Jesús Ramos G.¹ Darvys Veliz E.² Adolfo Bremo² José Irausquín²

¹ Facultad de Ciencias Veteriaria, Caracas, Venezuela, Universidad Central de Venezuela.

² Escuela de Ciencias Veterinarias. Universidad Experimental Francisco de Miranda. Caracas, Venezuela, Correspondencia: jesus_g_ramos@hotmail.com

RESUMEN

Los accidentes ofídicos representan un problema de salud pública que afecta más de 5000 personas anualmente en Venezuela. La composición química de los venenos de serpientes es muy compleja, aún cuando sean de la misma especie, entonces es importante conocer su bioquímica y farmacología para comprender su acción tóxica sobre los tejidos y por lo tanto la fisiopatología del emponzoñamiento. En este estudio se evalúa la toxicidad In Vivo e In Vitro del veneno de la serpiente Porthidium lansbergii rozei; el mismo se realizó en dos fases de laboratorio (In Vitro e In Vivo), con veneno extraído manualmente de una serpiente y administrado a 18 ratones albinos (Mus musculus) de la cepa BALB/C. Se hizo la caracterización del veneno determinándole peso específico, concentración de proteínas, actividad de la fosfolipasa A2, actividad proteolítica, acción de miotoxinas y actividades necrótica y hemorrágica. In Vitro se determinó que el veneno posee 18% de proteínas totales, peso específico de 1,416mg/ ml, actividad fosfolipásica dosis dependiente (a mayor sustrato mayor actividad) y 3,4% de proteólisis. In Vivo se comprobó que el veneno es principalmente miotóxico y hemorrágico elevando los valores promedios de CK de 9071,33±12,50UI/l a 9128,33 ± 21,59UI/l y creando un área hemorrágica promedio de 32,5±0,7071mm2 con una actividad necrótica promedio de 6±1,41mm2. El veneno de Porthidium lansbergii rozei tiene un efecto hemorrágico y miotóxico menor con relación a otras especies Viperidas, que podría deberse a una alta actividad fosfolipásica y moderada actividad proteolítica.

PALABRAS CLAVE: Porthidium lansbergii rozei, veneno, toxicidad.

EFFECT OF THE TOXICITY IN VIVO AND IN VITRO OF THE POISON OF PORTHIDIUM LANSBERGII ROZEI.

ABSTRACT

The ophidian accidents represent a problem of public health that it affects more than 5000 persons anually in Venezuela. The chemical composition of the poisons of serpents is very complex, even when they are of the same species, therefore it is important to know his biochemistry and pharmacology in order to understand his toxic action on the fabrics and therefore the pathophysiology of the poisoning. In this study In Vivo evaluates the toxicity and In vitro of the poison of the serpent Porthidium lansbergii rozei; the same was conducted in two phases of laboratory (In vitro and In Vivo), with poison extracted manually from a serpent and administered to 18 albino mice (Mus musculus) of the vine-stock BALB/C. The characterization of the poison became determining specific weight, concentration of proteins, Activity of the phospholipase A2, activity proteolytics, action of myotoxins and activities necrotic and hemorrhagic. In vitro one determined that the poison possesses 18% of total proteins, specific weight of 1,416mg/ml, activity phospholipasic dependent dose (to major major substratum activity) and 3,4% of proteolysis. In Vivo it was verified that the poison is principally myotoxic and hemorrhagic raising CK's average values of 9071,33±12,50UI/l to 9128,33 ± 21,59UI/l and creating a hemorrhagic average area of 32,5±0,7071mm2 with an activity necrotic average of 6±1,41mm2. The poison of Porthidium lansbergii rozei has a hemorrhagic effect and myotoxic minor with relation to other species Viperids, that could be cause of a high phosfolipasic activity and a moderate protelitical action.

INTRODUCCIÓN

El emponzoñamiento ofídico es un evento común en países tropicales y subtropicales, representa un problema de salud pública que puede tener un desenlace fatal y su probabilidad de ocurrencia se maximiza con las actividades humanas al aire libre ^1,2,3; en Venezuela se registró un promedio de 5777 anual de estos emponzoñamientos entre 1999 y 2001, que produjeron un promedio de 38 muertes por año^4,5. En los emponzoñamiento ofídico, hay una gran diversidad de síntomas clínicos, aun cuando sean ocasionados por serpientes de una misma especie y que habitan en zonas distintas; esta variabilidad se atribuye a la composición del veneno, el cual varía en serpientes de distintas regiones bien por efectos ambientales o por ser subespecies que expresen genéticamente toxinas diferentes; ésto ocasiona que se empleen sueros antiofídicos producidos con venenos distintos, aun cuando sean a partir de serpientes de la misma especie, así la neutralización de los efectos del emponzoñamiento es variable^6,7,8,9,10, ya que el único tratamiento específico consiste en la administración parenteral de un suero antiofídico.^10,11,12

La composición de los venenos de serpientes es compleja. A las variaciones poblacionales se les unen la ontogenética en la bioquímica y la farmacología del veneno de cada especie^7,9,13,14,15. El aislamiento y caracterización de los componentes activos presentes en los venenos de las serpientes venezolanas no han sido suficientemente estudiado, por el amplio espectro geográfico y las escasas investigaciones en el área.

Existen variaciones regionales en la composición y en la actividad de los principios activos de los venenos, los cuales deben ser evaluados como parte del diseño e implementación de medidas preventivas y terapéuticas incluyendo la preparación de antivenenos ^7,8,12,15.

La presente investigación caracteriza la toxicidad In Vivo e In Vitro del veneno de Porthidium lansbergii rozei del estado Falcón, obteniendo información sobre la composición química, mecanismos de acción molecular de las enzimas que lo constituyen y las acciones tóxicas sobre los tejidos, que permiten una mejor comprensión de la fisiopatología del emponzoñamiento ofídico de esta especie y sentar las bases para información epidemiológica certera sobre ofidismo.

La serpiente Porthidium lansbergii rozei pertenece a la familia Viperidae, subfamilia Crotalinae, género Porthidium, especie Porthidium lansbergii, subespecie Porthidium lansbergii rozei. ^16,17 Las serpientes de la familia Viperidae, poseen huesos faciales movibles; los prefrontales no contactan los nasales, los supratemporales están fijos al cráneo, ectoterygoid eréctil perpendicularmente sobre el cual reposan dos colmillos con cánula de veneno, la mandíbula no posee el hueso coronoide, todos los géneros de esta familia son venenosos a excepción del Atractaspis. La subfamilia Crotalinae tiene nueve escamas simétricamente dispuestas en la parte superior, los huesos internasal, y prefrontal pueden estar divididos.18 Existen seis especies del género Porthidium y están localizadas desde México hasta Ecuador.¹⁹ En Venezuela la especie Porthidium Lansbergii, se ubica en la zona norte-costera, desde el estado Zulia hasta los estados Sucre y Nueva Esparta.²⁰ Estas serpientes tienen cabeza triangular con un hocico levantado y punteado, ojos color pardo amarillento, pupilas verticales, cuerpo grueso y cola corta semiprensil y puntiaguda, tienen una longitud promedio de 90cm, coloración parda amarillenta, con una banda oscura casi imperceptible detrás de los ojos y una sucesión de 20 a 23 manchas cuadradas en el dorso, la cola es rojiza con manchas blancas y amarillentas por lo que se les llama comúnmente "rabo frito"; la escama rostral es dos veces más alta que ancha, la nasal dividida, un par de internasales, 3 preoculares, 3 postoculares, 8 supralabiales, 10 infralabiales y 3 pares de geniales. Poseen 25-23-19 hileras de escamas dorsales con reducción, 142-144 ventrales, y 27-32 subcaudales.^20,21  

Los signos clínicos más frecuentes de emponzoñamientos por serpientes de la familia Viperidae son: hemorragia local y sistémica ocasionada por enzimas; la hemorragia contribuye a una lesión permanente en el tejido muscular y lleva a hipovolemia, la cual conduce a choque cardiogénico 6,22; estas lesiones están mediadas por un grupo de enzimas denominadas metalproteasas,23,24 y aunque el mecanismo de acción de estas toxinas no está totalmente dilucidado, se supone que dichas enzimas, que son metaloproteinasas dependientes de zinc, hidrolizan algunas proteínas que componen la lámina basal y rodean las células endoteliales de los vasos capilares y de las vénulas.

Como consecuencia de esta hidrólisis, las células endoteliales se ven afectadas, desarrollando una serie de vesículas y reduciendo su grosor, hasta el punto en que se producen rupturas a través de las que se origina la extravasación.23 El veneno de las serpientes de la familia Viperidae, debido a su alto contenido de fosfolipasa A2 (FLA2), genera hemólisis por daño de los glóbulos rojos y miólisis directa e indirecta en los miocitos por degeneración de la membrana celular o la producción de lisofosfatidos.13,24,25

MATERIALES Y MÉTODOS

La investigación se realizó en dos fases una de campo y otra de laboratorio.

Fase de Campo: La muestra de veneno de Porthidium lansbergii rozei se obtuvo de una serpiente previamente sedada con gas carbónico, mediante extracción manual comprimiendo las glándulas venífelas sobre un tubo de eppendorf. Se emplearon 18 ratones albinos (Mus musculus) de la cepa BALB/C con un peso medio de 20g que se mantuvieron bajo cuidado durante tres semanas, tiempo de realización de la fase de laboratorio.

La Fase de Laboratorio se realizó In Vitro e In Vivo

Fase In Vitro: Se determinó el peso específico del veneno. Se evaluaron las proteínas totales utilizando el método de Biuret. Para conocer la actividad de la FLA2, se utilizó el método de titulación propuesto por Yang y King ²⁷ y La actividad proteolítica fue medida usando una concentración conocida de gelatina común a la cual se le agregaron 20μg de veneno, se incubó a 37ºC durante un período de 20 minutos y se midió la cantidad de proteínas totales degradadas a través del método de Biuret.

Para La fase In Vivo los ratones en estudio se clasificaron en seis grupos de tres ratones cada uno, tres de los cuales fueron manejados como grupos control, para determinar las acciones miotóxica, hemorrágica y necrótica.

Para comprobar la acción miotóxica los ratones de un grupo fueron inoculados con 50μg de veneno diluidos en 100 μl de solución salina isotónica. Después de 6 horas, a ambos grupos (control e inoculados) se les recolectó una muestra de sangre, por punción cardiaca, para medir la actividad de Creatina Kinasa (CK) mediante la aplicación del kit de CK de Pointe Scientific, la actividad se expresa en IU/L que es la cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 mmol de substrato por minuto. Las acciones hemorrágica y necrotizante se determinaron por los métodos cuantitativos elaborado por Kondo y colaboradores. ²⁸

Los métodos estadísticos utilizados son indicadores de estadística descriptiva (medidas de tendencia central y dispersión), los resultados se expresan en promedios ± desviación estándar; también se utilizaron métodos de inferencia estadística (pruebas de hipótesis) al realizar pruebas t-student para comparar los datos con un nivel de significación p>0,05 (no significativo), p<0,05 (significativo) y p<0,01 (altamente significativo).29

RESULTADOS

El peso especifico promedio del veneno resulto ser de 1,416 ± 0,042mg/μl. El mismo presentó una actividad miotóxica al elevar los niveles de CK sérica que en los ratones control fue 9071,33 ± 12,50UI/l y en los experimentales, inoculados con 50μg de veneno, fue 9128,33 ± 21,59UI/l. Los ratones inoculados con 10μg de veneno subcutáneo presentaron hemorragias leves adyacentes al punto de inoculación mostrando un área hemorrágica promedio de 32,5 ± 0,7071mm2. El veneno demostró tener una actividad necrosante muy reducida, ya que dos de los tres ratones inoculados con 50μg de veneno presentaron una zona necrótica propiamente dicha de 6 ± 1,41mm2 promedio. El veneno presenta un 18% de proteínas totales. De acuerdo a su peso específico, las proteínas son el componente mayoritario del total de sólidos suspendidos.

DISCUSIÓN

Los venenos de la familia Viperidae contienen alrededor de 25% de sólidos totales, suelen tener coloración de tonalidad amarillenta a blanquecina y su viscosidad va a depender del contenido proteico (mayor viscosidad mayor contenido proteico)30, lo cual explicaría el bajo contenido proteico del veneno en estudio (180mg/ ml), ya que su aspecto era de color ámbar pálido, translucido y con baja viscosidad. La concentración de proteínas totales del veneno es 18%, (Gráfico 1) valor inferior a los referenciales de los géneros Bothrops y Crotalus los cuales van desde 25% al 70%.6,8,13,23,31 La actividad de la fosfolipasa A2 que se obtuvo en el estudio indica que ésta es dosis dependiente, (Tabla 1) el veneno puede provocar ruptura, en grados variables, de las membranas celulares, con la consecuentes citólisis y patologías derivadas. El valor obtenido a la concentración media de lecitina empleada (2%); resultados que se corresponden a lo señalado por López,32 quien refiere que el veneno de la Porthidium lansbergii promueve la agregación plaquetaria, lo cual pudiera ser consecuencia de la liberación de ácido araquidónico que posteriormente es catalizado por las enzimas ciclooxigenasa y transformado en autacoides, entre los cuales se encontrarían los tromboxanos A2.

La actividad proteolítica, medida en porcentaje de proteolisis, en el presente estudio fue 3,4%, (Tabla 2) que puede estar relacionada con el peso especifico determinado 1,416mg/μl donde existe alta relación de especies químicas presentes respecto al volumen del veneno y con la actividad fosfolipásica encontrada, indicadora de sinergismo con la actividad proteolítica. Puede que también exista una gama de compuestos proteicos como las metalproteasas características del veneno del genero Bothrops ³³.

Los ratones inoculados mostraron un área hemorrágica promedio de 32,5± 0,7071mm2, (Tabla 3) significativamente inferiores (p<0,05) a los resultados descritos por Otero y colaboradores34 quienes señalan que 0,96μg de veneno de Porthidium nasutum son suficientes para originar un área hemorrágica de 10mm²

Los fenómenos necróticos que tienen los venenos de las serpientes de la familia Viperidae se deben no sólo a la acción de componentes citotóxicos (metalproteasas y Fosfolipasa A2, entre otros), sino también a los fenómenos isquémicos ocasionados inicialmente como consecuencia de las hemorragias ^24,35. El área necrótica observada en los ratones inoculados fue 6 ± 1,41mm2, cifra significativamente inferior (p<0,05) a las reportadas por De Roodt y colaboradores36 quien indican que 59μg de veneno de Bothrops asper genera un área necrótica promedio de 19,68mm2.

Las miotoxinas afectan directamente la integridad de la membrana plasmática de las células musculares, originando un influjo de calcio hacia el citosol, lo cual pone en marcha una serie de eventos degenerativos que culminan con lesión celular irreversible.33 Aunque el sitio de unión de estas miotoxinas a la membrana plasmática de los miocitos no se ha establecido claramente, se plantea la existencia de dos tipos de sitios de unión: (a) fosfolípidos negativos, presentes en las membranas de muchos tipos celulares, lo cual explica la amplia acción citolítica de estas proteínas In Vitro y (b) receptores proteicos, presentes en los miocitos, lo cual hace a estas células más susceptibles a la acción de las miotoxinas. El veneno presenta actividad miotóxica al elevar los niveles de CK sérica en los ratones inoculados que concuerda con las conclusiones de Otero y colaboradores34 para el mismo género Porthidium, y con el hecho de que el veneno de las serpientes de la familia Viperidae tenga comúnmente alto nivel miotóxico33.

CONCLUSIÓN

El veneno de la serpiente Porthidium lansbergii rozei que habita en el estado Falcón, posee un alto nivel de miotoxicidad y una actividad hemorrágica moderada en comparación con serpientes del género Porthidium; estos resultados aportan datos de interés para investigaciones futuras sobre este veneno que permitan desarrollar estrategias terapéuticas eficientes y efectivas.

Tabla Nº 2

Actividad Proteolitica del veneno de Porthidium lansbergii rozei

Concentración Inicial (%) Concentración  a 20 min. (%) Absorbancia   Absorbancia

Inicial (%)                     a 20 min. (%)                                                     inicial         a 20 min.

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Recibido: Julio, 2009 Aprobado: Diciembre, 2009