Carmen Duran1, Dubrasvka Rodríguez-Bolívar2, Antonio Roschman-Gonzalez3, Mirian Strauss4 & Felix Tejero2
1 Escuela de Medicina "Luis Razetti". Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas. Venezuela
2 Instituto de Zoología y Ecología Tropical, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas. Venezuela
3 Centro de Microscopía Electrónica. Escuela de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad Central de Venezuela. Caracas. Venezuela
4 Instituto de Medicina Tropical, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Caracas. Venezuela
*Autor de correspondencia: felixtejero@gmail.com
Las relaciones que se establecen entre géneros de la familia Trypanosomatidae en condiciones de coexistencia en el mismo medioambiente pueden estar vinculadas a respuestas compensatorias inter-poblacionales que incluyen cambios morfológicos (diferentes estadios) y morfométricos (diferencias mensurables). El análisis cuantitativo de tales respuestas en cultivos axénicos puros de Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi, así como en isomezclas axénicas de L. chagasi-T. cruzi mantenidas in vitro, no ha sido abordado, desconociéndose por lo tanto, particularidades biológicas. Muestras interdiarias de cultivo se fijaron, colorearon, observaron, digitalizaron y procesaron cuantitativamente. Además de cuantificar las densidades poblacionales, se registraron las magnitudes numéricas de variables morfométricas que, posteriormente, se analizaron con herramientas estadísticas. Los resultados indicaron cambios específicos en las variables investigadas, así como heterogeneidad morfométrica entre los mismos morfotipos de los mismos géneros al ser mantenidos en cultivos puros o mixtos. Los modelos de cambio morfométrico de L. chagasi y T. cruzi en cultivos puros difieren de los modelos de cambio morfométrico en los cultivos mixtos (L. chagasi-T. cruzi). Las metodologías biométricas discriminan, en términos morfométricos, poblaciones del mismo estadio (morfotipo) en ambientes diferentes.
Palabras clave: Leishmania chagasi, Trypanosoma cruzi, morfometría, in vitro.
Quantitative approach to the analysis of the growth and morphometric change in populations of Leishmania chagasi and Trypanosoma cruzi maintained in pure and mixed axenic cultures
]]> SUMMARYThe relations established among genera of the Trypanosomatidae family in coexisting conditions in the same environment may be linked to inter-population compensatory answers that include morphological (differences among stages) and morphometrical (measurable difference) changes. The quantitative analysis of these answers in Leishmania chagasi and Trypanosoma cruzi pure axenic cultures, as well as in L. chagasi - T. cruzi axenic iso-mixtures in vitro maintained has not been approached, and consequently, potentially useful biological particularities in the control of these important human parasites are unknown. Every other day culture samples were fixed, stained, observed, digitalized and quantitatively processed. In addition to quantify, the population densities and the appearance-disappearance stage (morphotypes) dynamics, the numeric magnitudes of the morphometric variables were recorded and later analyzed with multivariate statistical techniques. The results indicate specific changes in the investigated variables, as well as morphometric heterogeneity between the same morphotypes of the same genera when maintained in pure or mixed cultivation. The morphometric change models for L. chagasi and T. cruzi in pure culture differ from the models of morphometric change in mixed cultivation (L. chagasi-T. cruzi). The biometric methodologies discriminate in morphometric terms populations of the same stage (morfotype) in different environments.
Key words: Leishmania chagasi, Trypanosoma cruzi, morphometry.
Recibido el 25/01/2010 Aceptado el 23/06/2010
INTRODUCCIÓN
Leishmania chagasi y Trypanosoma cruzi son los agentes etiológicos de importantes y heterogéneas patologías humanas (WHO, 1990; WHO, 1991) que, además, pueden establecer infecciones simultáneas en mamíferos (incluyendo humanos) de la misma área geográfica (Travi et al., 1994; Corredor-Arjona et al., 1999; Bastrenta et al., 2003; Mendes et al., 2007).
La diversidad de la severidad de la Enfermedad de Chagas y otras infecciones por tripanosomas, entre otras cualidades, ha sido atribuida al pleomorfismo (Andrade, 1985; Brener, 1985; Guzmán-Marín et al., 1999; Ziccardi & Lourenço-de-Oliveira, 1999; Karbowiak & Wita, 2004; Davies et al., 2005), fenómeno que corresponde a la variabilidad celular que expresa un genotipo originando diferentes fenotipos como respuesta acomodaticia a las condiciones ambientales (Overath et al., 1983). Es más, en el torrente circulatorio de los mamíferos pueden coexistir tripanosomas del mismo estadio, reconocibles morfológica y morfométricamente (Urdaneta-Morales, 1983; Tyler et al., 1997; Urdaneta-Morales & Tejero, 1992). En el género Leishmania la situación es un tanto controversial. Urdaneta & Scorza (1982), describieron especies venezolanas de Leishmania con criterios morfométricos, y está bien documentada la heterogeneidad morfológica de los promastigotes en el tubo digestivo de los Phlebotominae (Walters et al., 1989; Killick-Kendrick & Rioux, 1991; Walters et al., 1993; Gossage et al., 2003; Bates & Rogers, 2004), a pesar de lo cual Lukes et al. (2007) establecieron que las leishmanias del grupo donovani son indistinguibles en términos clínicos y morfológicos.
En este contexto de diversidad morfométrica, Rohlf & Marcus (1993) y Adams & Funk (1997) establecieron que, al margen de expresar las características genéticas de los organismos, podría indicar multiplicidad de estadios de desarrollo, diversidad de orígenes geográficos e, incluso, resultaría de la acción de efectos ambientales sobre los organismos. Si bien la heterogeneidad genómica de los Kinetoplastida se ha revisado (Simpson et al., 2006), la diversidad morfométrica ha sido poco considerada.
El estudio de la dimensionalidad de los Trypanosomatidae, incluyendo L. chagasi y T. cruzi, históricamente se ha restringido al registro puntual del tamaño en un momento particular del ciclo de vida (Vickerman, 1976; Vickerman & Preston, 1976; Lom, 1979; Molyneux y Ashford, 1983; Gardiner, 1989; Ashford y Crewe, 2003; Tayler & Engman, 2001; Kochhar, 2004). No obstante, Urdaneta-Morales & Tejero (1992), caracterizaron morfométricamente secuencias pleomórficas en los tripomastigotes hematozoicos de T. rangeli, un parásito que según Guhl et al. (1987), complica las infecciones humanas por T. cruzi.
A pesar de estos antecedentes, el análisis cuantitativo del cambio morfométrico como función del tiempo que se presenta en cultivos puros de L. chagasi y T. cruzi, así como en cultivos mixtos (L. chagasi-T. cruzi) es un tema no investigado que merece atención por cuanto Durán et al. (2009), demostraron que L. chagasi, T. cruzi e isomezclas de L. chagasi y T. cruzi mantenidas in vitro utilizan diferencialmente los sustratos tróficos del medio de cultivo. Así, la caracterización cuantitativa del cambio morfométrico pudiera ser útil en el diseño de estrategias de control de estos importantes parásitos humanos.
]]> Mediante la estimación del crecimiento de las poblaciones y del registro numérico de variables morfométricas indicadas por Hoare (1972), en este trabajo se investigaron las características cuantitativas del cambio morfométrico a lo largo del desarrollo de poblaciones de L. chagasi y T. cruzi mantenidas en cultivos axénicos puros, así como de isomezclas axénicas L. chagasi-T. cruzi.MATERIALES Y METODOS
Se emplearon las cepas MHOM/BR/74/PP75 de
L. chagasi e Y de T. cruzi. Los parásitos se mantuvieron en medio bifásico "Brain Heart Infusion" (BHI) con fase líquida de NaCl 0,85% y glucosa 1% a la que se añadieron 0,1 mg/mL de gentamicina, 100 IU/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina y 250 μg/mL de anfotericina B, todo a pH final 7,4 ± 0,2. Los experimentos consistieron en tres grupos: cultivos axénicos puros de L. chagasi, cultivos axénicos puros de T. cruzi y cultivos axénicos mixtos L. chagasi-T. cruzi (1:1).En la fase líquida del medio BHI se sembraron 0,2x106 flagelados/mL provenientes de cultivos que se encontraban en el punto medio de la fase de crecimiento exponencial. Los cultivos se realizaron en matraces Erlenmeyer de 500 mL con tapa de rosca no apretada provistos de medio bifásico BHI, mantenidos a 26ºC en reposo (sólo se agitaron con movimientos elípticos al momento de tomar las muestras) y sin mezcla particular de gases.
Interdiariamente durante 35 días, de la fase líquida de cada grupo experimental (
L. chagasi, T. cruzi y L. chagasi-T. cruzi) se tomaron 10 μL; con 5μL se cuantificó el crecimiento de las formas viables (Freshney, 1987) en cámara de Neubauer (400x) y con los 5μL restantes se hicieron extendidos sobre portaobjetos que se fijaron (glutaraldehído 0,25% en amortiguador fosfato salino glucosado) y colorearon (Giemsa 10%).Los extendidos fueron observados en microscopio óptico (1000X) provisto de cámara digital. Siguiendo un patrón de avance sistemático (Gundersen, 1978; Miles, 1978), se registraron 60 promastigotes/extendido en el cultivo puro de
L. chagasi, 60 epimastigotes/extendido en el cultivo puro de T. cruzi, así como 30 epimastigotes/extendido y 30 promastigotes/extendido en el cultivo mixto (L. chagasi-T. cruzi). Los argumentos establecidos por Fernández (1996) garantizaron la pertinencia del tamaño muestral y la robustez del análisis estadístico realizado. En cada uno de los parásitos se determinó la magnitud numérica de la longitud total (LT), la longitud corporal sin incluir el largo del flagelo libre (LC), el ancho máximo a nivel del núcleo (A), la distancia que separa el extremo anterior del centro del núcleo (AN), la distancia que se encuentra entre el extremo posterior y el centro del núcleo (PN), la distancia que hay del centro del núcleo al centro del cinetoplasto (CN), la distancia que se encuentra entre el extremo anterior y el centro del cinetoplasto (AC), la distancia que se encuentra entre el extremo posterior y el centro del cinetoplasto (PC) y la longitud del flagelo libre (F), tal cual lo estableció Hoare (1972). Además, se calculó la superficie del núcleo (SN), la superficie del cinetoplasto (SC) y la superficie total sin incluir el flagelo libre (ST).Si bien los conteos del número de organismos viables por mililitro de sobrenadante se realizaron con todos los estadios observados, el registro dimensional y el cálculo de las superficies sólo se hizo con promastigotes (
L. chagasi) y epimastigotes (T. cruzi), ya que la metodología empleada no permite diferenciar interespecíficamente los otros estadios observados (amastigotes, esferomastigotes y formas aberrantes).Los registros numéricos y los cálculos de las superficies se hicieron sobre imágenes digitales empleando el programa de dominio público "Image Processing and Analysis in Java" (ImageJ).
El tratamiento cuantitativo se emprendió con Análisis de la Varianza (ANOVA) (Sokal & Rohlf, 1995), Análisis de Residuos en Tablas de Contingencia (ARTC) (Bulla, 1981; Bulla, 1995), Ajuste Local Ponderado por el método de los Mínimos Cuadrados (LOWESS) (Cleveland, 1979; Cleveland & Devlin, 1988) y Análisis de Componentes Principales (ACP) (Jolliffe, 1986). Las pruebas estadísticas se realizaron con los programas Statistica 7.0 y MVSP 3.1.
Los experimentos por triplicado se repitieron tres veces con lotes diferentes de parásitos y medio de cultivo.
]]> RESULTADOSLa cinética de cambio en la densidad de las poblaciones muestra los picos máximos y mínimos del número de organismos viables/ml, así como el tiempo requerido para alcanzarlos; los resultados sugieren diferencias entre los tres grupos experimentales. Nótese además que la curva correspondiente al cultivo mixto (
L. chagasi-T. cruzi) pareciera diferir de sus contrapartes puras. No obstante los rangos de error estándar insinúan similitudes consistentes, al menos en porciones particulares de las curvas (Fig. 1).
El análisis de los puntos que configuran la Fig. 1 se acometió mediante un ANOVA de una vía, prueba que con base en la varianza global observada, compara la significancia de las semejanzas o diferencias de las medias de más de dos conjuntos de datos (Sokal & Rohlf, 1995); los resultados obtenidos indican claramente que al menos dos de las medias representadas en la Fig. 1, son diferentes (Tabla I).
Los resultados de la Tabla I, si bien indica diferencias significativas en las medias, no aporta información referente a la dinámica del cambio en sí. En consecuencia, se procedió con un ARTC, ensayo que, mediante el estadístico χ2, estudia la diferencia entre valores observados y esperados (residuos) evaluando la desviación de la hipótesis de independencia u homogeneidad (Bulla, 1981; Bulla, 1995); el ARTC compara cuantitativamente los perfiles de las curvas de la Fig. 1. En el ARTC (Fig. 2) las barras representan los perfiles de las curvas examinadas (
L. chagasi, T. cruzi y L. chagasi-T. cruzi). Si el residuo de una barra es 0, la barra no aparece representada. Por su parte, si una barra sobrepasa la línea punteada, implica que existe diferencia significativa en el residual. En la figura también se demuestra que los perfiles de las curvas de la Fig. 1, son diferentes en función del tiempo. La probabilidad asociada al χ2 (P = 0,0003) avala la robustez del análisis. 
Con base en la reducción dimensional experimentada, en criterios de significancia estadística (datos no mostrados) y de la preeminencia morfológica que características como longitud total, ancho máximo y distancia núcleo-cinetoplasto tienen sobre la forma de los promastigotes y los epimastigotes, las magnitudes numéricas de las variables LT, A y CN se utilizaron en ensayos biométricos exploratorios como primera aproximación cuantitativa al entendimiento del cambio morfométrico en promastigotes de
L. chagasi y epimastigotes de T. cruzi bajo estrés selectivo in vitro.La Tabla II presenta las medias y el error estándar que las variables LT, A, CN de
L. chagasi y T. cruzi alcanzaron en cultivos puros y mixtos. 
Ciertamente que los números presentados en la Tabla II son diferentes, pero carecen de significancia estadística. El ANOVA (Sokal & Rohlf, 1995) realizado sobre las medias de las variables LT, A y CN registradas durante 35 días en promastigotes de
L. chagasi mantenidos en cultivo puro y mixto, así como en los epimastigotes de T. cruzi presentes en cultivo puro y mixto (Tabla I), demostró diferencias significativas (Tabla III). 
El ANOVA probó inequívocamente que existen diferencias entre las medias de las variables LT, A y CN de promastigotes y epimastigotes, pero no aportó información acerca del proceso de cambio que esas variables experimentan a lo largo de los 35 días de cultivo. Es evidente que esta heterogeneidad dimensional resume un proceso natural más complejo enmarcado en el contexto de la historia del decrecimiento de las variables LT, A y CN in vitro, que se debe abordar en un contexto dinámico capaz de explorar y relacionar los patrones de cambio registrados en las variables seleccionadas.
El LOWESS es un modelo estadístico generador de una función de superficie que evidencia gráficamente asociaciones entre variables continuas (Cleveland, 1979; Cleveland & Devlin, 1988). En este caso particular presenta en planos tridimensionales (3D) las pautas de cambio en las relaciones que se establecen entre las variables LT, A y CN de promastigotes y epimastigotes mantenidos en cultivos puros y mixtos en medio BHI.
Mediante planos (3D), la Fig. 3 muestra diferencias en las relaciones dinámicas que se establecen entre las variables LT, A y CN de promastigotes de L. chagasi a lo largo de los 35 días de cultivo; el plano de la Figura 3A corresponde a las relaciones en el cultivo puro y el de la Figura 3B en el cultivo mixto.
Los planos 3D que se presentan en la Fig. 4 evidencias las relaciones que aparecen entre las variables LT, A y CN de los epimastigotes de T. cruzi presentes en cultivos puros y en cultivos mixtos en medio BHI; el plano de la Fig. 4A corresponde a las relaciones en el cultivo puro y el de la Figura 4B en el cultivo mixto.
Las Fig. 3 y 4 presentan planos 3D de geometría variable, cuyos cambios demuestran que las relaciones establecidas entre las variables LT, A y CN cuando los parásitos se mantienen en cultivos puros y mixtos, no son iguales.
]]> El estudio exploratorio de las variables LT, A y CN es acotado, por cuanto sólo considera 3 de las 12 variables morfométricas investigadas, restringiendo en consecuencia, la percepción de la heterogeneidad del proceso de cambio. La realidad experimental es más amplia y requiere, por lo tanto, un enfoque integrador de naturaleza multivariante.El ACP es una técnica multivariante descriptiva que, con mínima pérdida de información, presenta las medidas numéricas de múltiples variables en un espacio 2D o 3D donde se aprecian relaciones que, de otra manera, permanecerían encubiertas (Jolliffe, 1986). El ACP permite visualizar en un espacio 3D nubes de puntos ubicados en un hiperespacio original n-dimensional. La bondad del modelo reside en la distorsión mínima que ejerce sobre las variables al ubicarlas en un espacio comprensible. La capacidad de compresión de variables del modelo redujo las variables analizadas de un hiperespacio de doce dimensional (12 ejes) a un nuevo espacio 3D que explica el 70,727% de la varianza total del sistema. Los autovalores (varianza) expresan la longitud de cada uno de los ejes (componentes) y no son crecientes; como era de esperarse la máxima varianza corresponde al primer componente (38,496%). La Tabla IV resume los resultados del ACP.
La Fig. 5 corresponde a la representación 3D de los resultados proporcionados por el ACP.
La Fig. 5 muestra cuatro nubes de puntos representadas en un espacio 3D que corresponden a las magnitudes numéricas de las variables morfométricas registradas en los promastigotes de L. chagasi en cultivo puro (nube 1) y mixto (nube 2), así como
de los epimastigotes de T. cruzi en cultivo mixto (nube 3) y puro (nube 4). Los conjuntos numéricos están representados en un espacio reducido 3D en el que destaca la segregación de las nubes, llamando particularmente la atención las correspondientes al mismo estadio en condiciones de cultivo diferente (puro o mixto). También se aprecia mayor separación entre las nubes de L. chagasi (promastigotes en cultivo puro y mixto) que en las de T. cruzi (epimastigotes en cultivo puro y mixto).
DISCUSIÓN
Las variaciones observadas en la densidad de las poblaciones de L. chagasi y T. cruzi en cultivos puros, así como de las isomezclas (L. chagasi-T. cruzi), mostraron patrones gráficos, a primera vista disímiles (Fig. 1), caracterizados por picos poblacionales máximos desiguales que aparecen a tiempos diferentes, son particularidades que en el ARTC se representan como barras positivas y negativas que, con significancia estadística, demuestran gráficamente la disparidad de las curvas de variación de la densidad poblacional en la fase líquida del medio BHI (Fig. 2).
La presencia de curvas con picos de densidades poblacionales particulares indicaría la expresión de propiedades morfo-funcionales específicas en los cultivos puros de L. chagasi y T. cruzi, así como en las isomezclas L. chagasi-T. cruzi que gestionarían condiciones fisicoquímicas propias de períodos particulares en un medio ambiente que se modifica en forma continua, deletérea e irreversible por merma de substratos tróficos, modificación del pH (Duran et al., 2009) y acumulación de metabolitos tóxicos o potencialmente tóxicos (Mauel, 1984; Schuster & Sullina, 2002). En consecuencia, los cambios observados en este trabajo confirmarían lo indicado por Tejero et al. (2004), por cuanto resultarían de la expresión de mecanismos moduladores de la forma y la función. Según Tejero et al. (1984), estos comportamientos corresponden a características definidas que, junto a otras propiedades, son específicas de las especies leishmánicas mantenidas in vitro. En este sentido, y conforme a lo demostrado por Duran et al. (2009), las poblaciones de L. chagasi y T. cruzi presentes en cultivos mixtos, utilizan los recursos disponibles en el sobrenadante del medio BHI de forma diferente a como lo hacen al ser mantenidos en cultivos puros en condiciones idénticas.
]]> Las magnitudes numéricas de las variables morfométricas registradas en L. chagasi y T. cruzi, pudiera asociarse con aspectos numerarios meramente taxonómicos de comparación inter-específica que, además, estarían poco relacionados con la dinámica multiviariante de su biología. No obstante, el estudio de la variación dimensional, por ser expresión cuantitativa de la ontogenia de los tripanosomas (Tejero et al., 2008), enriquece la perspectiva, por cuanto permite investigar el dinamismo de las relaciones que se establecen entre las variables morfométricas que, en el transcurso del tiempo, se traduce en la expresión secuencial de fenómenos no excluyentes como aparición de estadios diferentes o de variantes fenotípicas de un estadio particular (pleomorfismo).Los análisis exploratorios adelantados reflejaron diferencias de magnitud numérica (Tabla II) y de relaciones dimensionales en términos intra-específicos (promastigotes de
L. chagasi en cultivo puro y mixto; epimastigotes de T. cruzi en cultivo puro y mixto) e inter-específicos (promastigotes y epimastigotes), pero por no ser pruebas diseñadas para segregar, no suministraron información cuantitativa que permitiera comparar los procesos de cambio morfométrico asociados a promastigotes y epimastigotes sometidos a diferentes fuentes de estrés: competencia intra-específica (cultivo puro) y competencia intra- e inter-específicas (cultivo mixto).El ACP, además de demostrar discriminación morfométrica inter-específica, una propiedad obvia por cuanto se trata de epimastigotes (
T. cruzi) y promastigotes (L. chagasi), prueba taxativamente discriminación morfométrica intra-específica. En efecto, al comparar la dimensionalidad de los promastigotes (L. chagasi) de los cultivos puros con la dimensionalidad de los promastigotes (L. chagasi) de los cultivos mixtos, se aprecian dos nubes de puntos diferentes y separadas. Situación análoga se observa al cotejar las características dimensionales de los epimastigotes (T. cruzi) de los cultivos puros con las medidas de los epimastigotes (T. cruzi) de los cultivos mixtos. Los atributos dimensionales, tanto de promastigotes (L. chagasi) como de epimastigotes (T. cruzi) en los cultivos puros y mixtos, son significativamente diferentes. Bock y Von Wahlert (1965), establecieron que la capacidad de transformación observada en las especies como respuesta a los cambios medioambientales, es un atributo que evita la extinción.Es bien conocido que los tripomastigotes hematozoicos de
T. brucei (Vickerman, 1989), T. rangeli (Urdaneta-Morales & Tejero, 1992) y T. cruzi (Penin et al., 1996), cambian de aspecto en el transcurso de la infección sin dejar de ser tripomastigotes. Al margen del significado adaptativo de dicha transformación, es menester analizar las propiedades del cambio per se desde la óptica de la coexistencia temporal de las formas involucradas. En tal sentido, Reuner et al. (1997), expresaron que la diferenciación de los tripomastigotes delgados de T. brucei en tripomastigotes rechonchos, está relacionada con el número de flagelados, por cuanto limita el tamaño de las poblaciones sin depender de la respuesta inmune del hospedador. Los autores al comparar la diferenciación in vitro e in vivo, concluyen que el cambio in vitro refleja lo acontecido en los procesos naturales. Es más, el significado de los resultados obtenidos in vitro y su relación con resultados similares derivados de experimentos in vivo, ha sido demostrado. Hecker & Brun (1982), establecieron similitudes biológicas entre poblaciones de T. brucei mantenidas in vitro y sus contrapartes mantenidas in vivo y Gamboa et al. (2008) indicaron que los patrones de infectividad in vitro se corresponden con la estructura geográfica de poblaciones de Leishmania.El éxito evolutivo que han alcanzado los Trypanosomatidae es incuestionable (Vickerman, 1994; Kerr, 2000). En este contexto, la relación forma-función constituye una faceta en la que sería apropiado considerar que la modulación endógena y/o exógena en poblaciones de
L. chagasi y T. cruzi constituiría un elemento que, junto a otras características, avalaría la notoriedad adaptativa que han logrado.El análisis morfométrico-poblacional de
L. chagasi y T. cruzi con metodologías multivariantes permitió discriminar poblaciones del mismo estadio (promastigotes de L. chagasi y epimastigotes de T. cruzi) como función del estrés ambiental, por cuanto demuestran propiedades morfométricas y poblacionales disímiles en ambientes diferentes (cultivos axénicos puros y los cultivos axénicos mixtos). El análisis también reveló que tal disparidad es más acentuada en L. chagasi que en T. cruzi, ya que la segregación de los promastigotes es mayor que la observada entre los epimastigotes, demostrando así la interacción-dependencia de la forma y la función en estos Trypanosomatidae. Este planteamiento permite hipotetizar que las características particulares de la leishmaniasis visceral y de la Enfermedad de Chagas pudieran diferir en condiciones de infección natural concomitante L. chagasi-T. cruzi.AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan su agradecimiento al Proyecto LOCTI-UCV 2007 Nº P0934020 (Laboratorios ELMOR, S.A.) por el apoyo económico recibido.
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