Elsa Z. Salazar de Vegasa,*, Helen De La Cruza, Andrea Grisalesa, Diorelis Gonzáleza, Militza Guzmánb, Loreannys Lastrab, Leidy Gámeza, Dulce Trujilloa, Luzmila Albaradoa, Hectorina Rodulfoc, Marcos De Donatoc
a Laboratorio de Bacteriología Clínica. Departamento de Bioanálisis. Núcleo de Sucre. b Laboratorio de Bacteriología Molecular. Departamento de Bioanálisis. Núcleo de Sucre. c Laboratorio de Genética Molecular, Instituto de Biomedicina y Ciencias Aplicadas. Universidad de Oriente. Venezuela.
* Correspondencia: E-mail: elsazul2003@cantv.net
Resumen: Con el objeto de determinar la(s) genoespecie(s) de Acinetobacter, se analizaron 62 aislados preservados, obtenidos de muestras provenientes de pacientes atendidos en el Servicio Autónomo Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” (SAHUAPA), estado Sucre, durante el período junio-diciembre de 2008. Una vez recuperados los aislados, fueron identificados mediante pruebas bioquímicas convencionales, el sistema comercial VITEK® 1 y el método de análisis de restricción del ADNr 16S amplificado (ARDRA). Según las pruebas convencionales, 49 aislados se identificaron como complejo A. calcoaceticus-A. baumannii y 13 como Acinetobacter sp., mientras que por el VITEK® 1, 54 aislados se ubicaron en el complejo A. calcoaceticus - A. baumannii y 8 se identificaron a nivel de género solamente. Mediante el ARDRA se identificó como A. baumannii al 80,7 % de los aislados (50); el 3,2% correspondió a A. genoespecie 16 (2); 1,6% fue identificado como A. pittii (1) y A. nosocomialis (1), respectivamente, y el 12,9% (8 aislados) no pudo ser identificado por observarse patrones de bandas no compatibles con los descritos hasta ahora para esta bacteria. Se concluyó que, además de A. baumannii, se están aislado otras genoespecies de Acinetobacter, como A. pitti, A. nosocomialis y A. genoespecie 16, en los pacientes atendidos en el SAHUAPA.
Palabras clave: ARDRA, A. genoespecie 16, A. pittii, A. nosocomialis, A. baumannii, complejo A. calcoaceticus-A. baumannii.
Species of Acinetobacter identified in the University Hospital “Antonio Patricio de Alcalá”, Cumaná, Venezuela
Abstract: In order to determine the Acinetobacter genospecies, we analyzed 62 preserved isolates, obtained from specimens from patients treated at the “Servicio Autónomo Hospital Antonio Patricio de Alcalá” (SAHUAPA) at the Sucre state, during the period June-December 2008. The isolates were recovered and submitted to identification by the conventional biochemical tests, the commercial VITEK® 1 system and the restriction analysis method of 16S amplified rDNA (ARDRA). According to conventional tests, 49 isolates were identified as A. calcoaceticus-A. baumannii complex and 13 as Acinetobacter sp., Whereas by means of VITEK® 1, 54 isolates were located in the A. calcoaceticus - A. baumannii complex and 8 were identified at the genus level only. By ARDRA, 80.7% (50) isolates were identified as A. baumannii; 3.2% corresponded to A. genospecies 16 (2); 1.6% were identified as A. pittii (1) and A. nosocomialis (1), respectively, and 12.9% (8) isolates could not be identified, due to band patterns produced were not compatible with those described so far for this bacteria. It was concluded that, in addition to A. baumannii, other genoespecies of Acinetobacter, such as A. pitti, A. nosocomialis and A. genospecies16 are being isolated from patients attended in SAHUAPA.
Keywords: ARDRA, A. genospecies 16, A. pittii, A. nosocomialis, A. baumannii, A. calcoaceticus-A. baumannii complex.
Recibido 7 de noviembre de 2016; aceptado 12 de abril de 2017
]]> IntroducciónAcinetobacter baumannii es reconocida como la principal genoespecie del género Acinetobacter, debido a que se ha encontrado con mayor frecuencia en diferentes tipos de infecciones intrahospitalarias; sin embargo, es importante resaltar que genoespecies distintas a A. baumannii también se han aislado de infecciones [1-7]. A. calcoaceticus (genoespecie 1), A. baumannii (genospecie 2), A. pittii (genospecie 3) y A. nosocomialis (genospecie 13TU) son fenotípicamente indistinguibles mediante el uso de los métodos microbiológicos tradicionales y su genoma está estrechamente relacionado; por ello, se ha propuesto identificarlas como complejo A. calcaceticus–A. baumannii [4] o grupo A. baumannii [8], sin embargo, se han observado diferencias clínico-epidemiológicas entre ellas [1,4,5,8,9].
En la búsqueda de técnicas que sean aplicables de manera rutinaria, varios investigadores han utilizado combinación de métodos de identificación, como el análisis de restricción del ADNr 16S ribosomal amplificado (ARDRA) y/o la novedosa tecnología que utiliza la espectrofotometría de masa (MALDI-TOF MS), entre otros, para distinguir entre las especies de Acinetobacter [2,10-12]. Estos métodos, han permitido en los últimos años, grandes avances en la diferenciación de algunas especies bacterianas y, particularmente, de las especies incluidas en el complejo A. calcaceticus–A. baumannii. En el presente artículo se muestra la experiencia obtenida en cuanto a la identificación de genoespecies de Acinetobacter, aisladas de pacientes atendidos en el Servicio Autónomo Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” (SAHUAPA), Cumaná, estado Sucre, Venezuela.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas: Se incluyeron 62 aislados identificados inicialmente como Acinetobacter sp., aislados de pacientes hospitalizados y ambulatorios, con diagnóstico de infecciones, atendidos en el Servicio Autónomo Hospital “Antonio Patricio de Alcalá”, recolectados durante el periodo comprendido entre junio y diciembre del 2008. Los mismos se mantuvieron preservados a -20 ºC en caldo infusión cerebro corazón con 50% de glicerol, en el Laboratorio de Bacteriología Clínica del Departamento de Bioanálisis, Núcleo de Sucre, Universidad de Oriente, así como también se encontraban archivadas las encuestas clínico-epidemiológicas de cada paciente. El trabajo se realizó respetando las normas de bioética para trabajos de investigación en seres humanos [13].
Identificación de género y genoespecie: Se examinó la viabilidad y pureza de los aislados conservados cultivándolos en caldo infusión cerebro corazón y, posteriormente, en agar MacConkey. Los medios de cultivo fueron incubados durante toda la noche a 35 ºC y luego se observó el crecimiento bacteriano. Con la finalidad de verificar que los cultivos correspondían a Acinetobacter sp., las colonias con características de no fermentadoras se identificaron a nivel de género mediante el método bioquímico convencional, según lo descrito por Koneman y col. [14] y Castillo [15]. Para complementar la identificación a nivel de género y determinar la genoespecie, se utilizó la tarjeta de identificación de gramnegativos (GN) VITEK®1, siguiendo las instrucciones del fabricante, y ARDRA [4], respectivamente.
La extracción del ADN total se realizó empleando el estuche Genomic Wizard (Promega), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Para la amplificación del gen ADNr 16S se empleó el siguiente par de oligonucleótidos: 8F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) y 1510R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’), (Roche, Mannheim, Germany), que permiten amplificar un producto de 1.500 pb (número de acceso en el GenBank: KU5451146.1). La amplificación se realizó empleando la Master Mix 2X (Promega); los oligonucleótidos a una concentración final de 1,0 μLmol.L-1; 2U/ μL de Taq ADN polimerasa (Roche) y agua hasta completar un volumen total de reacción de 25 μL. Las condiciones de la amplificación fueron las siguientes: una desnaturalización inicial a 94 °C por cinco minutos, seguido por 35 ciclos, cada uno con una desnaturalización de 94 °C durante un minuto, 45 °C por un minuto, 72 °C por dos minutos y medio, con una extensión final de 72 °C por 10 minutos.
Para visualizar los productos de la amplificación, se realizó una corrida electroforética en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio (0,5 g/mL) en buffer TBE 1X, durante 30 min, a 70 V. Para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN resultantes, se utilizó una escalera de peso molecular con bandas de concentración definidas (1 kb Plus DNA Ladders. Invitrogen, CA, USA). La banda resultante, de 1.500 pb, aproximadamente, fue detectada por transiluminación con luz ultravioleta (UVP, INC) y documentada fotográficamente (Polaroid Instantánea DS 34).
El amplicón de 1.500 pb fue digerido con las enzimas AluI (Roche, Mannheim, Germany), CfoI, MboI, MspI y RsaI (Promega, Madison, USA), siguiendo las instrucciones de la casa comercial. Los fragmentos digeridos se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 3% en buffer TBE 1X a 70 V, durante 3,5 horas, aproximadamente; luego, el gel de agarosa se tiñó con una solución de bromuro de etidio (0,5 g.mL-1). Los patrones resultantes fueron detectados de igual manera por transiluminación con luz ultravioleta (UVP, INC) y documentados fotográficamente (Polariod Instantánea DS 34).
Análisis de los patrones de digestión: El tamaño de los fragmentos de restricción obtenidos se determinó por comparación con la escalera de peso molecular de 1 kb. La presencia o ausencia de bandas fue determinada por inspección visual de los patrones por cuatro observadores diferentes, sin conocimiento de los datos epidemiológicos. Los patrones se consideraron iguales sobre las bases de similitud en cuanto al número y posición de todas las bandas. Pequeñas diferencias en la intensidad y forma de las bandas mayores o pérdida de bandas débiles fueron ignoradas. La identificación de las especies de cada cepa de Acinetobacter se logró mediante la comparación con los esquemas de ARDRA establecidos para esta bacteria, según Dijkshoorn et al. [2], Nemec et al. [10,12]. La combinación de patrones de digestión que se obtuvieron, finalmente, permitió la diferenciación entre las especies.
]]> Análisis de los resultados: El análisis de los resultados se realizó empleando porcentajes de frecuencia; para ello, se elaboran tablas y figuras de los datos obtenidos mediante el programa estadístico SPSS versión 11.5.Resultados y discusión
Del total de aislados evaluados, se identificaron 13 como Acinetobacter sp. y 49 pertenecieron al complejo A. calcoaceticus-A. baumannii, mediante las pruebas bioquímicas convencionales. El sistema automatizado VITEK® 1 indicó que 8 de los aislados correspondieron a Acinetobacter sp. Y 54 al complejo A. calcoaceticus-A. baumannii.
La prueba más especifica que permitió ubicar a los aislados en el complejo A. calcoaceticus-A. baumannii fue el crecimiento a 44 °C; esto demuestra que A. baumannii no es la única especie capaz de crecer a 44 °C y, de acuerdo a los resultados aquí obtenidos, las discrepancias observadas en cuanto al número de aislados identificados como complejo A. calcoaceticus-A. baumannii deja claro que estos métodos no son suficientes para la discriminación de las especies de Acinetobacter. La literatura refiere que la única especie del género capaz de crecer a esta temperatura es A. baumannii, sin embargo, algunos investigadores afirman que otras especies pueden hacerlo a esta temperatura [4,10], entre ellas se encuentran las que forman el complejo A. calcoaceticus-A. baumannii (A. calcoaceticus, A. baumannii, A. nosocomialis y A. pittii); cabe resaltar que A. nosocomialis era designada anteriormente como Acinetobacter genoespecie 13TU y A. pittii como Acinetobacter genoespecie 3 [16,17].
En la figura 1 se muestran los patrones de restricción especie específicos obtenidos por ARDRA para identificar la especie de Acinetobacter, observándose el producto de amplificación de 1.500 pb del gen del ADNr 16S de este género (Figura 1A), y los diferentes patrones característicos de cada una de las especies identificadas en esta investigación (Figura 1 B, C, D y E), presentando entre 3 y 6 bandas, que varían entre 100 y 850 pb. Se logró identificar en el SAHUAPA 50 (80,7%) aislados como A. baumannii; 2 (3,2%) fueron identificadas como Acinetobacter genoespecie 16; 1 (1,6%) como A. pittii; 1 (1,6%) como A. nosocomialis y 8 (12,9%) aislados de Acinetobacter sp. presentaron patrones de bandas no compatibles con los descritos actualmente para esta bacteria. Estos hallazgos sugieren que, para la identificación de especies dentro del género Acinetobacter, no solo se deberán utilizar métodos convencionales y/o automatizados como el VITEK® 1, debido a que en ocasiones arrojan resultados erróneos, por lo que es importante seguir avanzando en el diseño de metodologías como la de ARDRA, para la identificación correcta del género y especies más representativas de las bacterias no fermentadoras causantes de infecciones asociadas a cuidados en salud.
Al respecto, Salazar et al. [5] reportaron el aislamiento de A. baumannii en la UCI-Adulto del Instituto Autónomo Hospital Universitario de Los Andes, Mérida, mediante ARDRA; también identificaron aislados que pertenecían a especies distinta de A. baumannii, como es el caso de A. nosocomialis. Cabe destacar que A. baumannii sigue siendo la especie más comúnmente aislada de muestras clínicas humanas, e implicada en la colonización e infección de pacientes, principalmente hospitalizados [18-21]. Arnold realizó un estudio acerca de la infección por Acinetobacter sp. en el Hospital Universitario Clínico Quirúrgico Comandante Faustino Pérez Hernández, del municipio de Matanzas, Cuba, entre los meses de octubre de 2011 y julio de 2012, donde concluyó que A. baumanii es la principal especie que se aísla hasta en 92% de las bacteriemias intrahospitalarias [22].
Es importante resaltar que especies distintas de A. baumannii también pueden encontrarse participando en infecciones intrahospitalarias, entre los que cabe mencionar A. pittii y A. nosocomialis, así como, Acinetobacter cepa RUH 1139 y A. septicus [3,4,6,23]. Igualmente, Arnold [22] reportó en su estudio, además de A. baumannii, a las especies A. haemolyticus y A. lwoffi, siendo ésta ultima la de menor porcentaje de aislamiento. Estudios realizados en el Reino Unido y en los Estados Unidos, reportaron a la especie A. baumannii como la más prevalente (78 y 63% respectivamente) y en menor proporción A. nosocomialis (0,3 y 21%, respectivamente) y A. pittii (1,7 y 8%, respectivamente) [17,24]. Sin embargo, estos resultados difieren con el estudio realizado por Karah et al. [23], en Noruega, sobre aislados a partir de hemocultivos, donde A. nosocomialis fue la especie de Acinetobacter más prevalerte (46,9%), seguida de A. pittii (19,5%) y A .baumannii (8,8%).
Según los resultados de este estudio se obtuvieron 3 patrones de bandas por ARDRA diferentes de la especie A. baumannii, lo cual muestra la variabilidad genética presente en dicha especie (Tabla 1). También se pudo observar que el mayor porcentaje de aislamiento de A. baumannii correspondió al patrón 11123 (con 28 aislados), seguido del patrón 1121+3 (ver tabla 1) (con 12 aislados) y el patrón 11121 (con 10 aislados). El mayor número de aislados correspondiente al patrón 11123 se obtuvo del servicio de medicina interna (8), ubicándose los demás aislados de dicho patrón en menor porcentaje, en otros servicios médicos como retén, Unidad de Cuidados Intensivos (UCI) tanto pediátrica como de adulto, traumatología e incluso en aislados obtenidos de pacientes ambulatorios. Los otros dos patrones obtenidos se aislaron de forma dispersa (o aleatoria) en varios servicios. En cuanto a las demás genoespecies, no se halló diferencia en los patrones de banda obtenidos.
Con respecto a los aislados que presentaron patrones de bandas distintos a los publicados actualmente para las especies de Acinetobacter descritas (Datos no mostrados), cabe destacar que dichos resultados fueron reproducibles cuando se repitieron los experimentos; pudiera tratarse de patrones distintos que no han sido considerados, por lo que, sería necesario aplicar otro método de identificación que aporte mayor información sobre la identificación bacteriana; al respecto, algunos investigadores, en casos como este, han recurrido a la secuenciación del ADNr 16S [2,10,11].
La tabla 2 muestra la distribución de los microorganismos aislados según la procedencia del paciente. En el caso de los pacientes hospitalizados se obtuvieron 45 (72,6) aislados pertenecientes a la especie A. baumannii, 1 (1,6%) A. nosocomialis, 1 (1,6%) A. pittii, 2 (3,2%) A. genoespecie 16, y 8 (12,9%) cepas de Acinetobacter sp. que presentaron patrones de bandas no compatibles con los descritos actualmente para esta bacteria. En los pacientes ambulatorios se obtuvieron 5 (8,1%) aislados de A. baumannii.
Estos resultados demuestran que el mayor porcentaje de aislamiento se encontró en pacientes hospitalizados, principalmente, en servicios médicos donde estos suelen atenderse en estado crítico y/o inmunocomprometidos que ameritan larga estancia. Estudios realizados han revelado que la prevalencia de Acinetobacter sp. en medios hospitalarios va a depender, principalmente, de los factores predisponentes inherentes al hospedero y de los factores de virulencia de la bacteria, así como su capacidad de supervivencia y multirresistencia [1,25]. Al respecto, Rodríguez y col. afirmaron que las infecciones por A. baumannii son endémicas en las UCI en muchos centros asistenciales de la Argentina [26].
En cuanto al área de servicio médico de donde se aislaron las especies de Acinetobacter, el tiempo de hospitalización de los pacientes fue de 6 ± 4 días. Se encontró que el mayor porcentaje de aislamientos provenía de pacientes atendidos en el Servicio de Medicina Interna (36,8%), seguido por los de retén (24,6%), UCI (22,8%) y en un menor porcentaje se ubicaron los aislados provenientes de los pacientes de traumatología (7,0%), pediatría (7,0%) y sala posparto (1,8%).
Son escasos los estudios publicados a nivel nacional sobre la identificación precisa a nivel de especie de Acinetobacter [4,5,27], resaltando que la presente investigación es la primera en realizarse en la localidad, aplicando la técnica ARDRA como método genético, para la identificación de las especies de Acinetobacter. Por lo antes expuesto, se recomienda profundizar en este tipo de estudio, para ampliar el conocimiento sobres las distintas especies que pudieran estar circulando en las diferentes áreas de los centros hospitalarios, agravando la salud de los pacientes, lo que permitiría diseñar mejores estrategias terapéuticas y controlar la prevalencia de estas bacterias.
Conclusión
Especies distintas a A. baumannii se identificaron como agentes causales de infecciones en pacientes atendidos, principalmente, en los servicios de medicina interna, UCI y retén del SAHUAPA; de allí la importancia de los resultados aquí obtenidos, lo que demuestra que las infecciones producidas por este género sigue en aumento, con el añadido de nuevas especies involucradas tales como A. pitti, A. nosocomialis y A. genoespecie 16.
Agradecimientos
]]> A las empresas privadas Aluminios PIPO, C.A., Toyota Prosperi y Centro de Especialidades, Carúpano, a través de la Corporación Parque Tecnológico de Oriente. A la UDO, que con sus aportes hizo posible el desarrollo de esta investigación, la cual forma parte del proyecto LOCTI (Ley Orgánica de Ciencia, Tecnología e Innovación) intitulado: “Epidemiología de cepas bacterianas, aisladas de pacientes hospitalizados y ambulatorios que acuden al hospital “Antonio Patricio de Alcalá”. Cumaná, estado Sucre.Referencias
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