Antonio J. Manrique*
*Universidad Nacional Experimental Rómulo Gallegos. Área de Agronomía. San Juan de los Morros, Guarico. Venezuela. * Correo electrónico: tonyman77@terra.com
RESUMEN
Se colectaron muestras de propóleos provenientes de dos apiarios del estado Miranda, Venezuela, ubicados en diferentes zonas de vida. La primera localidad se ubica en un bosque húmedo premontano en el Municipio Guaicaipuro y la segunda en un bosque seco tropical en Guatire, Municipio Zamora, desde octubre de 2001 hasta septiembre de 2002. El objetivo del experimento fue evaluar la actividad antimicrobiana de los propóleos colectados y la influencia estacional, en dos zonas de vida. Para el análisis de los datos, se empleó un modelo mixto basado en mediciones repetidas en el tiempo, en cada localidad estudiada y se aplicó la prueba de media de Tukey. Todos los extractos etanólicos de propóleos (EEP) estudiados mostraron actividad antimicrobiana, al inhibir el crecimiento del Staphylococcus aureus ATCC 25.923 con halos de inhibición de hasta 30 mm y del Micrococcus luteus ATCC 9.341. Las muestras de EEP recolectadas en Guatire en enero y las de enero y julio de El Laurel mostraron mayor actividad antimicrobiana. Los resultados sugieren que los propóleos estudiados muestran influencia estacional en la inhibición del crecimiento bacteriano y que los EEP pueden ser usados como agentes antimicrobianos contra S. aureus y M. luteus.
Palabras clave: propóleos, Venezuela, actividad antimicrobiana.
Antimicrobial activity of propolis from two climatic zones in Miranda state, Venezuela. Seasonal variation effect
Summary
Propolis samples were collected from apiaries at two locations in Miranda state, Venezuela, located in different life zones. The first location is at a humid premountain forest in Guaicaipuro Municipality and the second is at a dry tropical forest in Guatire, Zamora Municipality, from October 2001 to September 2002. This assay was carried out to evaluate the seasonal influence and the antibacterial activity by the propolis collected in both life zones. The data were analyzed through a mixed model based on repeated measures in each location and means separated by the Tukey test. All ethanolic extracts of propolis (EEP) showed antimicrobial activity inhibiting growth of Staphylococcus aureus ATCC 25.923, with an inhibition halo up to 30 mm, and Micrococcus luteus ATCC 9.341. EEP samples collected from Guatire in January and from El Laurel in January and July exhibited the highest antibacterial activity. The results suggest that the studied propolis showed seasonal influence in the inhibition of bacterial growth and that EEP could be used as antimicrobial agents against S. aureus and M. luteus.
Keywords: propolis, Venezuela, antimicrobial activity.
]]> Recibido: 16/08/05 Aceptado: 21/02/06INTRODUCCIÓN
El propóleos es utilizado para producir apiterápicos de uso humano y animal, debido a sus propiedades biológicas. En el primer libro médico, "Libro de preparación de medicamentos para todas las partes del cuerpo humano", en el papiro de Ebers (hace mas de 1700 años AC), se menciona el propóleos como medicina (Asís, 1993). No obstante, fue en la guerra de los Boers en Sudáfrica, a finales del siglo 19 cuando tuvo su mayor aplicación para el tratamiento de heridas y como cicatrizante (González y Bernal, 1997). El embalsamado de intrusos dentro de la colmena para contener la putrefacción y evitar enfermedades en su interior es una prueba de sus cualidades. En el interior de la colmena hay una alta densidad poblacional, hasta 90.000 abejas, temperaturas de 34ºC, intercambio y almacenamiento de alimentos, condiciones ideales para el crecimiento de microorganismos nocivos para las abejas; sin embargo, la presencia de substancias antimicrobianas del propóleos inhibe su proliferación.
Levy (1999) sugiere que el mecanismo de la actividad antimicrobiana del propóleos es complejo y puede ser atribuido al sinergismo entre algunos de sus compuestos, tales como flavonoides, ácidos aromáticos, ácidos grasos, ésteres, hidroxiácidos, sesquiterpenos y otros compuestos fenólicos presentes en su composición. Vargas et al. (2004) reportan que los EEP mostraron actividad antimicrobiana contra una serie de bacterias resaltando la inhibición de 45 aislados de Staphylococcus sp. Varios autores han demostrado que la actividad antibacterial del propóleos contra Enterococcus sp, Escherichia coli y, especialmente, contra Staphylococcus aureus (Kujumgiev et al., 1999, Hegazi y El Hady 2002.)
Las propiedades antimicrobianas de esta resina pueden ser atribuidas, principalmente, a los flavonoides, como la pinocembrina, galangina, pinobanskina y al éter bencil del éster fenetil de ácido caféico, el cual es un componente activo del propóleos que ejerce gran variedad de cambios biológicos en diversos sistemas, como las respuestas inmunomoduladoras, antiinflamatórias, y antimitogénicas (Lefkovits et al., 1997), ácido p-cumárico y éter del ácido caféico (Amoros et al., 1992).
Moura et al. (1999b) encontraron que los propóleos de las abejas africanizadas presentaron mayores halos de inhibición contra el S. aureus que los de abejas europeas. Similarmente, Pereira (1999) observó que el propóleos no tiene actividad antibacteriana contra cepas Gram negativas, pero sí contra todas las cepas Gram positivas.
Sforcin et al. (2000) señalan que la actividad antimicrobiana del propóleos es el reflejo de sus constituyentes, los cuales pueden variar su composición química, dependiendo de la región y de la estación que sea recolectado. Por otro lado, Orsi et al. (2005) demostraron el efecto bactericida del extracto etanólico de propóleos (EEP) contra la Salmonella enteritidis y S. typhimurium, concluyendo que el poder bactericida del propóleos contra bacterias Gram negativas puede variar de acuerdo a la región geográfica donde sea producido. Chaillou et al. (2004) estudiaron propóleos argentinos y encontraron que en el 50% de las muestras se inhibieron en más de 12 mm cepas de S. aureus, concluyendo que el diámetro del halo de inhibición depende del contenido de flavonoides de los EEP utilizados. No obstante, Manrique y Santana (2004) trabajaron con EEP de Melipona quadrifasciata, Tetragonisca angustula y Nannotrigona sp. y obtuvieron halos de inhibición entre 11 y 25 mm contra las bacterias S. aureus ATCC 25.943 y Micrococcus luteus ATCC 9.341, aun cuando los EEP mostraron porcentajes muy bajos de flavonoides, variando de 0,19% a 0,32% y con elevada actividad antioxidante, de 3 a 5 segundos en promedio
Los propóleos de Alemania y de Egipto mostraron mayor actividad antibacteriana contra S. aureus, mientras que los de Alemania, Egipto y de Mongolia fueron mas efectivos contra la Candida albicans (Hegazi y El Hady, 2002).
El objetivo del presente trabajo fue estudiar la propiedad antimicrobiana de propóleos de abejas híbridas africanizadas (Apis mellifera L.) provenientes de dos regiones climáticas diferentes del estado Miranda, Venezuela y verificar si existe influencia estacional en esta característica.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> El experimento fue realizado de octubre de 2001 a septiembre de 2002, donde se colectaron muestras de propóleos en apiarios ubicados en la Estación Experimental “Jaime Henao Jaramillo” (El Laurel) de la Universidad Central de Venezuela, Cortada del Guayabo, Municipio Guaicaipuro y en Guatire, Municipio Zamora, ambos en el estado Miranda, Venezuela. La primera región se encuentra enmarcada dentro de la zona de vida del bosque húmedo premontano, cuyas características climáticas fueron descritas por Manrique y Thimann (2002) y la segunda localidad dentro del bosque seco tropical, situado a 10o 01` N y 62o 15` O a 621 msnm., con temperatura media de 26,2oC y precipitación media anual de 966 mm. En ambas localidades se notó abundancia de quiripiti (Clusia minor) y copey (Clusia major), plantas muy productoras de resinas, señaladas por Salamanca (2005) como una de las principales fuentes que las abejas convierten en propóleos en las regiones tropicales.En cada región la recolección del propóleos, proveniente de 10 colmenas, fue realizada cada 14 días, mediante el raspado del propóleos acumulado en la entretapa y en las alzas, realizándose un pool de las muestras por cada mes evaluado. En total, se tomaron 12 muestras en la zona de la Cortada del Guayabo y seis muestras en la zona de Guatire.
La preparación de los Extractos Etanólicos de Propóleos (EEP) se realizó según la metodología descrita por Park et al. (1998). Se prepararon dos EEP por cada muestra mensual recolectada. Los EEP tenían una concentración de 15 mg/ml.
Se realizaron antibiogramas con líneas estandarizadas American Type Culture Collection (ATCC) de Staphylococcus aureus ATCC 25.923 y Micrococcus luteus ATCC 9.341 como bacterias de prueba. Se prepararon dos placas de petri, con sus respectivas réplicas, con agar Müeller-Hinton y suspensión de 108 a 109 de M. luteus ATCC 9.341 y S. aureus ATCC 25.923, sometidas a la acción de los diferentes EEP de cada muestra recolectada, a través de discos (uno por cada muestra de propóleos) de papel de 5 mm de diámetro. Como control fue usado un disco impregnado de alcohol etílico al 70%. Después las placas fueron incubadas a 370C durante 24 horas. Posteriormente, fueron leídos los halos de inhibición de crecimiento de las bacterias en mm, usando una regla milimetrada. La presencia de halo de inhibición indicaba que las bacterias evaluadas eran sensibles y la ausencia del mismo indicaba que resistente al EEP evaluado.
Para el análisis de los datos, se empleó un modelo mixto basado en mediciones repetidas en el tiempo, en cada localidad estudiada. Posteriormente se aplicó la prueba de media de la mínima diferencia significativa honesta de Tukey a un nivel de P = 0,05 por medio del programa Infostat (2002). El modelo usado fue:
Yij: m + µi + aiγk+ βj+ aiβj +aiβjγk
Donde:
Yij = Valor estimado de la característica de inhibición
m = Media de la población
ai = Efecto aleatorio de la i-ésima colonia
]]> aiγk= Efecto aleatorio de la i-ésima colonia en k-ésima muestraβj = Efecto aleatorio del j-ésimo mes
aiβj = Efecto aleatorio de la i-ésima colonia en el j-ésimo mes
aiβjγk = Efecto aleatorio de la i-ésima colonia en el j-ésimo mes de la k-ésima muestra.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados de la actividad antimicrobiana de los EEP provenientes de los apiarios del bosque seco tropical del estado Miranda son presentados en el Cuadro 1. Hubo diferencias altamente significativas en cuanto a la influencia estacional de los EEP en la inhibición del crecimiento del M. luteus ATCC 9.341, observándose que la muestra de EEP de enero presentó la mayor inhibición, al presentar halo superior a 20 mm. Similarmente, el S. aureus ATCC 25.923 fue inhibido por todos los EEP y mas fuertemente por el EEP de los meses de enero, siendo estos valores superiores a los reportados por Konishi et al. (2004) con S. aureus y Streptococcus mutans, con halos de inhibición entre 7,9 y 12,0 mm. A través de la prueba de Tukey (P<0,05) se evidenció que el S. aureus fue más sensible a los EEP al mostrar los mayores diámetros de inhibición que el M. luteus, concordando con los resultados reportados por Bracho et al. (1999) y Moura et al. (1999a).
| Cuadro 1. Actividad antimicrobiana de los EEP contra Micrococcus luteus ATCC 9.341 y Staphylococcus aureus ATCC 25.923 de propóleos del bosque seco tropical del estado Miranda, desde octubre de 2001 a marzo de 2002 | ||
| Mes | ]]>
Halo de inhibición Micrococcus luteus | Halo de inhibición Staphylococcus aureus |
| mm | ||
| Octubre | 15,8 e† | 17,0 d |
| Noviembre | ]]> 17,3 d | 18,0 c |
| Diciembre | 18,3 c | 14,8 e |
| Enero | 20,5 a | 25,0 a |
| Febrero | 19,3 b | ]]> 19,8 b |
| Marzo | 15,3 e | 14,0 f |
| Promedio | 17,7 | 18,1 |
| † Valores con letras distintas ent la fila son diferentes (P<0,05). | ||
En el Cuadro 2 se muestran los datos sobre la actividad antimicrobiana de los EEP, obtenidos de la zona de bosque húmedo premontano, donde la influencia estacional mostró diferencias significativas. Todos los EEP propóleos inhibieron fuertemente el crecimiento microbiano, tanto del M. luteus como del S. aureus.
]]>| Cuadro 2. Actividad antimicrobiana de los EEP contra Micrococcus luteus ATCC 9.341 y Staphylococcus aureus ATCC 25.923, de propóleos de la Estación Experimental “Jaime Henao Jaramillo”, estado Miranda, Venezuela. De octubre de 2001 a septiembre de 2002 | ||
| Mes | Halo de inhibición Micrococcus luteus | Halo de inhibición Staphylococcus aureus |
| mm | ||
| ]]> Octubre | 26,0 b† | 27,8 c |
| Noviembre | 21,8 f | 19,5 g |
| Diciembre | 25,0 c | 24,8 d |
| Enero | ]]> 27,8 a | 30,0 a |
| Febrero | 19,8 h | 24,3 de |
| Marzo | 21,0 g | 19,0 g |
| Abril | 22,8 e | ]]> 25,3 d |
| Mayo | 18,8 i | 18,0 h |
| Junio | 23,8 d | 22,8 e |
| Julio | 27,8 a | 29,3 b |
| ]]> Agosto | 18,8 i | 20,8 f |
| Septiembre | 26,3 b | 25,0 d |
| Promedio | 23,3 | 23,9 |
| † Valores con letras distintas en la fila son diferentes (P<0,05). | ||
Los resultados de todos los EEP evaluados muestran que la actividad antimicrobiana del propóleos es variable dependiendo del microorganismo en estudio y de la región de colecta del mismo, tal como lo sugiere Koo et al. (1999), concordando con los resultados de Sforcin (1998), quien no encontró efecto estacional al evaluar propóleos colectado en cuatro estaciones, los cuales inhibieron el crecimiento de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.
Las diferencias significativas en la actividad antimicrobiana del propóleos, provenientes del bosque húmedo premontano y colectados en diferentes meses, pudiera deberse a la composición de las resinas que lo forman, dado que las abejas extraen resinas, principalmente de los puntos de crecimiento de las plantas. En las regiones tropicales, aún cuando el crecimiento de las plantas se manifiesta durante todo el año, quizás en enero se presentan características especiales, tales como mayor oscilación de temperatura diaria, una sequía incipiente, pero con suficiente humedad edáfica, lo que permitiría una mayor secreción de resinas. De esta manera se presentaría un comportamiento similar al referido por Ghisalberti (1979), quien señala que las abejas colectan el propóleos a finales de la primavera, en verano y a principios de otoño, lo cual se corresponde con el crecimiento y mayor exudado de resinas en las plantas en dichas regiones. No obstante, Bankova et al. (1998) estudiaron el efecto estacional sobre la composición química del propóleos y encontraron que la disminución de algunos componentes activos, como el ácido fenólico, es acompañado por el incremento de otros componentes biológicamente activos, como los ácidos terpénicos.
En general, la actividad antimicrobiana de los propóleos se atribuye al contenido de flavonoides, tal como lo refieren diversos autores como Lefkovits et al. (1997), Chaillou et al. (2004) y Principal (2005). Sin embargo, los propóleos estudiados en el presente ensayo mostraron valores bajos y medios de flavonoides, variando de 0,55 a 0,97%, difiriendo de esta aseveración y concordando con los resultados de Manrique y Santana (2004), quienes trabajaron con propóleos de abejas sin aguijón que poseen tenores muy bajos de flavonoides y mostraron halos de inhibición de hasta 25 mm versus S. aureus y M. luteus.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos muestran que los EEP obtenidos de dos zonas de vida del estado Miranda, Venezuela poseen actividad antimicrobiana contra Staphylococcus aureus y Micrococcus luteus.
Hubo influencia estacional en la actividad antimicrobiana de los propóleos evaluados, mostrando un mayor halo de inhibición en los EEP provenientes de muestras colectadas en el mes de enero en ambas localidades.
Los EEP estudiados pueden ser usados como agentes antimicrobianos contra S. aureus y M. luteus.
El S. aureus mostró ser más sensible a los EEP evaluados que el M. luteus, en ambas localidades.
BIBLIOGRAFÍA
]]>1. Amoros M., F. Savager, L. Girre y M. Cormier. 1992. In vitro antiviral activity of propolis. Apidologie, 23: 231-240. [ Links ]
2. Asís M. 1993. Apiterapia para todos. Como usar los siete productos de la colmena para curar. Editorial Científico-Técnica. La Habana, Cuba. 194 p. [ Links ]
3. Bankova V., G. Boudorova-Krasteva, S. Popov, J. Sforcin y S. Funari. 1998. Seasonal variations of the chemical composition of Brazilian propolis. Apidologie, 29: 361-367. [ Links ]
4. Bracho J., M. Fernández, G. Iturrioz, R. Mallo, A. Tabera y A. Erpelding. 1999. Preliminary studies of propolis from Argentine. Revista da Universidade de Franca, Edição Especial, I Simpósio Brasileiro de Própolis e Apiterápicos, 7(7): 33. [ Links ]
5. Chaillou L.L., H.A. Herrera y J.F. Maidana. 2004. Estudios de propóleos de Santiago del Estero, Argentina. Ciência e Tecnología de Alimentos, 24(1): 11-15. [ Links ]
6. Ghisalberti E.L. 1979. Propolis: A review. Bee World, 60(1): 59-84. [ Links ]
7. González A.R. y R. Bernal. 1997. Propóleos: Un camino hacia la salud. Ed. Pablo de la Torriente. La Habana, Cuba. 132 p. [ Links ]
8. Hegazi A.G. y F. El-Hady. 2002. Egyptian propolis: 3. Antioxidant, antimicrobial activities and chemical composition of propolis from reclaimed lands. Zeitschrift füf Naturforsch [C], 57(3-4): 395-402. [ Links ]
9. Infostat. 2002. Software estadístico. Manual del usuario. Versión 1. 266 p. [ Links ]
10. Konishi S., A.C.H. Sawaya, A. Custódio, I.B. da S. Cunha y M.T. Shimizu. 2004. Análise da influência de agentes soluilizantes na atividade antimicrobiana de extratos de propolis e de uma formulação de spray hidroalcoólico. Revista Mensagem Doce, 75: 5-8 [ Links ]
11. Koo H., P. Rosalen, J. Cury, Y. Park y M. Ikegaki. 1999. Avaliação do potencial anti-cárie e anti-placa da própolis de Apis mellifera da região sudeste e sul do Brasil. I. Atividade antimicrobiana in vitro sobre patógenos bucais. Revista da Universidade de Franca (Edição Especial) I Simpósio Brasileiro sobre Própolis e Apiterápicos, 7(7): 48-49. [ Links ]
12. Kujumgiev A., I. Tsvetkova, Y. Serkedjieva, V. Bankova, R. Christov y S. Popov. 1999. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis of different geographic origin. J. Ethnopharm., 64:235-240. [ Links ]
13. Lefkovits I., Z.Z. Su y P.B. Fischer. 1997. Caffeic acid phenethyl ester profundly modifies protein synthesis profile in type 5 adenovirus-transformed cloned rat embryo fibroblats cells. Int. J. Oncology, 11(1): 59-67. [ Links ]
14. Levy N.C. 1999. Atividade antimicrobiana da própolis. Revista da Universidade de Franca (Edição Especial) I Simpósio Brasileiro de Própolis e Apiterápicos, 7(7): 18. [ Links ]
15. Manrique A.J. y R.E. Thimann. 2002. Coffee (Coffea arabica) pollination with africanized honeybees in Venezuela. Interciencia, 27(8): 414-416. [ Links ]
16. Manrique A.J. y W.C. Santana. 2004. Antibacterial and antioxidant activities of propolis of native (Brazil and Venezuela) stingless bees (Melipona quadrifasciata Lep., Tetragonisca angustula and Nannotrigona sp.). Proc. 8th IBRA International Conference on Tropical Bees and VI Encontro sobre Abelhas. Ribeirão Preto, Brasil, 710 p. CD-ROM. [ Links ]
17. Moura F., M. Ikegaki, S. Alencar, H. Sato e Y. Park. 1999. Classificação da própolis da região sudeste do Brasil. Revista da Universidade de Franca (Edição Especial) I Simpósio Brasileiro sobre Própolis e Apiterápicos, 7(7): 43-44. [ Links ]
18. Moura F., M. Ikegaki, S. Alencar, H. Sato e Y. Park. 1999. Abelhas européias vs. abelhas africanizadas: Estudo comparativo de sua própolis. Revista da Universidade de Franca (Edição Especial) I Simpósio Brasileiro sobre própolis e Apiterápicos, 7(7): 44. [ Links ]
19. Orsi R.O., J.M. Sforcin, V.L.M. Rall, S.R.C. Funari, L. Barbosa y J.R.A. Fernandes. 2005. Susceptibility profile of Salmonella against the antibacterial activity of propolis produced in two regions of Brazil. J. Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases, 11(2): 109-116 [ Links ]
20. Park Y.K., M. Ikegaki. y J.A. da Silva Abreu. 1998. Estudo da preparação dos extratos de propolis e suas aplicações. Ciencia e Tecnología de Alimentos, 18(3): 313-318. [ Links ]
21. Pereira M.L. 1999. Atividade antibacteriana. Revista da Universidade de Franca, Edição Especial, I Simpósio Brasileiro sobre Própolis e Apiterápicos, 7(7): 20. [ Links ]
22. Principal J. 2005. El propóleo: Perspectivas terapéuticas en la medicina humana y veterinaria. Memorias I Congreso Internacional de Apicultores de los Andes y III Convención de Apicultores, San Cristóbal, Táchira, Venezuela. 57- 60 pp. [ Links ]
23. Salamanca G. 2005. Propiedades nutricionales y apiterapéuticas de los productos de la colmena. Memorias I Congreso Internacional de Apicultores de los Andes y III Convención de Apicultores, San Cristóbal, Táchira, Venezuela. 5-14 pp. [ Links ]
24. Sforcin J.M., A. Fernándes, C.A.M. Lopes, V. Bankova y S.R.C. Funari. 2000. Seasonal effect on Brazilian propolis antibacterial activity. J. Ethnopharm., 73: 243-249. [ Links ]
25. Sforcin J.M., A. Fernándes, C.A.M. Lopes y S.R.C. Funari. 1998. Efeito da sazonalidade sobre a atividade antifúngica da própolis. Anais XII Congresso Brasileiro de Apicultura. Salvador, Bahia, Brasil. 193 p. [ Links ]
26. Vargas A. C de, A. P. Loguercio, N. M. Witt, M. M. da Costa, M. Sá e Silva y L.R. Viana. 2004. Atividade antimicrobiana “in vitro” de extrato alcóolico de própolis. Ciencia Rural, 34(1): 159-163. [ Links ] ]]>