Rodolfo Devera*, Nayellis Jaimes, Andreina Yánez, Iván Amaya, Ytalia Blanco, José Mata, Ixora Requena

Grupo de Parasitosis Intestinales, Departamento de Parasitología y Microbiología, Escuela de Ciencias de la Salud, Universidad de Oriente. Estado Bolívar, Venezuela.

* Correspondencia: E-mail: rodolfodevera@hotmail.com

Resumen: Se realizó un estudio para comparar el rendimiento del cultivo con el examen directo y la sedimentación espontánea en el diagnóstico de Blastocystis sp. Para el cultivo de Blastocystis sp. se utilizó una modificación del medio de Boeck y Drbohlav. Se emplearon 100 muestras fecales procedentes de habitantes de la comunidad indígena Itopoicon, municipio Heres, estado Bolívar. De las 100 muestras cultivadas y sometidas a examen directo y sedimentación espontánea, en 90 se diagnosticó Blastocystis sp. De ellas, 83 resultaron positivas en el cultivo; mientras que 60 fueron positivas en el examen directo y 57 en la sedimentación espontánea. En conclusión, el cultivo presentó un mayor rendimiento (83%) que el examen directo (60%) y la sedimentación espontánea (57%) en el diagnóstico de Blastocystis sp.

Palabras clave: Blastocystis sp., diagnóstico, cultivo.

Use of cultures for the diagnosis of Blastocystis sp.

Abstract: A study for comparing the yield of cultures by direct examination and by spontaneous sedimentation for the diagnosis of Blastocystis sp. was carried out. Blastocystis sp. was cultured in a modification of the Boeck and Drbohlav medium. The material used corresponded to 100 fecal samples from inhabitants of the Itopoicon indigenous community, Heres municipality, Bolivar State. Of the 100 samples cultured and submitted to direct examination and spontaneous sedimentation, 90 gave a diagnosis of Blastocystis sp. Of these 90, 83 were positive in culture, while 60 were positive at direct examination, and 57 in spontaneous sedimentation. In conclusion, culture showed a higher yield (83%), than direct examination (60%) and spontaneous sedimentation (57%), for the diagnosis of Blastocystis sp.

Keywords: Blastocystis sp., diagnosis, culture.

Introducción

Dentro de los protozoarios causantes de parasitosis intestinales, Blastocystis sp. se puede diagnosticar fácilmente con técnicas de laboratorio rutinarias. Sin embargo, para su estudio morfológico, bioquímico y molecular generalmente se requiere cultivar al parásito [1-6]. Blastocystis sp. tiene una amplia variabilidad genética y se intenta relacionar ésta con los aspectos bioquímicos, moleculares y la patogenicidad del microorganismo [6-8].

Por otro lado, para realizar los controles postratamiento se requiere de una técnica diagnóstica específica, donde el cultivo del parásito ha demostrado ser el más efectivo [5]. Actualmente la mayoría de los estudios bioquímicos sobre Blastocystis sp. han sido realizados en células procedentes de cultivos [9]. Todo lo anterior justifica la necesidad de contar con un método de cultivo confiable y estandarizado para el diagnóstico, aislamiento y mantenimiento del parásito. Este cultivo puede ser de tipo xénico o axénico [1,6,10]. El medio de Boeck-Drbohlav o su modificación (llamada LE por Locke-egg) es uno de los más empleados para el cultivo axénico de Blastocystis sp. [11,12]. Inicialmente se usó para el diagnóstico de amibas hasta que Zierdt et al lo utilizaron por primera vez, en 1967, para el diagnóstico y aislamiento de Blastocystis sp., mostrando resultados satisfactorios [3-5,7,10-15 ]. Sin embargo, el cultivo es realizado de forma restringida por algunos investigadores y en determinados centros de investigación, siendo difícil que laboratorios clínicos lo utilicen. Debido a ello se escogió este medio de cultivo para verificar su utilidad en nuestros laboratorios.

En los últimos 10 años se han realizado en Venezuela varios trabajos sobre Blastocystis sp. [16-21]. Sin embargo, en pocos se ha utilizado el cultivo del parásito ya sea para fines diagnósticos, control de tratamiento o para su aislamiento y posteriores estudios bioquímicos o moleculares [4,5,22]. El objetivo de este estudio fue comparar el rendimiento diagnóstico del cultivo de Blastocystis sp. en el medio de Boeck y Drbohlav con las técnicas de examen directo y sedimentación espontánea, de reconocida utilidad para diagnosticar este protozoario.

Materiales y métodos

Se realizó un estudio de tipo transversal que consistió en el uso de las muestras fecales procedentes de habitantes de la comunidad indígena Itopoicon del municipio Heres, ubicada a 7 kilómetros al noroeste de Ciudad Bolívar, vía Ciudad Piar, sector Cardozo, parroquia José Antonio Páez, estado Bolívar.

Universo y muestra: El universo lo conformaron los 584 habitantes de la comunidad indígena Itopoicon y la muestra estuvo constituida por 100 muestras de heces seleccionadas aleatoriamente, obtenidas en un estudio coproparasitológico realizado en julio de 2010 y que fueron sembradas en el medio de Boeck y Drbohlav para realizar las comparaciones con las otras técnicas diagnósticas aplicadas.

Recolección de datos: Los datos de identificación de los habitantes de la comunidad indígena Itopoicon fueron obtenidos directamente mediante interrogatorio empleando una ficha de control. Todos los habitantes que participaron del estudio coproparasitológico dieron su consentimiento por escrito. La investigación se realizó cumpliendo lo establecido en la declaración de Helsinki [23]. Al final del estudio se entregó a cada persona participante los resultados de sus exámenes y tratamiento antiparasitario específico.

Obtención y procesamiento de las muestras fecales: En una primera etapa se realizó la preparación, modificación y estandarización del medio de Boeck y Drbohlav que ha sido empleado previamente en el diagnóstico de protozoarios intestinales [1-6]. En esa primera etapa se emplearon muestras con diagnóstico de Blastocystis sp. como controles positivos y sin la presencia de dichas formas parasitarias como controles negativos. La identificación del microorganismo en esas muestras se realizó mediante examen directo. Una vez estandarizada la preparación del medio y logrado el crecimiento del parasito se realizó el establecimiento en el cultivo, para ello se realizaron repiques o pasajes sucesivos con intervalos de 72 a 96 horas después de la siembra primaria [10].

Preparación del medio de cultivo de Boeck y Drbohlav: Se trata de un medio compuesto por una fase semisólida a base de huevo y otra líquida formada por la solución de Locke. El medio fue preparado según Botero y Restrepo [24] con modificaciones, las cuales después de varios ensayos, permitieron obtener un medio adecuado. Varios autores han realizado diversas modificaciones a este mismo medio como es el empleo de suero, glucosa o adición de algún antibiótico en la solución de Locke [2,5,11,12].

Las modificaciones realizadas en el presente estudio fueron las siguientes:

1. La gelificación del medio se realizó en autoclave y no en baño de María. Se verificó que haciendo esta modificación el medio resultante es más compacto sin presencia de grietas o burbujas, las cuales no son recomendables [10].

2. Uso de antibiótico (gentamicina) en la solución de Locke sobrenadante. Otros autores han empleado otros antibióticos [2]. De esta forma el cultivo elaborado fue de tipo axénico aunque no totalmente. Esa modificación se realizó debido a que la gran proliferación bacteriana estaba interfiriendo con el desarrollo del parásito o dificultaba su observación.

3. Se usó polvo de arroz comercial empleado como alimento infantil como sustituto.

Siembras: Con los medios a temperatura ambiente se procedió a la siembra de las 100 muestras fecales. Se agregó solución de Locke como sobrenadante a la base semisólida hasta cubrir el bisel. Con la ayuda de un aplicador de madera se emulsionó aproximadamente 1 g de muestra fecal y se agregó al medio de cultivo frotando sobre el bisel (en forma de estría, de abajo hacia arriba), sin realizar punción. Luego se le añadió 30 mg de polvo de arroz esterilizado en horno durante 2 1/2 horas a 150 ºC. Se mezcló por inversión. Se llevaron los tubos a una estufa a 37 ºC y se realizaron observaciones a las 24, 48 y 72 horas.

Estudio microscópico: Para la visualización microscópica se tomó, una alícuota de 2 mL del líquido del fondo del bisel y se centrifugó, se desechó el sobrenadante y se utilizó una gota del sedimento resuspendida en solución salina fisiológica y otra en lugol. Se empleó un solo tubo con medio para cada muestra fecal.

Análisis estadístico: Con la información obtenida se construyó una base de datos con ayuda del programa SPSS 8.0 para Windows. Para el análisis comparativo entre las técnicas diagnósticas empleadas se utilizaron frecuencias relativas (%) y el coeficiente Kappa (k) para verificar concordancia de resultados entre las técnicas empleadas para diagnosticar Blastocystis sp. Se consideró una concordancia deficiente cuando el valor calculado es ≤ 0,4; buena cuando el valor calculado estuvo entre >0,4 y ≤0,75 y excelente si era >0,75. Tambien se calculó la Sensibilidad (S), Especificidad (E), Valor Predictivo Positivo (VPP) y Valor Predictivo Negativo (VPN) del cultivo comparado con el examen directo y con la sedimentación espontánea.

De las 100 muestras evaluadas, 90 resultaron positivas para Blastocystis sp. en al menos una de las tres técnicas empleadas; esto representó una prevalencia global de 90%. De estas 90 muestras, 83 resultaron positivas en el cultivo; mientras que 60 fueron positivas en el examen directo y 57 en la sedimentación espontánea. De las 90 muestras positivas, 19 (21,1%) resultaron positivas por una sola técnica (6 por el directo y 13 por cultivo), 31 (34,4%) por dos técnicas (14 casos el directo y el cultivo, 1 caso directo y sedimentación y 16 casos cultivo más sedimentación) y un total de 40 muestras (44,4%) resultaron positivas por las tres técnicas. Cabe resaltar que en 10 muestras no se observaron estadios del parásito para las tres evaluaciones empleadas.

Cuando se realizó este mismo análisis comparando el cultivo con la sedimentación espontánea la situación fue la siguiente (Tabla 2): de las 57 muestras positivas en la sedimentación espontánea, 1 resultó negativa en el cultivo, mientras que de las 43 muestras negativas en la sedimentación espontánea, 27 fueron positivas en el cultivo. En esta comparación los resultados son significativos estadísticamente (c²=21,836, g.l=1, p<0,05) a favor del cultivo, aunque el coeficiente Kappa muestra una concordancia deficiente (<4) entre ambas técnicas. La sensibilidad del cultivo fue buena (98,2%) no así su especificidad que fue de 37,2%. El VPP de la sedimentación espontánea fue elevado, es decir, hay 98,2% de probabilidad que esta prueba resulte positiva si el cultivo resulta también positivo; mientras que apenas hay 37,2% de probabilidad de que la sedimentación resulte negativa siendo el cultivo negativo, es decir, un VPN bajo.

Tabla 2. Relación entre las técnicas de sedimentación espontánea y el cultivo en el diagnóstico de Blastocystis sp. Comunidad indígena Itopoicon, estado Bolívar, julio de 2010.

c² = 21,836      g.l. = 1      p < 0,05

S: Sensibilidad, E: especificidad, VPP: valor predictivo positivo, VPN: valor predictivo negativo, k: coeficiente Kappa de concordancia.

Discusión

Aunque el cultivo puede emplearse para el diagnóstico de varias especies parasitarias, en especial de protozoarios, éste no siempre forma parte de la rutina diagnóstica debido a que hay otras técnicas más sencillas, rápidas y de igual o mayor rendimiento diagnóstico [9,10,25].

En general, en el caso de las protozoosis intestinales, el cultivo suele hacerse no sólo para establecer el diagnóstico, sino con fines didácticos y de investigación [10,25]. En el caso de Blastocystis sp., la técnica de examen directo es la más adecuada para realizar el diagnóstico en las muestras fecales [20,26]. Sin embargo, varios autores han mostrado utilidad del cultivo en el diagnóstico, empleándose incluso para realizar control postratamiento [5,9,12-15, 22].

Para el cultivo de Blastocystis sp. se han empleado varios medios [3,5,9,10,13,14,22,27-37], sin embargo, el de Boeck y Drbohlav o alguna modificación, ha sido el más común. Este es un medio utilizado inicialmente para el diagnóstico de amibas y como en el presente estudio, ha mostrado resultados satisfactorios para el diagnóstico y aislamiento de Blastocystis sp. [3-5,7,10,12.15,24,38]. A nivel local, en nuestros laboratorios, a veces resulta difícil elaborar el medio debido a falta de alguno de los insumos y reactivos o por su elevado costo. Además, una vez elaborado el medio requiere su estandarización para poder ser usado rutinariamente en el laboratorio. En el presente estudio se realizó la modificación y estandarización de algunas condiciones de cultivo, las cuales permitieron que el parásito se reprodujera adecuadamente.

Se determinó una elevada prevalencia de Blastocystis sp. en los 100 habitantes evaluados, lo cual confirma que actualmente es el parásito intestinal más común en el estado Bolívar, Venezuela y en el mundo [6,21,39].

Cuando se compara el cultivo con el examen directo, que es reconocido como el mejor método diagnóstico para este protozoario [20,26], se verificó una buena sensibilidad (88,3%), aunque baja especificidad (25%). El VPP del cultivo no fue muy elevado (63,8%), lo que indica que la probabilidad de que esta técnica resulte positiva estando positivo el examen directo tampoco es muy elevada. Igual ocurre con el resultado del VPN que fue de 58,8% para el cultivo, eso indica que hay 58,8% de probabilidad de que esta técnica resulte negativa siendo el examen directo también negativo. Finalmente, la concordancia entre esas dos técnicas fue deficiente como lo indicó el coeficiente Kappa calculado. Todos esos resultados indican que ambas técnicas ofrecen resultados diferentes siendo mejor el cultivo.

En nuestro estudio se empleó como método de concentración la sedimentación espontánea la cual puede ser comparada en sensibilidad al formol-éter, resultando la de menor rendimiento para el diagnóstico del parásito, coincidiendo con estudios previos [14,20].

Según el resultado del VPP, hay 98,2% de probabilidad que la técnica de sedimentación espontánea resulte positiva si el cultivo resulta también positivo; mientras que apenas hay 37,2% de chance (VPN) de que la sedimentación resulte negativa siendo el cultivo negativo. Además, la concordancia de resultados entre ambas técnicas fue deficiente (k<4). Todo lo anterior sugiere que el cultivo al igual que sucedió al comparar con el examen directo, ofrece mejores resultados que la sedimentación espontánea. En la literatura no existen estudios donde se hayan empleado estos estadísticos para la comparación de técnicas.

Como sucedió en nuestro trabajo, el cultivo puede ser positivo aun en muestras donde las otras técnicas resultan negativas y la positividad no necesariamente depende de la cantidad de formas parasitarias detectadas en las heces del paciente sino tal vez de la viabilidad y otras características biológicas, bioquímicas y/o moleculares del parásito [20]. En siete casos el examen directo resultó positivo y el cultivo negativo; mientras que en otro caso la sedimentación espontánea fue positiva y el cultivo negativo. Esto puede ser explicado porque el parásito no estaba viable o no se adaptó al medio artificial. Es sabido que ciertos clones, aislados o subtipos de Blastocystis son más difíciles de cultivar que otros [2,26,40,41]. Finalmente, a pesar de la elevada sensibilidad que puede tener el cultivo, la ausencia de crecimiento, no descarta la presencia de infección [10].

Por otro lado, el cultivo puede resultar una herramienta útil para realizar los controles postratamiento como han sugerido otros autores [5,15]. Aunque el examen directo es la técnica más idónea para el diagnóstico [20], cuando el paciente recibe tratamiento el número de formas vacuolares tiende a disminuir y a aumentar las formas quísticas, lo que determina que el examen directo vaya perdiendo eficacia y el cultivo tiende a mejorar su rendimiento en los controles de cura posteriores [5].

Otro aspecto a considerar es que con el cultivo se pueden estudiar los aspectos morfológicos y biológicos del parásito [4,5,25,28,31,42]. Varios autores han mostrado que algunas formas del parásito sólo se observan en cultivo o son más comunes en éste, lo que ha ayudado a dilucidar varios aspectos de la morfología y biología de Blastocystis sp. [2,4,12,22,26,31,43]. Aunque no era parte de los objetivos de este estudio, al realizar la observación microscópica se pudo verificar la presencia de abundantes formas granulares que son no comunes en la heces, además en muchos casos se verificaron formas vacuolares en división mostrando una intensa actividad replicativa del parásito en el cultivo. Observaciones similares han realizado otros autores [4,6,22,26].

El cultivo también es el paso inicial para lograr cantidades adecuadas del parásito puro para realizar estudios bioquímicos y moleculares [1,25,33,35,36,42,44-46]. En nuestro estudio se logró mantener a Blastocystis sp. en repiques sucesivos durante tres semanas empleando este medio de cultivo. Aunque no se logró la axenización completa, ésta podría conseguirse y pudiera ser parte de otros estudios futuros. La axenización es necesaria para realizar estudios morfológicos, bioquímicos y moleculares del parásito que, aunque no se realizan en nuestro medio, son fundamentales para establecer la verdadera relevancia clínica del parásito una vez que se ha demostrado actualmente que hay genotipos que son más prevalentes que otros y lo más importante, existe además de diversidad genética, variabilidad en la patogenicidad de los genotipos [8,36,39-41,47,48].

A pesar de lo anterior y considerando la elevada frecuencia de formas vacuolares en las muestras fecales de pacientes con blastocistosis (superior al 90%), por la sencillez del examen directo y su bajo costo, éste debe seguir siendo de elección para el diagnóstico de Blastocystis sp. [2,20,22,26]. La situación cambia cuando el diagnóstico con las otras técnicas sea incierto o se requiera hacer controles de cura o se necesite aislar el parásito para realizar otro tipo de estudio [10]. En esos casos se requiere cultivar al parásito y el medio utilizado parece ser una opción adecuada.

En conclusión, basados en los resultados obtenidos en este trabajo, el cultivo presentó un rendimiento diagnóstico elevado (83%) y pudiera ser una alternativa al examen directo y la sedimentación espontánea que resultaron positivas en el 60% y 57% de los casos respectivamente.

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