Las infecciones por Virus del Papiloma Humano (VPH) representan una de las infecciones de transmisión sexual más comunes en la mayor parte de los países. En los últimos sesenta años se ha estudiado intensamente el tema y uno de los mayores intereses de las investigaciones en VPH reside en la asociación etiológica, de algunas de estas infecciones con el carcinoma de cuello uterino y con otros tumores del tracto genital y perianal masculino y femenino [1,2].

El VPH es capaz de inducir una transformación maligna en la célula huésped mediante un proceso, que permite su conversión de una célula huésped diferenciada a célula cancerosa. En esta transformación, la célula experimenta cambios en su morfología, comportamiento y bioquímica, pierde el control del crecimiento celular y la inhibición del contacto, lo que induce a la invasión del tejido normal.

La citología exfoliativa y el estudio histopatológico son técnicas que han proporcionado terminologías y criterios de diagnóstico en la lectura del frotis cérvico-uterino. Basado en estas técnicas, uno de los métodos que mayormente ha abierto el campo para estandarizar el tratamiento de las enfermedades cérvico-uterinas, es el sistema de Bethesda [3,4]. Este sistema clasifica las lesiones intraepiteliales escamosas (LIE) en bajo y alto grado de malignidad y a menudo están en relación con el genotipo viral que infecta la lesión.

Hasta el momento, han sido detectados alrededor de 200 tipos de estos virus y, según su poder oncogénico, ellos son clasificados como de alto y bajo riesgo de desarrollar cáncer. Los tipos de alto riesgo más conocido son: VPH 16, 18, 45, 31, 52, 33, 58, 35, 59, 51, 56, 39, 68, 73 y 82. En la actualidad se reconocen a los VPH 16 y 18 como agentes etiológicos del cáncer cérvico uterino y muy asociados a lesiones pre-malignas y malignas a nivel de genitales así como, en otras localizaciones tales como: boca, laringe, faringe, colon y ojo, fundamentalmente. Los VPH de bajo riesgo más frecuentemente asociados a lesiones benignas y premalignas de bajo grado son el tipo 6 y el 11 [2,4,5,6].

Las atipias coilocíticas y neoplasia intraepitelial cervical 1 (NIC I) son consideradas como LIE de bajo grado y de alto grado las lesiones NIC II y NIC III [2,4,5,6].

La lesión intraepitelial escamosa (LIE) muestra, desde el punto de vista histopatológico una proliferación celular con maduración anormal y atipia citológica que incluye núcleo hipercromático, distribución anormal de la cromatina, pleomorfismo nuclear y aumento de la relación núcleo / citoplasma [2,4,7,8].

Un tejido puede mostrar cambios sugestivos de infección por el virus del papiloma humano, como es la presencia de hiperqueratosis, inclusiones citoplasmáticas y coilocitosis, estos cambios son denominados efectos citopáticos que experimentan las células infectadas por el virus. Los coilocitos (coilo= hueco) o cavitaciones perinucleares, son producto del colapso de la matriz de citoqueratina al interaccionar con la proteína E4 del VPH y específicamente con la filagrina que se une a la citoqueratina [2,4,7,8].

Las lesiones precancerosas presentan un continuo espectro de alteraciones morfológicas con patrones no muy bien delimitados, estos se refieren a cambios precoces en el tamaño, forma y número de células que forman la superficie del cuello uterino. Esto puede estar relacionado con el proceso mismo de neoplasia y de su asociación a infección por el virus del VPH; sin embargo, no hay una descripción de estos hechos como fenómeno atribuible a la transformación maligna o a la infección viral [8].

Los efectos citopáticos del virus no son lo suficientemente precisos para certificar la presencia del VPH y no es posible determinar el genotipo viral; sólo el uso de técnicas moleculares detecta la presencia de ADN viral y tipifica su genotipo. Tampoco estos efectos citopáticos señalan elementos morfológicos reales que establezcan que son atribuibles a la infección viral o que son parte del propio proceso neoplásico.

El propósito del presente trabajo fue conocer las alteraciones morfológicas de las lesiones intraepiteliales escamosas a nivel ultraestructural y estudiar si ellas aparecen como producto del proceso precanceroso o de su asociación a los diferentes genotipos virales detectados. En función de ello se estudiaron muestras obtenidas de pacientes. Para lograr lo propuesto, se procedió a detectar y tipificar el virus en las muestras, se realizaron observaciones mediante microscopio electrónico de transmisión y posteriormente se caracterizaron las alteraciones ultraestructurales observadas y comparadas con los patrones estandarizados de tejido normal del cérvix.

Se estudiaron 56 muestras de cérvix obtenidas de pacientes de la consulta de patología de cuello uterino del ambulatorio "María Teresa Toro" del Estado Aragua, que no habían recibido tratamiento y eran sugestivas de infección por VPH. Previo consentimiento informado, a cada paciente se le tomó una (1) muestra con hisopo de dacrón para el estudio molecular y una (1) biopsia dirigida del epitelio cervical para la observación ultraestructural. Las muestras tomadas para el estudio genético y tipificación del virus del papiloma humano se incluyeron en viales estériles y fueron almacenadas en refrigeración hasta su traslado. La identificación del genoma viral y tipificación se realizó en el laboratorio de Genética Molecular del Instituto de Hematología y Oncología del Ministerio de Salud.

Una vez colocadas las muestras de citología y las biopsias en tubos de eppendorf, se agregó proteinasa K (1000 µl/ml) más tampón de lisis en igual proporción. En el caso de las biopsias se utilizó de 50 a 100 µl de proteinasa K más 50 a 100 µl de tampón de lisis; luego de agitar, se encubó en baño de María a 55 °C, durante una hora. Posteriormente, se le adicionó a la muestra la mezcla de cloroformo: fenol: alcohol isoamílico (SIGMA P-3803) en volúmenes iguales a lo utilizado de proteinasa K más tampón de lisis.

Se tomó el sobrenadante, una vez centrifugada la muestra a 14.000 rpm por 15 minutos y se agregó el cloroformo en igual volumen que el sobrenadante, agitando por inversión, se centrifugó a 14.000 rpm, durante 15 minutos.

El sobrenadante se tomó y se precipitó el ADN con acetato de amonio (1:10), más dos volúmenes de etanol (100%). Se centrifugó a 14.000 rpm, durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y añadieron 500µl etanol al 75%, luego se centrifugó a 14.000 rpm, durante 10 minutos, se descartó el sobrenadante y colocaron los eppendorf abiertos y volteados sobre el papel absorbente hasta que el etanol estuvo totalmente seco.

Se resuspendió en agua libre de ARNasa y ADNasa con un volumen de acuerdo al tamaño del sedimento.

Se utilizó como control positivo interno de calidad para el material genético un precursor del gen de la beta globina, un control negativo sin ADN y una muestra positiva para VPH que correspondió a ADN extraído de células HeLa mantenidas en cultivo en el laboratorio de Genética.

Las muestras positivas fueron procesadas con el estuche MPCR (Maxim-Biotech, USA), para el reconocimiento de los tipos virales, 6,11,31,33,16 y 18 y se procedió a la realización de la corrida electroforética en gel de agarosa.

El procesamiento, corte y coloración de la muestra para observación con el microscopio electrónico de transmisión se realizó en el Centro de Microscopía Electrónica de la Facultad de Ciencias de la Universidad Central de Venezuela. La observación y toma de las micrografías electrónica se realizaron en el Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas.

Se siguió la técnica de preparación de muestras conocidas como técnica del corte fino, la cual comprenden la fijación, deshidratación, infiltración e inclusión. Los cortes finos fueron de 60-90 nm.

Se colocaron algunas gotas de acetato de uranilo al 2% en una tira de polietileno grueso o cera dental y se sumergió una rejilla con cortes en cada gota.

Fue encubada en una cápsula de Petri cubierta por 30 minutos a 60 ºC., se sujetó cada rejilla con una pinza y se lavó, primero con agua destilada y luego dejando la rejilla a pocos milímetros del agua destilada, se limpió en una cápsula de Petri, se esperó 3 minutos y retiró el agua tocando el borde de la rejilla con papel filtro.

Se lavó cada rejilla con agua en forma de chorro y luego se sumergió en agua destilada por 1 a 2 minutos, se pasaron las rejillas a otra cápsula de Petri y se secaron con papel de filtro. Finalmente, se procedió a la observación en el Microscopio Electrónico de Transmisión.

Del total de muestras procesadas, 47 presentaron LIEgB (83,93%) y 9 LIEgA (16%). En el 23,2% de estas muestras se detectó la presencia del ADN viral mediante la técnica de PCR y 76,7% resultaron negativas. En el 30,7% de las lesiones intraepiteliales de alto grado (NIC III) se detectó la presencia del ADN viral, en un 38,4% de las muestras no se detectó y en el 30,7% del material fue insuficiente para la identificación del virus (Figura 1). Esto significa que de cada diez muestras tres presentaron infección por virus de VPH y clasificadas como LIE de alto grado. Este grupo de pacientes presenta dos veces más riesgo de evolucionar a lesiones malignas que las pacientes con LIE sin presencia del ADN viral.

La evolución de cada tipo de NIC es variable, el 60% de los NIC I regresan a un estado normal del epitelio en 2 - 3 años, incluyendo algunos casos severos [9]. La sola presencia del ADN viral, no es indicativa de una transformación maligna, la carga viral y la persistencia de infección por VPH apoyan la progresión maligna en las lesiones de alto riesgo [5,10], sin embargo, la presencia viral es un elemento que diferencia el tratamiento y seguimiento de estas pacientes.

El grupo de pacientes con diagnóstico de LIE de alto grado ADN viral positiva, son pacientes que ameritan un seguimiento de su evolución clínica posterior al tratamiento recibido. El estudio de la morfología y el proceso de reparación del epitelio cérvico uterino son de gran importancia en estos casos, por considerarse un grupo con mayor susceptibilidad a desarrollar cáncer de cuello uterino. El grupo de pacientes sin ADN viral, probablemente presentó alguna patología inflamatoria a nivel cervical que pudo dar alteraciones morfológicas del tejido, compatibles con los cambios sugestivos de infección viral [11].

Los genotipos encontrados en las muestras de pacientes con ADN viral fueron los VPH 16, 6 y 11 (Figura 2 y 3) en las LIE de bajo grado y VPH 16 y 6 en LIE de alto grado, el VPH 18 no fue encontrado en las muestras estudiadas. Estos resultados coinciden con los observados en México por Busto, A. y Muñoz L, mediante estudios inmunohistoquímicos de las proteínas virales e hibridización "in situ", quienes detectaron el VPH 16 como subtipo dominante en las muestras estudiadas [12], en parte, con los resultados de investigadores del Fred Hutchinson Cancer Research Center de Estados Unidos que reportaron el VPH 16 en el 68% de las muestras estudiadas con diagnóstico de cáncer de cuello uterino [13] y los estudios de Puig A.M. y col. que obtuvieron en nueve (9) casos de LIE de alto grado y tres (3) carcinomas de cuello uterino el genotipo VPH 16, estos investigadores no encontraron este genotipo en lesiones de bajo grado, a diferencia del presente estudio.

El genotipo viral 6 encontrado en las muestras esta frecuentemente asociado a condilomas acuminados y verrugas orales, conjuntamente con el genotipo 11. En nuestro caso el genotipo viral 6 se detectó en muestras diagnosticadas como LIE de alto y bajo grado. Si se considera la presencia de un genotipo viral de bajo riesgo asociado a uno de alto riesgo en un tejido, en este caso los tipos 16 y 6 reportados en las muestras, es probable que la presencia de estos virus de bajo riesgo, experimenten una asociación con los de alto riesgo y ello conlleve a la duplicación de las cargas virales o tengan un efecto sinérgico en la oncogénesis del virus de alto riesgo.

La presencia del VPH 16 encontradas en las muestras estudiadas, confirma la mayor prevalencia de este genotipo viral en lesiones precursoras del cáncer del cérvix uterino.

Estudio ultraestructural: Se evaluó una muestra con diagnóstico de LIE de alto grado (NIC II) infectada con VPH y con presencia de los genotipo viral 16 y otra con genotipo 6. Esta muestra se comparó con otra LIE de alto grado (NIC III) que no reportó presencia del genoma viral. Se observó en el microscopio electrónico de transmisión en la muestra VPH ADN positiva, una célula alargada presentando un núcleo alargado, hipercromático y de contornos irregulares. La envoltura nuclear es discontinua. En la región central del núcleo se apreciaron unos gránulos gruesos de cromatina. Además de estos elementos, se observó la presencia de filamentos de colágeno con una periodicidad característico, figuras mielínicas y gránulos de lipofúscina o cuerpos residuales (Figura 4). Estos se han visto en metástasis hepáticas de leiomyosarcoma de colon [14], en carcinoma de células escamosas del cérvix [15] y en patología neuromuscular del fenómeno paraneoplásico asociado a carcinoma de cérvix [16].

En la muestra LIE de alto riesgo VPH ADN negativa, el núcleo de una célula presentó también abundante heterocramatina aun cuando sus contornos no son irregulares. Tampoco presentó granularidad gruesa y la envoltura nuclear fue continua. Por otra parte se observaron mitocondrias edematizadas y gránulos electrondensos (Figura 5).

Los resultados obtenidos en el presente estudio indican una relación entre los cambios celulares importantes asociados con procesos premalignos y la presencia del virus de papiloma humano de alto riesgo oncogénico. Existen pocos reportes en los que se indique los cambios morfológicos de biopsias de cuello uterino analizados por microscopia electrónica y la presencia de ADN viral, por ende la utilización de ambas técnicas permitirá realizar observaciones mas detalladas de las variaciones del tejido del cuello uterino durante la infección y establecer relaciones moleculares entre el genotipo viral, la carga viral y la progresión maligna

A todo el personal del Ambulatorio "María Teresa Toro" del Estado Aragua y especialmente al Dr. Puerta y al Dr. Landaeta por su gran colaboración.

Parte de esta investigación fue presentada en el VIII Congreso Argentino de Virología celebrada en septiembre 2005 gracias al apoyo de FUNDACITE Aragua.

FONACIT S1-2000000643 Y G-2005000408.