Marianella Perrone, a,* Gerardo González-Valencia b, Margarita Camorlinga b, María Correnti c, María Eugenia Cavazza d, Javier Torres b
a Instituto de Investigaciones Odontológicas, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela
b Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, IMSS, Ciudad de México, México
c Instituto de Oncología y Hematología, Ministerio del Poder Popular para la Salud, Caracas, Venezuela .
d Instituto de Biomedicina, Ministerio del Poder Popular para la Salud, Caracas, Venezuela
* Correspondencia:E-mail: mperrone@cantv.net
Resumen
La infección por Helicobacter pylori está asociada con gastritis, úlcera gastroduodenal, linfoma tipo Maltoma, y es considerado un importante factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico. El objetivo de este estudio fue caracterizar los genotipos vacA de cepas de H. pylori provenientes de biopsias gástricas de una población venezolana. Se evaluaron 128 pacientes con indicación de endoscopia, por enfermedad de las vías digestivas superiores. Se obtuvieron biopsias gástricas de cada uno de ellos para la amplificación de glm y tipificación de las formas alélicas de vacA, empleando la reacción en cadena de la polimerasa. Los resultados demostraron que 82 (64%) de las muestras fueron positivas para la amplificación de glm. De estos, 51 (62%) de las cepas tenían el genotipo vacA, forma alélica S1 (17 s1a, 29 s1b, 5 s1a+s1b, 10 fueron no tipificables) y 21 (26%) tenían el subtipo S2. El análisis de la región media de vacA reveló que 42 (51%) fueron vac A m1, 26 (32%) m2 y 14 (17%) no tipificaron para m1 o m2. Los resultados de la presente investigación demostraron una alta frecuencia de infección por H pylori genotipo vac A variante alèlica s1/ m1.
Palabras clave: Helicobacter pylori, vacA, patogenicidad, virulencia, genotipos, infección mixta
]]> Helicobacter pylori vac A genotypes in a Venezuelan populationAbstract
Helicobacter pylori infection is associated with gastritis, gastroduodenal ulcer, and Maltoma type lymphoma, and is also considered an important risk factor for the development of gastric cancer. The purpose of this study was to characterize vacA genotypes of H. pylori strains from gastric biopsies from a Venezuelan population. One hundred and twenty eight patients who required endoscopy due to disease of the upper digestive system were evaluated. A gastric biopsy was taken from each of them for glm amplification and typing of the allelic vacA forms, using the polymerase chain reaction assay. Results showed that 82 (64%) of the samples were positive for glm amplification. Of these, 51 (62%) of the strains had the vacA genotype, S1 allelic form (17 sla, 29 slb, 5 sla+slb, 10 were not typable) and 21 (26%) had the S2 subtype. The analysis of the vacA mid region revealed that 42 (51%) were vacA m1, 26 (32%) m2, and 14 did not type for m1 or m2. The results of this investigation showed a high frequency of H. pylori vacA genotype infections, s1/m1 allelic variants.
Keywords: Helicobacter pylori, vacA, pathogenicity, virulence, genotypes, mixed infection
Recibido: 12 de marzo de 2009; Aceptado: 30 de junio de 2009
Introduccion
Helicobacter pylori coloniza persistentemente la mucosa del estómago humano causando gastritis crónica, y es considerado un importante factor de riesgo para la enfermedad gastroduodenal, incluyendo úlcera péptica y carcinoma gástrico. [1-5]. Se han descrito genes bacterianos específicos, que están asociados con la virulencia de este microorganismo [6-8].
La interacción entre la bacteria y el hospedero, es un factor clave que determina las consecuencias clínicas de la infección por H. pylori. A este respecto, el sistema inmune juega un papel importante en prevenir o promover la enfermedad [9].
Ha sido propuesto que ciertas cepas de H. pylori pueden ser mas virulentas que otras, habiéndose identificado algunas características asociadas con la severidad de la enfermedad [1,2].
Entre los factores de virulencia bacterianos responsables de las manifestaciones clínicas, están las adhesinas (BabA, SabA), la citotoxina vacuolizante VacA, y los productos de la isla de patogenicidad Cag. Los patrones de producción de citoquinas en respuesta a la infección por H. pylori, constituyen uno de los principales factores del hospedero, que pueden limitar el desarrollo de la infección a una gastritis, o favorecer el desarrollo de úlcera péptica y cáncer gástrico.[10,11].
]]> Aproximadamente entre un 60% a 70% de las cepas de H. pylori contiene un gen denominado cagA (gen asociado a la citotoxina), que codifica para una proteína de 128 kDa denominada CagA [12]. La presencia de cagA está relacionada con ulceración duodenal, atrofia de la mucosa gástrica y cáncer gástrico. Este gen representa una parte de una gran entidad genómica denominada isla de patogenicidad [10], la cual contiene múltiples genes relacionados con la virulencia y patogenicidad de las cepas de H. pylori [13].Otro factor de virulencia producido por aproximadamente un 50% de las cepas de H. pylori, es una citotoxina que induce la formación in vitro, de vacuolas en las células mamíferas, que determinan la muerte celular [14]. Esta toxina es codificada por el gen vacA, presente en prácticamente todas las cepas de H. pylori.
El gen vacA tiene una estructura de mosaico y en los Estados Unidos, cada alelo tiene 1 de 3 posibles tipos de regiones señales de secuencia, s1a, s1b, y s2 y uno de dos posibles tipos de región media m1o m2. Esta estructura de mosaico de este gen ocurre por las diferencias en la producción de citotoxinas entre las cepas. La tipo s1/m1 produce altos niveles de toxina, las cepas tipo s1/m2 producen de bajo a moderado niveles de toxinas activas, mientras que las tipo s2/m2 no producen ninguna toxina activa. Las cepas s2/m1 han sido muy poco reportadas [15].
Las regiones vacA s y m parecen tener diferente relevancia clínica. Al respecto, las cepas vacA s1a están más asociadas con la presencia de un infiltrado de linfocitos y neutrófilos en la mucosa del antrum, que los tipos s1b o s2. Las cepas vacA m1 están más asociadas con daños al epitelio gástrico que las cepas m2, mientras que las úlceras duodenales son màs prevalentes en pacientes infectados con cepas tipo s1a, que con pacientes colonizados por cepas tipo s1b o s2 [16].
El objetivo de este estudio fue caracterizar los genotipos vacA de cepas de H. pylori, provenientes de biopsias gástricas de una población venezolana.
Materiales y Métodos
Pacientes: Se evaluaron 128 pacientes provenientes de tres hospitales, Hospital Universitario y Hospital Vargas, ambos de la ciudad de Caracas, y Centro de Control de Cáncer Gastrointestinal Dr. “Luis E. Anderson” de la ciudad de San Cristóbal, Edo. Táchira, referidos por presentar enfermedad de las vías digestivas superiores. Se le presentó el consentimiento informado a cada uno de ellos y el protocolo de experimentación fue previamente aprobado por el comité de ética del FONACIT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología). A cada sujeto se le realizó una detallada historia clínica. Los criterios de exclusión del presente trabajo fueron, tratamiento con antibióticos y compuestos que contuviesen bismuto u omeprazol, durante dos semanas previas al examen.
Recolección de las muestras: De cada uno de los pacientes fueron obtenidas biopsias gástricas de la mucosa del antro mediante endoscopia digestiva superior, para los análisis de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).
Identificación de ADN de H. pylori y tipificación de vacA usando el ensayo de la RCP: Las muestras fueron agitadas. La suspensión fue lavada con agua estéril y centrifugada a 12000X g por 3 min. El pellet resultante fue resuspendido en 500µl de buffer de lisis (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 25nM EDTA, 0,5% dodecilsulfato de sodio), y 10 µl de proteinasa K (10mg/ml) fue añadido. La incubación se realizó a 50ºC por 20 h; esto fue seguido por la extracción con fenol cloroformo y precipitación con etanol. El pellet resultante fue disuelto en 100 ul de buffer TE (10 mM), Tris-HCl [pH 7.4}, 0.1 mM EDTA [pH 8.0] por 20 h a 37º C. Las muestras fueron mantenidas a -20ºC hasta su posterior procesamiento. Los primers o iniciadores usados en este trabajo son presentados en la tabla 1.
Tabla 1. Oligonucleótidos iniciadores usados para la tipificación de vacA.
]]>| Gen y región tipif. Genotipo identif. Designación inic. | Secuencia del primer o iniciador | Tamaño prod. RCP. Pares bases |
| vacA región media | | |
| ]]>
m1 | | |
| VA3- F | 5´-GGTCAAATGCGTCATGG-3´ | 290 |
| VA3- R | 5´-CCATTGGTACCTGTAGAAA-3´ | - |
| m2 | ]]>
| |
| VA4- F | 5´-GGAGCCCCAGGAAACATTG-3´ | 352 |
| VA4- R | 5´-CATAACTAGCGCCTTGCAC-3´ | - |
| vacA región señal | | ]]>
|
| s1a | | |
| SS1- Fa | 5´-GTCAGCATCACACCGCAAC-3´ | 190 |
| S1b | | |
| ]]>
SS3- Fa | 5´-AGCGCCATACCGCAAGAG-3´ | 187 |
| s2 | | |
| SS2- Fa | 5´-GCTAACACGCCAAATGATCC-3´ | 199 |
| VA1- R Ure C GLMM-F GLMM-R | 5´-CTGCTTGAATGCGCCAAC-3´ 5´- GGATAAGCTTTTAGGGGTGTTAGGG 3´ 5´- GCTTACTTTCTAACACTAACGCGC 3´ | |
RCP: Reacción en cadena de la polimerasa.
a Usados con VA1- R.
El método para la tipificación de la secuencia señal vacA y la región media fue ligeramente modificado del descrito por Atherton y col. [16]. Todas las mezclas para la RCP consistieron en 1 µl del ADN, Buffer RCP 1X (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1.5 mM de MgCl 2, 0.2 mM de cada deoxinucleótido (Gibco BRL), 0.5 µM de cada primer específico, y 1.25 U de Taq polimerasa (Gibco BRL) en un volumen final de 25 µL.
Los ciclos de amplificación fueron realizados en un ter-mociclador o sistema de amplificación (Perkin-Elmer, Foster City, CA). Las condiciones para la RCP fueron de 35 ciclos a 94°C por 1 min, 72°C por 1 min, y una extensión final de 72°C por 6 min.
Como control positivo fueron usadas las siguientes cepas especificas, 8822 (vacA s2m2) y 8823 (vacA s1m1) (ATCC 49503), vac A s1a/m1; vac A s2/m2; y 84-183 (ATCC 53726), vac A s1/m1 y como control negativo muestra sin ADN y ADN de genotipos diferentes.
Los productos amplificados de la RCP fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa, 5 µl de cada producto amplificado, fueron añadidos a 1 µl de buffer de muestra (20 ml de glicerol 50%, 25 mg de azul de bromofenol, 3 gotas de 1 N NaOH) realizándose la electroforesis con geles de agarosa preparados al 2%. Los geles fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 µg/ml) y examinados con luz ultravioleta para la detección del ADN amplificado.
]]> ResultadosEl ADN de H. pylori fue detectado en 82/128 (64%) de los pacientes. La frecuencia de los diferentes tipos alélicos de vacA, los resultados demostraron de los 82 pacientes positivos para H. pylori por amplificación de glm, 51 (62%) de las cepas tenían el genotipo vacA, forma alélica s1, el cual fue mucho más frecuente que el s2, que estuvo presente en 21/82(26%) de los sujetos evaluados. Con respecto a las formas alélicas, los alelos tipo s1b fueron los más frecuentemente encontrados 29/51, seguidos de s1a (17/51), los no tipificables (10/21) y más de una forma alélica fue identificada en 5 pacientes, que presentaron conjuntamente s1a+s1b. El análisis de la región media de vacA reveló que 42(51%) fueron vacA m1, 26 (32%) m2 y 14 (17%) no tipificaron para m1 o m2.
En referencia a la frequencia de combinación de los diferentes tipos alélicos de vacA y regiones medias en las biopsias gástricas evaluadas, se pudo observar que la combinación más frecuente fue s1bm1 en 23/82 pacientes (28%), seguido de 19/82 (23%) que no fueron tipificables, 15/82 (18%) s2/m2, 10/82 (12%) s1am1, 6/82 (7%) S1b/m2, 4/82(5%) s1a/m2 y ninguno fué s2/m1. Se observó la infección con más de una cepa de H. pylori, en 4/82 (5%) se detectó s1a+ s1b/m1 y en otro paciente s1a+s1b/m2. (Tabla 2).
Tabla 2. Frecuencia de combinaciones de tipos alélicos de vacA y regiones medias de H pylori en biopsias gástricas de una población venezolana determinados por RCP.
| Genotipo | N= 82 |
| s1a/m1 | 10 (12 %) |
| ]]>
s1a/m2 | 4 (5 %) |
| s1b/m1 | 23 (28 %) |
| s1b/m2 | 6 (7 %) |
| s1a + s1b/m1 | 4 (5 %) |
| s1a + s1b/m2 | 1 (1 %) |
| ]]>
s2/m1 | 0 |
| s2/m2 | 15 (18 %) |
| No tip. | 19 (23 %) |
Discusión
La infección por H. pylori causa una variedad de enfermedades gastroduodenales. El papel que juegan los genotipos vacA y cagA en la patogénesis de la enfermedad gastroduodenal, es un punto ampliamente debatido y muy controversial hasta el presente.
Atherton y col [15], realizan el primer reporte de la existencia de tres familias diferentes de secuencias señales de vacA, (s1a, s1b, s2) y de dos diferentes familias de los alelos de la region media (m1 y m2). Los autores refieren que los genotipos vacA son mosaicos de las secuencias señal y regiones medias y todas las combinaciones posibles de estas regiones, han sido identificadas.
A partir de ese momento, muchas investigaciones han sido realizadas sobre los genotipos de vacA de H. pylori, demostrándose que s1 y m1 están estrechamente asociados con el nivel de actividad de VacA in vitro, así como de sus consecuencias clínicas [16,17,18,19].
]]> Sin embargo, existen resultados contradictorios al respecto, algunas investigaciones señalan que el genotipo vacA no permite predecir la virulencia de la cepa de H. pylori o sus consecuencias clínicas, sugiriendo que la correlación reportada, puede ser debida a la prevalencia de ciertas especies en determinada area geográfica [20], mientras que otros señalan que si existe una asociación [6,11].Aunque vacA está virtualmente presente en todas las cepas de H. pylori, sólo cerca del 50% produce VacA, que al ser purificada, es capaz de inducir necrosis epitelial gástrica y ulceración, cuando se administra por vía oral a ratones. Estudios in vitro han demostrado que VacA causa vacuolización masiva y muerte de un número de líneas celulares humanas. [21].
Nuestros resultados demostraron que las biopsias evaluadas presentaron infección con cepas de múltiples tipos de vacA. Estos datos son similares a los referidos por otros autores en México [22,23] y en países desarrollados [24-29].
La coexistencia de cepas con diferentes genotipos de vacA puede ser explicado de diferentes formas. Una de ellas radicaría en que los genotipos diferentes de vacA, podrían ofrecer ventajas no competitivas a las cepas. La segunda de ellas sería que diferentes genotipos, podrían conferir diferentes ventajas que permitirían que las cepas sobrevivieran en nichos ecológicos diferentes dentro de la mucosa gástrica y la posibilidad de recidivas de la infección, después del tratamiento [22].
El riesgo de coinfección o superinfección con múltiples cepas es más alto en países con alta prevalencia de infección por H. pylori [22], lo que justificaría nuestros hallazgos, ya que en nuestro país existe una alta prevalencia de infección demostrada, por estudios previos [30,31].
En nuestra investigación observamos una alta prevalencia de vacA alelo s1b, seguido de s1a. Estos datos son similares a otros estudios [22,23,32,33]. Sin embargo, en otros reportes se ha señalado predomonio de la forma alélica s1a. Es importante resaltar que estos estudios se han realizado en Europa, Sur África y México.
La distribución geográfica de los distintos genotipos de H. pylori permanence aún sin dilucidar. La prevalencia de genotipos más patogénicos en ciertas áreas, tiene importantes consecuencias epidemiológicas que pueden estar asociadas con la severidad de la infección [33].
Con respecto a la frequencia de combinación de los diferentes tipos alélicos de vacA y regiones medias en las biopsias gástricas, observamos que s1b/m1 representó la forma más frecuente (28%), seguido de las formas no tipificables (23%) , s2/m2 (18%) s1a/m1 (12%), datos estos similares a otros reportes [22, 23].
Estudios previos han sugerido que la actividad citotóxica es más alta en cepas s1a/m1 que en s1a/m2 y prácticamente ausente en s2/m2 [15,16].
Referente a las muestras no tipificables encontradas en esta investigación, podría sugerir la existencia de subfamilias adicionales de las formas alélicas s y m, que no son reconocidas por los iniciadores disponibles en la actualidad.
]]> Los resultados de la presente investigación demostraron una alta frecuencia de infección por H pylori genotipo vacA forma alèlica s1/ m1.Agradecimiento
Instituto Mexicano del Seguro Social.
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