. Blasco (2008) y Blasco et al. (2011) aplican el análisis discriminante para determinar tendencias en cuanto al perfil de acumulación de las distintas especies de líquenes empleadas. Asimismo, Blasco et al. (2011) hacen uso de la Prueba de Turkey o Games-Howell.

Otra herramienta de gran utilidad empleada por distintos autores son las relaciones diagnósticas de fuentes de contaminación, que permiten inferir el origen de la mezcla de HAP presentes. Dichas relaciones han sido empleadas por Migaszewski et al. (2002), Blasco et al. (2006; 2007), Shukla & Upreti, (2009), Shukla et al. (2010), Gómez (2010), Fernández et al. (2011), Blasco et al. (2011) y Satya et al. (2012), estableciendo de esta forma la procedencia petrogénica y/o pirogénica (Fen/An, Flu/Pi, Naf/Fen, An/(An+Fen) y B[a]A/(B[A]A+Cri)) de los compuestos estudiados. Adicionalmente, algunas relaciones diagnósticas permiten especificar mucho más los procesos que aportan cantidades variables de HAP a la atmósfera: incendios (IP/ (IP+B[g,hi]P) y Flu/(Flu+Pi), quema de maleza, material leñoso y/o carbón), emisiones vehiculares (B[a]P/B[g,h,i]P, quema de gasolina y/o diesel), entre otras fuentes.

Blasco et al. (2008; 2011) y Gómez (2010) emplean como parámetro la toxicidad equivalente (TEQ), para medir el potencial dañino de una determinada carga o mezcla de HAP, en la cual se multiplica la concentración de cada HAP por el valor de toxicidad (TEF) asignado a cada HAP relativo al benzo[a]pireno. Por último, cabe destacar el uso de la relación Expuesto/Control (EC), empleada por Guidotti et al. (2009), calculada en términos de la relación entre la concentración del compuesto en el liquen después y antes de su exposición a las condiciones del ambiente urbano. Dicha herramienta permite observar el factor de acumulación para cada HAP en los especímenes de líquenes transplantados.

Gran parte de los estudios indican que los líquenes tienden a presentar un perfil de HAP rico en compuestos de 2, 3 y 4 anillos, asociados con la fase gaseosa con respecto a los compuestos de 5 y 6 anillos, asociados con la las partículas atmosféricas (Owczarek et al. 2001; Migaszewski et al. 2002; Blasco et al. 2006 y 2008; Augusto et al. 2009; Guidotti et al. 2003 y 2009, Shukla & Upreti, 2009; Shukla et al. 2010; Fernández et al. 2011; Blasco et al. 2011; Satya et al. 2012). Sin embargo, Blasco (2008), Shukla et al. (2010), Gómez (2010) y Blasco et al. (2011) revelan que dicho perfil dependerá en muchos casos de la morfología del liquen empleado, señalando que los líquenes de morfología fruticuloso y crustáceo-escuamuloso tienden a acumular preferiblemente HAP asociados a la fase gaseosa, mientras que aquellos con morfología foliácea tienden a retener más fácilmente en su superficie los HAP asociados las partículas (monitorizan el espectro completo de HAP). Dicho aspecto tiene implicaciones en cuanto a la elección de la especie adecuada de acuerdo a la finalidad específica que persiga el estudio, debido a que uno u otro tipo de liquen permitirán monitorizar una información distinta. En este sentido, los líquenes más resistentes a la contaminación atmosférica permitirán monitorizar una mezcla más tóxica de HAP.

Migaszewski et al. (2002) concluyen que la considerable variabilidad de la concentración de HAP en diferentes especies de plantas, muestra la diversidad en la bioacumulación de los mismos. La mayor parte del talo del liquen revela más altas concentraciones de hidrocarburos individuales que su corteza huésped y las concentraciones de HAP totales en los líquenes fueron superiores (5 a 10 veces mayores) a las de las plantas vasculares del mismo entorno. De igual forma, Augusto et al. (2009) encuentran que los líquenes acumulan concentraciones de HAP más altas que las agujas de pino atribuyéndolo a que ellos absorben todos los nutrientes directamente de la atmósfera y a que su carencia de cutícula les permite exponer toda su superficie y captar contaminantes, más que otros biomonitores como las agujas de pino. Migaszewski et al. (2002) y Augusto et al. (2009) encontraron que el patrón de HAP presente en los líquenes es diferente al de la vegetación adyacente, teniendo que en las cortezas de los árboles y las agujas de pino dominan los HAP de 3 anillos mientras que en los líquenes dominan los HAP de 4 anillos, lo cual es atribuido a diferencias morfológicas y de porosidad entre las ramas de los árboles y los líquenes.

Augusto et al. (2009) hallaron que los líquenes acumulan concentraciones de HAP más altas que los suelos y que el valor de fondo (área no contaminada) de los HAP en líquenes y en suelos son diferentes, pero dichas concentraciones tienden a igualarse en zonas urbanas e industriales (áreas contaminadas), dichos resultados coinciden con los de Migaszewski et al. (2001) que encontraron mayores concentraciones de HAP en los líquenes que en el suelo. En cuanto al perfil encontrado en los suelos, Migaszewski et al. (2002) determinaron que en comparación con los líquenes en los cuales los compuestos de 3 anillos son más abundantes que los de 5 anillos, en los suelos dicha abundancia está invertida, asociado precisamente a que los HAP de 5 anillos suelen quedar sedimentados (asociados con la fase de partículas), mientras que los de 3 anillos están asociados a la fase gaseosa.

Blasco et al. (2006) determinaron que las concentraciones de HAP partículas se encuentran 2 órdenes de magnitud por encima de las concentraciones de HAP en los líquenes. Blasco et al. (2006) y Augusto et al. (2009) coinciden en que en ambos perfiles (el de las partículas y el de los líquenes) los HAP de 4 anillos son los más abundantes. Blasco et al. (2006) concluyen que existe una buena correlación entre los niveles de HAP hallados en los líquenes y en las muestras de aires en las distintas estaciones de muestreo, además de coincidencias significativas en las relaciones diagnósticas empleadas, por lo que sugiere que son excelentes biomonitores de la calidad del aire.

Blasco et al. (2006) aseveran que ambas técnicas de muestreo (biomonitoreo y monitoreo convencional) proveen de información complementaria, debido a que los líquenes registran información de la contaminación atmosférica por prolongados periodos (de forma integrada) mientras que las muestras de partículas dan información generada durante el periodo de muestreo (puntual).

Por último, Blasco et al. (2006) determinan la existencia de una correlación entre el significado IPA y la concentración de HAP característicos de procesos de combustión (constituidos 4 o más anillos) La combinación de ambos métodos señala que valores bajos del Índice de Pureza Atmosférica (IPA) y por tanto una flora liquénica escasa, puede asociarse con la presencia de mezclas de HAP de toxicidad alta y se relaciona con un contenido elevado en la mayoría de los HAP recomendados como indicadores de la calidad del aire (fenantreno, fluoranteno, pireno, dibenzo[a,h]antraceno y benzo[g,hi]perileno).

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