Patogenicidad in vitro de Beauveria brongniartii (Sacc.) Petch en
Musca domestica (L.) como posible estrategia de control biológico en áreas ganaderasLuis J. Cova1, José V. Scorza D.1, Danny E. García2*, Luis M. Cañizález3, Clemencia del C. Guedez3, Miguel Maffey4 y María G. Medina2
1 Instituto de Investigaciones Experimentales “José Witremundo Torrealba” Universidad de los Andes, Trujillo, Trujillo. Venezuela.
2 Instituto Nacional de Investigaciones Agrícolas, Estación Experimental del estado Trujillo. Pampanito, Trujillo. Venezuela. *Correo electrónico: dagamar8@hotmail.com
3 Laboratorio de Fitopatología “Dr. Carlos Díaz Polanco”, Núcleo Universitario “Rafael Rangel” (NURR), Trujillo, Trujillo. Venezuela.
4 Laboratorio de Postcosecha, NURR, Trujillo, Trujillo. Venezuela.
RESUMEN
Se realizó un experimento con el objetivo de evaluar en condiciones de laboratorio la patogenicidad de
Beauveria brongniartii (cepa LF-05) en Musca domestica. Las conidias de B. brongniartii se obtuvieron a partir de una cepa introducida desde Perú. El hongo fue propagado en medio de cultivo agar-papa-dextrosa y luego en arroz semicrudo esterilizado. Las moscas F1 se obtuvieron a partir de especimenes silvestres, los cuales fueron capturados en una granja avícola (Betijoque, Venezuela). Ciento sesenta moscas adultas de 3 días de edad, distribuidas en 8 lotes con 17 hasta 40 moscas por frasco fueron anestesiadas con éter, para posteriormente aplicar suspensiones de B. brongniartii diluida en agua a partir una suspensión madre de 108 conidias/mL, resultando seis tratamientos, en función de la concentración: sin aplicación del hongo; 1,2 x 103; 1,2 x 104; 1,2 x 105; 1,2 x 106 y 1,2 x 107 conidias/mL. Se utilizaron además frascos controles con 100 moscas sanas que se sometieron únicamente a la anestesia con éter. El recuento de las moscas caídas, tanto en los frascos experimentales como en los controles, se hizo hasta el día 24. Mediante la metodología Probit® se determinó que los TL50 y TL95 se obtuvieron 11,08 y 13,25 días antes que en el control, respectivamente. Los resultados permiten concluir que esporas de B. brongniartii a 1,2 x 107 conidias/mL, produjeron 95% de mortalidad en M. domestica en 9,27 días. Se especula su uso en nebulizaciones con similar concentración del preparado para el control de la mosca en unidades de producción avícola, porcina y vacuna.Palabras clave: Beauveria brongniartii, Musca domestica, control biológico, acción patogénica, hongos entomopatógenos
]]> In vitro pathogenicity of Beauveria brongniartii (Sacc.) Petch against Musca domestica (L.) as a possible strategy for biological control in livestock areasABSTRACT
An experiment was carried out in order to study, in laboratory condition, the pathogenicity of Beauveria brongniartii (strain LF-05) against Musca domestica. The conidia of B. brongniartii were obtained from Perú. The fungus was propagated in potato-dextrose-agar culture medium, and later in semi-crude sterilized rice. F1 flies were obtained from wild specimens which were captured with mesh in a poultry breeding farm (Betijoque, Trujillo state, Venezuela). In the laboratory, one hundred and sixty adult flies from 3 days of age, divided into 8 lots with 17 to 40 per bottle flies were anesthetized with ether, and then applied B. brongniartii suspensions diluted in water from 108 conidia/mL, resulting in sis treatments: control, 1.2 x 103, 1.2 x 104, 1.2 x 105, 1.2 x 106, and 1.2 x 107 conidia/mL. Healthy controls with 100 flies were used with only ether as anesthesia. The counting of fallen flies, both in the experimental and bottles at checkpoints, it was up to 24 days. Using the Probit® methodology, it was found that the LT50 and LT95 were 11.08 and 13.25 days earlier than control group, respectively. Results showed that spores of B. brongniartii (strain LF-05), at 1.2 x107 conidia/mL, resulted in 95% mortality of M. domestica in 9.27 days. The use of nebulizations with similar concentration of spores to fly control in local production units of poultry and cattle were speculated.
Key words: Beauveria brongniartii, Musca domestica, biological control, pathogenic action, entomopathogenic fungi
Recibido: 03/06/08 Aceptado: 17/10/08
INTRODUCCIÓN
Los hongos entomopatógenos constituyen actualmente una alternativa para el control de insectos trasmisores de enfermedades, frente al uso indiscriminado de insecticidas (Pucheta et al., 2006). El interés por la investigación en América de los hongos entomopatógenos ha sido enfatizado por Alves (1986). En este sentido, se han reportado más de 750 especies de casi 100 géneros que pueden infectar insectos (Kachatourians, 1996). Sin embargo, pocos han sido estudiados en profundidad. Entre los más investigados se encuentran Beauveria bassiana, Beauveria brongniartii, Langenedium giganteum, Lecanicillium lecanii, Metarhizium anisopliae y Isaria fumosorosea, los cuales han sido utilizados comercialmente (Wraight, 1998). Al respecto, los hongos entomopatógenos inician el proceso de infección en los insectos cuando las esporas entran en contacto con la superficie del integumento (Jones, 1994) y no necesariamente estos deben ser ingeridos para que se realice el control (Caruthers y Hural, 1990). El contacto puede ocurrir a través de los espiráculos, partes bucales y membranas inter-tegumentales (Kersaw y Talbot, 1998). El tiempo para la colonización puede variar de 3 a 11 días dependiendo del patógeno, del insecto y de las condiciones ambientales (Alves, 1986); la reproducción del patógeno ocurre entre las 48 y 60 horas. Al consumir los nutrientes el hongo inicia un crecimiento micelar invadiendo todos los órganos del hospedero, finalmente las hifas penetran la cutícula desde el interior del insecto y emergen a la superficie iniciando la formación de esporas cuando la humedad relativa es adecuada (Gillespie y Claydon, 1989). A pesar que el insecto activa su sistema inmune a través de procesos como la melanización, fagocitosis, nodulación y encapsulamiento (St. Legar y Robert, 1997), los hongos desarrollan mecanismos que le permiten evitar las defensas, tales como cambios en la pared celular y producción de sustancias inmunomodulatorias o toxinas fúngicas (Khachatourians, 1991; 1996).
Por otra parte, el estiércol proveniente de los sistemas de producción animal es un medio excepcional para el cultivo de larvas de insectos, en especial de Musca domestica (Moon et al., 2001). La abundancia de moscas en ciertos lugares se debe a la acumulación de larvas en las granjas y su posterior traslado comercial a las zonas agrícolas (Avancini y Silveira, 2000). Esta problemática es generalizada y ya Asher (1961) en Israel lo había destacado advirtiendo la inutilidad del uso de insecticidas sintéticos para el control de las moscas en granjas.
Existe abundante información sobre el papel de la mosca doméstica como transportadora de agentes patógenos que incluyen virus, bacterias, protozoos y huevos de helmintos de importancia sanitaria (Greenberg, 1973). Más recientemente se ha demostrado que ese transporte no es simplemente por contaminación mecánica, sino también es interno por excreción, como ocurre con Escherichia coli (Kobayashi et al., 1999; Sasaki et al., 2000). En este sentido, se ha confirmado el creciente desarrollo de resistencia de M. domestica contra muchos insecticidas de uso común (Nazni et al., 1998). Simultáneamente, el aumento de la producción animal, con excesiva producción de estiércol, ha conducido al incremento poblacional de moscas domésticas (Axtell y Arends, 1990) y al riesgo de su mayor distribución a distancia, por el consumo de este desecho orgánico como abono en localidades hortícolas (Peter y Zacharda, 1997). La resistencia de M. domestica a casi todos los grandes grupos de insecticidas afecta la salud pública, lo cual ha sido bien documentado por Georghiou y Mellon (1983). Ensayos en las Filipinas (Nazni et al., 1998) revelaron una elevada resistencia en la generación F1 de moscas colectadas en una granja avícola contra cinco insecticidas de uso común, que incluyó un clorado, un fosforado, un carbamato y un piretroide, confirmándose resultados que son generales para las moscas sinantrópicas.
Aunque el control biológico, en el caso de moscas, es a menudo descrito y rara vez practicado presenta gran significado en el caso de las granjas criadores de pollos, ya que no puede aplicarse masivamente pesticidas o utilizarse recursos como el ozono que demanda tecnología muy cara (Masten et al., 2002). Por otro lado, el uso extensivo de estos plaguicidas sintéticos no es recomendable en la explotación con animales, donde las intervenciones de control deberían hacerse con medios biológicos, los cuales son más específicos y sin riesgos para los productores y consumidores (Cova y Scorza, 2006; Scorza y Cova, 2006).
]]> Por tales motivos, el objetivo de esta investigación fue evaluar la actividad entomopatógena de B. brongniartii (cepa LF-05) en M. domestica determinando los tiempos letales (TL50 y TL95) a diferentes dosis, mediante la inoculación individual por contacto con conidias en moscas inmovilizadas con éter etílico.MATERIALES Y MÉTODOS
Ubicación y condiciones del ensayo
La investigación se desarrolló en el Laboratorio de Parasitología, perteneciente al Instituto de Investigaciones Experimentales “José Witremundo Torrealba” del Núcleo Universitario “Rafael Rangel”, de la Universidad de los Andes, Trujillo, Venezuela (800 msnm). La temperatura en el área es relativamente constante (25,2°C) con humedad relativa entre 60 y 78%.
Obtención de B. brongniartii (cepa LF-05)
Las conidias de B. brongniartii se obtuvieron a partir de introducciones del hongo desde el Cuzco, Perú (1.600 msnm, 13º 08´ 50” S y 72º 17´ 10” O). Posteriormente el hongo fue propagado en medio de cultivo en agar-papa-dextrosa y luego en arroz semicrudo esterilizado. Para la propagación en masa, se utilizaron fragmentos de agar con desarrollo fúngico, suspendidos en agua desionizada con 1:10 000 de Tween-80 e inoculándolo en arroz descascarado, previamente humedecido al 30% (p/v) y esterilizado dentro de bolsas de polietileno a 115ºC durante 15 minutos. El arroz inoculado se incubó a temperatura ambiente (25ºC) en penumbra (1-3 Lux) durante dos semanas. Se tamizó el desarrollo fúngico a través de organdí y se cosecharon las esporas para recogerlas en envases secos de aluminio esterilizado. Los ensayos de germinación de las esporas se realizaron mediante la técnica de Milner et al. (1991), éstos revelaron más de 90% de viabilidad.
Obtención de moscas F1 a partir de moscas silvestres
Para la obtención de moscas F1 a partir de especímenes silvestres se empleó el dispositivo utilizado por Scorza y Cova (2006), capturando con una malla (tamaño de poro, 1 mm) los insectos en una granja de cría avícola (Sara Linda, Betijoque, estado Trujillo). El equipo fue constituido por pares de frascos de 4,8 L de 27 x 15 x 0,95 cm de longitud, diámetro y boca, respectivamente, conectados mediante un tubo de PVC de 40 x 7,6 cm de longitud y diámetro externo, ajustado fuertemente dentro de las bocas de los frascos, mediante un suplemento de bandas elásticas. En la cara superior del tubo de PVC se hicieron 60 aberturas de 20 mm de diámetro, como ventanas de ventilación, dispuestas en hileras y cubiertas por nailon adherido con pegante. Dentro de uno de los frascos se introdujeron las moscas silvestres junto con dos envases plásticos, uno con azúcar refinada y otro con leche en polvo. En el otro frasco, como medio para la postura de las moscas, se añadieron 250 g de gallinaza humedecida extraída del lecho de una granja de cría de pollos, precalentada a 60ºC durante una hora para eliminar huevos, larvas o pupas contaminantes ajenas, para posteriormente reinocular el medio con un extracto filtrado de gallinaza (Glaser, 1924). Se colocaron los sistemas a temperatura ambiente (25ºC) en un lugar sombreado y protegido de la acción directa de la luz. Se cubrieron las aberturas del tubo de PVC con tiras de tela gruesa humedecidas por capilaridad, con el otro extremo sumergido en un frasco con agua. Tan pronto aparecieron larvas de moscas de primero o segundo estadío de desarrollo en la gallinaza de cultivo, se extrajeron las moscas progenitoras, para obtener la generación F1 entre ocho y doce días más tarde.
Procedimiento de anestesia con éter para M. domestica
Se utilizó la metodología descrita por Scorza y Cova (2006) con el uso de éter etílico como anestésico, único modo para aplicar individualmente las concentraciones de conidias sobre las coxas y piezas bucales de las moscas. La dosificación del éter para las moscas fue variable (0,4-0,5 mL/mosca). Se expusieron lotes de diecisiete hasta cuarenta individuos en frascos de 4,8 L a los vapores de éter.
]]> Se anestesiaron 160 moscas adultas de 3 días de edad, distribuidas en 8 lotes con 17 hasta 40 moscas por frasco. El período promedio máximo de aplicación fue 4,04 min y el promedio de la duración de la anestesia fue de 12,08 min con mínimo de 6 y máximo de 23 min.Evaluación de la patogenia de la cepa LF-05
Micelios y conidias de B. brongniartii de 21 días de cultivos fueron separados por tamizado en función del tamaño y las conidias se suspendieron en agua deionizada con Tween-80 (0,01%) y agitadas suavemente durante un minuto para separarlas. A partir de una suspensión de 108 conidias/mL contadas con un hemocitómetro Neubauer en 4 x 16 cuadrantes equivalentes a 0,1 mm3, se ajustó el recuento por centrifugación a 3.000 rpm y resuspensión. A partir de esta suspensión madre con 108conidias/mL se hicieron diluciones seriadas en agua con Tween-80 para preparar suspensiones de 107 hasta 103 conidiosporas/ mL en volúmenes de 10 mL y refrigerarlas (5ºC) hasta su uso, menos de doce horas más tarde.
Moscas anestesiadas en lotes de 25 fueron inoculadas con 0,5 µL de cada suspensión evaluada. El inóculo fue depositado entre la trompa y las coxas anteriores, bajo aumento de 5X. Con cada suspensión de conidias se contaminaron 100 moscas que fueron confinadas en cuatro frascos de 4,8 L con círculos de papel Whatman No.1 de 14 cm de diámetro humedecido y sendos envases plásticos con azúcar refinada y leche en polvo. Se prepararon así frascos, de cuatro en cuatro, para 100 moscas contaminadas con las respectivas concentraciones de conidias (1,2 x 103; 1,2 x 104; 1,2 x 105; 1,2 x 106 y 1,2 x 107 conidias/ mL) y además, frascos controles con 100 moscas sanas que se sometieron únicamente a la anestesia con éter. Los frascos se colocaron en penumbra (1-3 Lux) y diariamente se contaron las moscas caídas y aparentemente muertas por su inmovilidad a la agitación del frasco. No se separaron los cadáveres para evitar el estrés en las sobrevivientes. El recuento de las moscas caídas, tanto en los frascos experimentales como en los controles, se hizo hasta el día 24, considerando que en las condiciones experimentales una mosca puede vivir hasta 30 días. Se prestó especial atención, en las moscas caídas, a la aparición en los cadáveres de micelio blancuzco o rosado pálido.
Análisis de resultados
Para el análisis de los resultados se corrigió la mortalidad con respecto al control, utilizando la fórmula propuesta por Abbott (1925), mortalidad corregida (%) = [(X-Y)/X] x 100, donde X son las moscas vivas del control e Y son moscas vivas en el tratamiento. Posteriormente se aplicó la metodología Probit® del paquete estadístico Minitab (2003).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el Cuadro 1 se muestra la mortalidad acumulada en función de los insectos caídos, hasta los 24 días, en seis lotes de 100 moscas contaminadas con 0, 6 x 10-1, 6, 6 x 10, 6 x 102 y 6 x 103 conidias de B. brongniartii por mosca, respectivamente. Al respecto, se observa la dependencia entre la mortalidad de M. domestica, en función de las concentraciones del hongo. Considerando los datos transformados entre el día 6 y el 23 se observaron las mayores variaciones numéricas, las cuales fueron posteriormente utilizadas para el cálculo de los TL50 y TL95
En el Cuadro 2 se presentan los tiempos letales (TL50 y TL95), mediante el análisis Probit® para M. domestica, producidas por distintas concentraciones de conidias de B. brongniartii. Los TL50 y TL95 a concentración de 1,2 x 103 conidiosporas/mL de B. brongniartii no exhibieron diferencias numéricas sustanciales con el control. A dosis de 1,2 x 104 y 1,2 x 105 esporas/mL las moscas tratadas mostraron TL50 cinco y seis días más tempranos y TL95 con seis y siete días antes que las obtenidas con las concentraciones de 1,2 x 103 conidias/mL y el control, respectivamente. Para la dosis de 1,2 x 107 conidiosporas/mL, el TL50 se obtuvo 11,08 días antes y el TL95 13,25 días antes que en el control, respectivamente.
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Ensayos realizados por Barson et al. (1994) en condiciones de laboratorio utilizando seis especies de hongos entomopatógenos contra larvas y moscas domésticas adultas mostraron lo infectivo del uso de B. brongniartii, comparada con otros tales como M. anisopliae y T. cilindrosporium. Sin embargo, ensayos realizados sobre la variabilidad de B. brongniartii (Hadapad et al., 2006), mediante un análisis de clasificación automática basado en una matriz de distancias genéticas mediante análisis de marcadores amplificadores de fragmentos polimórficos (AFLP), encontraron que la virulencia de B. brongniartii está estrechamente relacionada con su variabilidad genética. En este sentido, en investigaciones realizadas por Konstantopoulu y Mazomenos (2005) empleando B. brongniartii y B. bassiana contra adultos de la mosca del mediterráneo (Ceratitis capitata) a concentraciones de 108 esporas/ mL en seis días estos hongos causaron el 97,4 y 85,6% de mortalidad, respectivamente.
La efectividad de seis especies de hongos entomopatógenos para el control de larvas y moscas domésticas adultas fueron ensayadas en el laboratorio por Barson et al. (1994), encontrándose que los más virulentos fueron Metarhizium anizopliae y Tolypocladium cylindrosporium, y los menos B. bassiana y B. brongniartii. Sin embargo, Hadapad et al. (2006) encontraron que la virulencia de estos últimos está relacionada con su variabilidad genética, la cual se describió con estudios realizados en aislados de Beauveria sp. de diferentes zonas geográficas y de diferentes hospederos, basado en AFLP. Ayala et al. (2002) investigaron la virulencia de B. brongniartii a escala de laboratorio contra Triatoma infestans, mostrando alta patogenicidad, causando mortalidad del 100% en ocho días a una concentración de 1,6 x 109 esporas/mL. Por su parte, Fernández y Colmenares (1997) evaluaron a nivel de campo la patogenicidad de B. brongniartii (Bbr. Cab) aislada en Cabimbú, estado Trujillo, Venezuela y B. brongniartii (Bbr. Perú) proveniente del Cusco, Perú, sobre el gusano blanco de la papa (Premnotrypes borax), en parcelas de Solanum tuberosum (var. Granola), encontrando tubérculos dañados a la cosecha de 16 y 25%, respectivamente contra 40% del control tradicional del insecticida, lo que demuestra la variabilidad patogénica.
A pesar de que la cepa de B. brongniartii utilizada por Barson et al. (1994) sobre M. domestica mostró mortalidad de 2 y 8% en 6 y 9 días, respectivamente para una concentración de 104 esporas/mL, en esta investigación se obtuvo un TL50 y TL95 la misma concentración en 13 y 17 días, respectivamente. A concentraciones más altas de 107 esporas/mL se obtuvieron TLy TLde cinco y nueve días.
Estos resultados ponen de manifiesto la elevada patogenicidad de la cepa evaluada. Por otra lado, Scorza y Cova (2006) en un experimento similar, pero con una cepa de B. bassiana colectada en el estado Mérida, Venezuela, a concentraciones de 107 esporas/mL obtuvieron
TL50 y TL95 5 y 6 días, respectivamente. Dada esta problemática y los efectos que puedan tener los diferentes ambientes y la variabilidad genética sobre la patogenicidad de los hongos entomopatógenos de un mismo género, no se descarta la posibilidad de su uso integrado a nivel de granjas, avícola, porcinas y de ganado vacuno, donde la combinación de hongos y estrategias viables en cuanto a dosis, frecuencias y formas de aplicación garanticen una persistencia patogénica del hongo en el tiempo (Cova y Scorza, 2006).En el caso de B. bassiana el hongo ha sido evaluado contra larvas de M. domestica en concentraciones de 107 esporas, durante catorce días, reduciendo en 84% la emergencia de imagos, contra 54% en lotes no tratados, lo cual induciría a pensar en lo inútil de su uso en larvas, dada la mortalidad del control (Barson et al., 1994). Sin embargo, la exposición de moscas adultas acumuladas dentro de unidades de crecimiento de pollos a la nebulización con B. bassiana podría no solamente producir una disminución drástica de adultos en cuatro semanas (Cova y Scorza, 2006), sino tal vez inducir una acción sostenida durante un cierto tiempo, similar a la acción epizoótica detectada en colonias de comején (Coptotermes formosanus) en otras partes del mundo (Sun et al., 2003).
Aún cuando los porcentajes de mortalidad para moscas adultas registrados por los investigadores británicos (Barson et al., 1994) con una cepa de B. bassiana y otra de Metarhizium anisopliae fueron muy elevados (con ambos a 105 conidias/mL indujo 100% mortalidad a los seis días), los resultados obtenidos en la presente investigación también son aceptables. En este sentido, la cepa de B. brongniartii utilizada en este estudio (LF-05) parece ser menos patógena que la de B. bassiana cultivada en el Instituto Internacional de Micología de Londres (IMI 061345), ya que a 105 conidias/mL, el hongo tarda diez días para inducir mortalidad de 100% en moscas adultas. Estos resultados sugieren la necesidad de hacer repetidamente exposiciones con dosis mayores de 105 conidias/mL para alcanzar la máxima letalidad en menor tiempo. Como quiera que el estiércol extraído de las granjas y utilizado en las áreas agrícolas tarda más de una semana para ser usado es posible que con tres nebulizaciones con el hongo biocontrolador en los sitios de su producción sea posible no solamente reducir la población de moscas in situ, sino eliminar la eventual eclosión de moscas a distancia en los lugares abonados.
CONCLUSIONES
Esporas de B. brongniartii (cepa LF-05) a dosis de 1,2 x 107 esporas/mL indujo, a nivel de laboratorio, 95% de mortalidad en M. domestica en el menor tiempo (nueve días). Se recomienda el uso de nebulizaciones para el control de la mosca en unidades de producción avícola, porcina y de vacunos, fundamentalmente.
AGRADECIMIENTOS
]]> Los autores agradecen al CDCHT por el financiamiento de esta investigación (NURR-C-32903-09-A).LITERATURA CITADA
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