Zambrano, J. L.1; Botero, L.2; Cavazza, M. E.3 y Avila, M.4

1. Unidad de Investigaciones en Microbiología Ambiental, Facultad Experimental de Ciencias, La Universidad del Zulia. 

2. Centro de Investigaciones del Agua, Facultad de Ingeniería, La Universidad del Zulia.

 3. Laboratorio de Histoquímica, Instituto de Biomedicina, MSDS, UCV, Caracas, Venezuela. 

4. Instituto de Oncología y Hematología, MSDS.

Se determinó resistencia a antibióticos y presencia de plásmidos en cepas de Escherichia coli recuperadas de aguas crudas y tratadas de un sistema de lagunas de estabilización. Se determinó la resistencia a los siguientes antibióticos: ácido nalidíxico (Na), ampicilina (A), amikacina (Ak), cloranfenicol (C), carbenicilina (Cb), trimetoprim (Tr), tobramicina (Tb), tetraciclina (T), gentamicina (G) y kanamicina (K). La extracción de plásmidos se realizó por el método de lisis alcalina. El 81,25% de las cepas de aguas crudas fueron resistentes a A, el 68,75% a T, el 46,87% a Cb, el 12,50% a Tr y el 3,12% a C y a Tb. En el 83,87% de las cepas de aguas tratadas, fueron resistentes a A, el 16,12% a Tr y a T, el 12,9% a Cb y el 3,22% a Ak, C y Tb. El 100% de las cepas fueron sensibles a Na, G y K. El orden de resistencia en las muestras crudas y tratadas fue: A > Tb >Tr > Cb > Ak = C = Tb y A > T > Cb > Tr > C = Tb, respectivamente. El 16,12% y el 34,2% de las cepas de aguas residuales crudas y tratadas, respectivamente, presentaron resistencia a más de tres antimicrobianos. La presencia de plásmidos se detectó en el 87,10% de las cepas de aguas crudas y en el 90,62% de la cepas de aguas tratada. Las cepas de E. coli aisladas a la salida del sistema de tratamiento presentaron plásmidos y resistencia a 7 de 10 antimicrobianos, lo que sugiere el intercambio genético entre las cepas y su potencial como patógenos, al combinar diferentes propiedades que contribuyan a su sobrevivencia.

It was determined resistance to antibiotics and plasmids presence, in E. coli strains from raw and treated waters, of the stabilization pounds at the university city of The University of Zulia. The resistance determination of the following antibiotics: nalidixic acid (Na), ampicillin (A), amikacin (Ak), chloramphenicol (C), carbenicillin (Cb), trimethoprim (Tr), tobramycin (Tb), tetracycline (T), gentamicin (G) and kanamycin (K), was performed by Kirby-Bauer´s method. The plasmids extraction was performed by Biboin and Doile´s alkaline lisis method. 81,25% of the strain isolated from the untreated wastewater were resistant to A, 68,75% to T, 46,87% to Cb, 12,50% to Tr and 3,12% to C and T. 83,87% of the strains from the treated wastewater were resistant to A, 16,12% to Tr and T, 12,9% to Cb and 3,22% to Ak, C and Tb. 100% of the analyzed strains went sensitive to: Na, G and K. The resistance order determined in the untreated waswater was: A > T b > Tr > Cb > Ak = C = Tb and in the treated wastewater samples: A > T > Cb > Tr > C = Tb. 16.12% and 34.2% of the strains of the raw residual samples and treated respectively presented resistance at last for three antibiotics. The plasmids presence was detected in 87.10% of the selected strains of the raw samples and in 90,62% of the treated waters. The strains of E. coli isolated from treated wastewater presented plasmids and resistance at 7 out of 10 antibiotics, what suggests the genetic exchange between the strains and their potential as pathogens, by combining different properties that contribute to their survival.

Los efluentes urbanos contienen altas concentraciones de bacterias, que pueden ser comensales del intestino humano y/o de animales de sangre caliente. Además, pueden contener bacterias con características patógenas, que pueden originar problemas de salud pública. Junto a las bacterias, los agentes antimicrobianos son también descargados en el ambiente en grandes cantidades, como resultado del uso indiscriminado de éstos, tanto en prácticas médicas como veterinarias y agrícolas. El contacto de las bacterias con diferentes antibióticos a concentraciones diversas originan una presión selectiva entre las poblaciones bacterianas, dando como resultado un incremento de bacterias con resistencia adquirida a drogas antimicrobianas (1, 2).

Debido a que los efluentes urbanos presentan altas concentraciones de patógenos, es imperativo tratar las aguas residuales crudas, con el fin de removerlos. Una de las opciones más recomendadas para el tratamiento del agua que va a ser empleada con fines de riego de áreas agrícolas son las lagunas de estabilización (3). Sin embargo, estos sistemas pueden llegar a convertirse en depósitos de bacterias entéricas, que presentan genes de resistencia a antibióticos, así como de aquéllas que puedan servir de receptores a estos genes. Es por esto que a los sistemas de tratamiento se les ha atribuido una gran importancia ecológica en la transferencia horizontal de genes, a través de los plásmidos (4). Con el fin de aportar información acerca de la calidad de los efluentes con relación a parámetros no convencionales, como bacterias resistentes a los antimicrobianos y la presencia de plásmidos endémicos, se planteó el estudio en cepas de E. coli aisladas de las aguas residuales crudas y tratadas del sistema de lagunas de estabilización de La Universidad del Zulia, las cuales son utilizadas en el riego de áreas verdes y zonas de cultivo experimentales.

Área de estudio y colección de las muestras:
Las muestras fueron tomadas en las lagunas de estabilización de la Universidad del Zulia, las cuales se encuentran ubicadas en la Ciudad Universitaria, en el Centro de Investigación del Agua. Consisten en nueve lagunas interconectadas, en una secuencia de tres facultativas y seis de maduración, distribuidas en tres sistemas A, B y C (figura 1). Las aguas residuales que entran a este sistema, provienen del Colector C de Hidrolago, empresa que administra el agua de la ciudad. Este colector recoge las descargas de áreas residenciales del Norte de la ciudad y de la misma Ciudad Universitaria. El sistema tiene dos estaciones de bombeo: una que transfiere las aguas crudas a las lagunas y otra que hace pasar el efluente a través de una serie de filtros hacia una zona de irrigación de cultivos experimentales y hacia áreas verdes de la Ciudad Universitaria. Las muestras de 200 mL fueron recolectadas durante los meses de octubre a diciembre de 1999 y durante julio y agosto de 2000, en botellas estériles, tanto en la entrada del sistema como en el efluente final, y fueron transportadas en refrigeración al laboratorio para su procesamiento antes de 6 horas.

Determinación de indicadores de calidad y aislamiento e identificación de E. Coli.
Los coliformes totales y termotolerantes fueron evaluados utilizando metodología estándar (5). De los tubos que presentaban crecimiento y gas en el medio caldo EC utilizado en la determinación de los coliformes termortolerantes, se tomó una asada, y se inoculó en los medios selectivos agar MacConkey (Mc) y agar Eosin-Methyl Blue (EMB). Estos medios se incubaron a 35,5ºC por 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, se seleccionaron colonias representativas de E. coli: rosadas a fucsia en el medio Mc y moradas con brillo metálico verde en el EMB, y se identificaron presuntivamente en base a la tinción de Gram, oxidasa y la fermentación de la lactosa en el agar triple azúcar hierro. La identificación bioquímica completa fue realizada con las pruebas de indol, rojo de metilo, Voges-Proskauer, citrato de Simmons, arginina, lisina, ornitina fenilalanina, malonato, urea y motilidad, de acuerdo con tablas de identificación convencional (6).

Serotipificación:
Para la identificación de las cepas de E. coli enterotoxigénica (ECET) se utilizaron los siguientes antisueros polivalentes (Fuvesin. Caracas, Venezuela): I: O:6, O:25, O:27, O:78, O:168; II: O:20, O:63, O:153, O:166, O:148 y III: O:8, O:15, O:115, O:159, y O:169.

Prueba de susceptibilidad a agentes antimicrobianos:
La susceptibilidad a agentes antimicrobianos se determinó por el método de difusión en placa de Kirby-Baüer, utilizando el agar Mueller-Hinton (7), empleando 10 antimicrobianos que corresponden a las drogas comúnmente utilizadas en el tratamiento de infecciones por enterobacterias en humanos, de acuerdo a las sugerencias del National Commitee for Clinical Laboratory Standards (8). Estos antimicrobianos fueron: ampicilina (A: 10 mg), amikacina (Ak: 30 mg), cloranfenicol (C: 30 mg), carbenicilina (Cb: 100 mg), trimetoprim (Tr: 5 mg), tobramicina (Tb: 10 mg), tetraciclina (T: 30 mg), gentamicina (G: 10 mg), kanamicina (K: 30 mg) y ácido nalidíxico (Na: 30 mg)). Después de 24 horas de incubación a 35,5ºC, las cepas fueron clasificadas como susceptibles, intermedias y resistentes, de acuerdo con los diámetros de inhibición indicados por el NCCLS.

Determinación del indice de resistencia múltiple a agentes antimicrobianos:
El índice de resistencia múltiple a antimicrobianos (9), fue calculado empleando la ecuación de Krumperman (a/bxc), donde a es el número de cepas que presentaron resistencia a tres o más agentes antimicrobianos; b es el número de antibióticos sujetos a evaluación en el estudio; y c es el número total de cepas de E. coli a las que se les realizó los ensayos de susceptibilidad.

Las cepas provenientes de las aguas crudas y las tratadas fueron consideradas independientes para el cálculo de este índice.

Calidad de las aguas:
Los resultados obtenidos tanto de los indicadores microbiológicos como de las determinaciones fisicoquímicas se presentan resumidos en la tabla I. Para las muestras de agua cruda a la entrada del sistema, las medias geométricas de los CT y CTT fueron de 4,56 x 107 NMP/100 mL y de 1,51 x 107 NMP/100 mL. La temperatura, el pH y la turbidez de estas aguas presentaron valores de media geométrica de 30,6ºC, 7,47 y 130,34 NTU, respectivamente.

Tabla I. Medias geométricas y porcentaje de remoción de los indicadores de biológicos y fisicoquímicos.

En el efluente final tratado, la media geométrica de la temperatura fue de 29,2ºC, el pH 7,56 y la turbidez de 50,4 NTU. Los valores de la media geométrica de los indicadores bacterianos fue de 2,24 x 104 y 8,6 x 103 NMP/100 mL para los CT y CTT, respectivamente.

Selección de cepas en muestras crudas y tratadas:
Se seleccionaron un total de 69 cepas de E. coli de ambos tipos de muestras, de las cuales 31 se obtuvieron de las muestras de agua crudas y 38 de las tratada. Cinco de las cepas seleccionadas, tanto de las muestras residuales crudas como de las tratadas, fueron positivas a la serología con los antisueros correspondientes para ECET.

Tabla II. E. Coli que presentaron resistencia a los antimicrobianos evaluados.

Los patrones de resistencia se muestran en la tabla III. Diecinueve de las 31 cepas (61,90%) de E. coli seleccionadas de las muestras de aguas crudas fueron resistentes a sólo un antimicrobiano. Cuatro cepas (12,90%) fueron resistentes a dos antimicrobianos, tres cepas (9,67%) lo fueron a tres, y dos cepas (6,45%) a cuatro de los antimicrobianos evaluados. En las cepas provenientes del efluente tratado, nueve de las 38 (23,68%) fueron resistentes a sólo un antibiótico, ocho (21,05%) fue tencia a A; 22 (68,75%) a T y 15 (46,87%) a Cb. Sólo en una cepa (3,12%) fue registrada resistencia a C y a Tb. No se obtuvieron cepas resistentes a Ak, G, K y Na.

Tabla III. Patrones de resistencia a los antimicrobianos en cepas de E. Coli aisladas de muestras de aguas residuales crudas y tratadas.

Los patrones de resistencia se muestran en la tabla III. Diecinueve de las 31 cepas (61,90%) de E. coli seleccionadas de las muestras de aguas crudas fueron resistentes a sólo un antimicrobiano. Cuatro cepas (12,90%) fueron resistentes a dos antimicrobianos, tres cepas (9,67%) lo fueron a tres, y dos cepas (6,45%) a cuatro de los antimicrobianos evaluados. En las cepas provenientes del efluente tratado, nueve de las 38 (23,68%) fueron resistentes a sólo un antibiótico, ocho (21,05%) fueron resistentes a dos agentes antimicrobiano, y 11 (28,94%) lo fueron a tres. Se observó multirresistencia a cuatro y a cinco antibióticos en sólo una cepa (2,63%).

Extracción de plásmidos:
En la tabla IV se presentan los resultados de la extracción de plásmidos de las 69 cepas de E. coli en estudio. 26 cepas (83,87%) de las 31 aisladas de las muestras crudas y 35 (92,10%) de las 38 cepas provenientes de las muestras tratada contenían plásmidos. En las cepas de las muestras crudas se encontraron bandas de tamaños que comprendían desde >35Kb a 2Kb, y en las cepas seleccionadas de las muestras residuales tratadas el rango de tamaño observado fue de >35 Kb a 1Kb.

Tabla IV. Número y tamaño de plásmidos en las cepas de E. Coli aisladas en aisladas en las muestras de aguas crudas y tratadas.

Los efluentes urbanos contienen altas concentraciones de bacterias que pueden originar problemas de salud pública, por lo que se hace necesario tratar las aguas residuales. La OMS ha estipulado que para poder reutilizarse las aguas residuales tratadas en riegos de cultivos deben de tener una concentración de NMP/100 mL de CTT < 103 (3). Generalmente, estos niveles de CTT se logran cuando los sistemas alcanzan porcentajes de remoción elevados (>99,9%). En este estudio, a pesar de haberse obtenido excelentes niveles de remoción de los indicadores bacterianos (99,95% CT y 99,94% CTT) sólo el 23,5% (4/17) de las muestras residuales tratadas durante el período de recolección de muestras cumplieron con esta norma de la OMS. Trabajos anteriores realizados en el mismo sistema han obtenido valores similares de remoción (10).

En la figura 2 se observó que el porcentaje de las cepas resistentes a ampicilina fue mayor que el encontrado en las cepas de E. coli aisladas tanto de las muestras crudas (83,87%) como de las tratadas (81,25 %). La resistencia a C y Tb se encontró en iguales porcentajes (3,22%) en ambos tipos de muestras. Sólo en las muestras crudas se observó resistencia a Ak (3,22%), mientras que fue mayor la resistencia a aTr (16,12%) en este tipo de agua, en contraste con un 12,16% en las muestras tratadas. A diferencia con las muestras crudas, se observó un mayor número de cepas de E. coli las aguas tratadas que fueron resistentes a T (68,75%) y a Cb (46,87%). En ningún caso, antes o después del tratamiento, se determinó resistencia a G, K y Na.

Figura 2. Porcentaje de cepas de E. Coli resistentes a los antimicrobianos.

Andersen (1993) registró la resistencia a ampicilina como la mayor encontrada en un sistema de tratamiento de efluentes urbanos en Copenhague, Dinamarca. Harwood, en el año 2000, detectó un porcentaje significativo de cepas de coliformes de origen humano que fueron resistentes a los antibióticos de la familia de los betalactámicos, entre ellos la ampicilina, a diferencia de cepas de origen animal, las cuales presentaban resistencia a tetraciclina y sus derivados. Los patrones de resistencia se han propuesto como parámetros para el estudio de la calidad de las aguas, sobre todo en aquellos casos donde es necesario establecer si el origen de la contaminación es humana o animal. La diferencia en la resistencia entre las cepas de origen humano es significativamente diferente de aquéllas que provienen de animales de sangre caliente, ya que los antimicrobianos y las dosis utilizados en los tratamientos de infecciones bacterianas en humanos y en animales son diferentes; además, en animales se emplean grandes cantidades de antibióticos, para su engorde (11, 12 ) .

Se ha determinado que más del 90% de las cepas de E. coli aisladas de aguas impactadas por descargas fecales de origen humano presentan resistencia al menos a uno o dos antibióticos. En este estudio, un 84,21% de las cepas aisladas del efluente presentaron resistencia al menos a un antimicrobiano. El 34,21% de éstas presentaron resistencia a más de tres antimicrobianos. La multirresistencia puede significar un riesgo para la salud pública si se encuentran bacterias con características de patogenicidad asociadas, presenten resistencia múltiples y se encuentren en aguas destinadas a riego.

El 16,12% (5/31) y el 13,15% (5/38) de las cepas de las muestras crudas y tratadas, respectivamente, fueron positivas a la serología para ECET. Una de las cepas de las muestras crudas presentó resistencia a dos antibióticos, otra a un solo antimicrobiano y el resto fueron sensibles a todos los antimicrobianos evaluados, a diferencia de las cepas positivas a ECET de las aguas tratadas, de las cuales tres fueron resistentes a tres antimicrobianos y dos cepas a uno solo. La presencia de cepas de E. coli positivas para la serología de ECET multirresistentes en las muestras de aguas residuales tratadas muestra la importancia del tratamiento y el monitoreo de este tipo de aguas.

Distintos autores indican que la reducción de las bacterias multirresistentes provenientes de lagunas de oxidación pueden variar, y se especula acerca de su resistencia al tratamiento, ya que pueden poseer una ventaja ecológica sobre aquellas bacterias sensibles en las lagunas de maduración (15, 16). Bell et al. (17) concluyen que las bacterias multirresistentes fueron removidos más eficientemente que aqueéllas sensibles a las drogas antimicrobianas.

Krumperman (18) estableció un índice estadístico de 0,200, el cual puede predecir un alto riesgo en la salud pública por contaminación de alimentos cuando se encuentran presentes bacterias con resistencia múltiple si el índice obtenido es mayor al índice preestablecido por Krumperman. El índice obtenido en este estudio para las muestras crudas fue de 0,0161 y de 0,0419 en las muestras tratadas. Otros autores han establecidos valores inferiores (0,016) para las muestras tratadas que los obtenidos en el presente trabajo (20, 4). A pesar del bajo índice registrado en este estudio, se determinó un 260% de incremento en la multirresistencia al final del tratamiento.

La presencia de plásmidos puede ser un factor importante en los tratamientos de aguas. Algunos autores han determinado que mientras las poblaciones bacterianas son removidas por los sistemas de tratamientos, aquellos pequeños grupos de bacterias que contengan y puedan transferir horizontalmente genes de resistencia (F+), utilizando como vehículos los plásmidos R, hacia poblaciones bacterianas receptora (F-) pueden replicarse eficientemente incrementando las densidades de estas bacterias (17, 20). Si bien en este estudio no se realizaron ensayos de conjugación, la presencia de una gran variedad de plásmidos de diferentes pesos moleculares en la población estudiada y el incremento de bacterias multirresistentes al final del tratamiento de las aguas hace suponer que la transferencia de factores R puede realizarse en esta agua.

La presente investigación mostró que las descargas al colector C de la ciudad de Maracaibo y la Ciudad Universitaria de la Universidad del Zulia presentaban bacterias multirresistentes, que contenían plásmidos, y que éstas se incrementaban luego del tratamiento por lagunas de oxidación. La sobrevivencia de cepas resistentes a más de tres antimicrobianos en el efluente final tratado lleva a la conclusión de que el concepto, así como las normas de calidad de aguas, deben de ser reevaluados, y muestra la necesidad de establecer nuevos controles y parámetros para la determinación de la calidad del agua, y no basarse únicamente en los indicadores bacteriológicos tradicionales.

Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de La Universidad del Zulia (CONDES-LUZ) (Proyecto N&ordm; 1648-00)

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