1690-4648 1690-4648 S1690-46482010000100009 Venezuela Venezuela 00 07 2010 00 07 2010 50 1 85 93

Infección por Trypanosoma cruzi y polimorfismo del Citocromo B del ADN mitocondrial en Triatoma maculata de Anzoategui y Portuguesa, Venezuela

Nilsa González-Brítez1, Antonio Morocoima2, Clara Martínez1 & Hernán J. Carrasco1*

1 Instituto de Medicina Tropical (IMT), "Dr Felix Pifano" Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela (UCV), Caracas, Venezuela.

2 Centro de Medicina Tropical de Oriente, Universidad de Oriente (UDO) Núcleo de Anzoátegui, Barcelona, estado Anzoátegui, Venezuela.

*Autor de correspondencia: hernan.carrasco@ucv.ve

Con el fin de entender la dinámica poblacional de Triatoma maculata, se analizó el polimorfismo genético y los índices de infección con Trypanosoma cruzi, utilizando triatominos provenientes de ecotopos y regiones geográficas diferentes. El índice de infección parasitaria para T. maculata, fue de 29.8% a través de la observación directa al microscopio y 40.3% utilizando el método de reacción en cadena de la polimerasa. Los niveles de infección encontrados incrementan la importancia de T. maculata como vector involucrado en el ciclo de transmisión de T. cruzi. El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción de una región del gen Cyt B, permitió establecer en forma preliminar, diferencias en los patrones de bandas de este gen, según el origen geográfico de cada población. Esto puede asociarse a cambios relacionados con procesos adaptativos involucrados en la colonización de nuevos hábitats. No se observó variación genética para vectores capturados en diferentes ecotopos de una misma localidad. Sin embargo es evidente la participación del vector en el ciclo de transmisión, mostrando que la presencia de T. maculata en las casas no puede ser ignorada.

Palabras clave: Trypanosoma cruzi, Triatoma maculata, RFLP-PCR, citocromo b.

Trypanosoma cruzi infection and cytochrome b polimorphism of mitochondrial dna in Triatoma maculata of Anzoátegui and Portuguesa states, Venezuela.

SUMMARY

]]> In order to understand more about the populational dynamics of Triatoma maculata, the genetic polimorphism and the infection indexes of Trypanosoma cruzi were analysed, using triatomine obtained from different ecotopes and geographical regions. The parasitic infection index of T. maculata was 29.8% using the microscope direct observation, and 40.3% by the polymerase chain reaction method. Both methods were important for epidemiological screening of the vectors with low potential of infection. The amplification of one region the Cyt B gene of these organisms, followed by a restriction fragments length polymorphism analysis, allowed us to establish different patterns of bands according to the geographic origin of each population, which indicates the lack of migration between individuals of Portuguesa and Anzoátegui states. These genetic differences may be associated with changes in adaptative events involved in the colonization of new habitats. The lack of polymorphism among vectors collected in different habitats of the same region showed an important genetic flow which has epidemiological implications in the risk of transmission of the disease, showing that the presence of T. maculata in houses cannot be ignored.

Key words: Trypanosoma cruzi, Triatoma maculata, RFLP-PCR, cytochrome b.

Recibido el 01/09/2009 Aceptado el 21/02/2010

INTRODUCCIÓN

Los triatominos son insectos hematófagos que pertenecen al orden Hemíptera, familia Reduviidae y subfamilia Triatominae, comprendiendo un grupo de 138 especies (Galvão et al., 2003; Costa & Felix, 2007). Los vectores primarios tienen hábitos intradomiciliarios y son los principales transmisores del Trypanosoma cruzi, parásito causante de la Tripanosomosis Americana, una de las más importantes enfermedades metaxénicas, cuya prevención se basa principalmente en el control vectorial, por lo cual es necesario conocer profundamente las características de estos insectos. Existen otros triatominos que demuestran tendencias sinantrópicas relacionadas con su distribución, potencial de colonización y su comprobada capacidad vectorial, por lo cual han sido considerados como vectores de menor importancia en la transmisión del parásito, tal como Panstrongylus megistus, Triatoma pseudomaculata, Triatoma maculata y otros.

Una especie originalmente silvestre, adaptada al peridomicilio que habita palmas y árboles secos asociados con aves, roedores y marsupiales, es Triatoma maculata (Erichson, 1848), la cual exhibe importancia epidemiológica cuando se encuentra naturalmente infectada con T. cruzi y presenta características de colonización de viviendas humanas (Torrealba et al., 1985; Lent & Wygodzinsky, 1979; Luitgards-Moura et al., 2005). Esta especie ha sido descrita en Brasil, Venezuela, Colombia, Surinam, Guyana Francesa y algunas islas del Caribe (Carcavallo et al., 2000). En Venezuela, aunque Rhodnius prolixus es el vector responsable de la transmisión doméstica, T. maculata es considerada una especie ornitófaga asociada a gallinas y palomas del peridomicilio, y aunque no se conoce mucho de su capacidad vectorial, esta contribuye con la transmisión del parásito (Pifano, 1969; 1973) y la misma ha sido asociada con frecuentes procesos de domiciliación (Cortes & Suárez, 2005; Feliciangeli et al., 2003; Luitgards-Moura et al., 2005), pero sigue siendo difícil evaluar su papel en la transmisión, debido a que presentan índices de infección inferiores a los registrados para el vector primario. Basados en la escasa información epidemiológica de los vectores secundarios en las áreas endémicas del Venezuela, es importante realizar un estudio de las poblaciones de T. maculata, que involucren indicadores de infección y variabilidad poblacional, siendo esto último de gran importancia ya que pudiera estar asociado a cambios en el patrón de comportamiento del vector. Tomando en cuenta estos antecedentes, y con el fin de brindar información epidemiológica en algunas áreas de ocurrencia de T. maculata, se utilizó el método de amplificación del ADN del kinetoplasto (k-DNA), para detectar la presencia del parásito en los triatominos, así como la Reacción en Cadena del ADN Polimerasa seguido del Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) para determinar el polimorfismo intraespecífico del gen citocromo b entre poblaciones provenientes de diferentes regiones geográficas.

Esta información es esencial para el diseño de estrategias de control del vector, ya que, aunque secundario, es pertinente el conocimiento de sus potencialidades como transmisor del parásito, así como para el monitoreo del proceso de colonización domiciliar por T. maculata.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio

Los ejemplares fueron colectados en diferentes ecotopos de los caseríos rurales: "El Eneal"(10° 07’ 00" N, 064° 36’ 00" O) y "Pica de Neveri" (10° 06’ 00" N, 064° 37’ 00" O) del estado Anzoátegui, "Jabillal" (09° 42’ 51" N, 069° 18’ 41" O) y "Las Panelas" (08° 58’ 47" N, 069° 58’ 26" O) del estado Portuguesa (Fig. 1).

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El estado Anzoátegui está caracterizado por bosques tropicales de altitud media, temperatura de 28 a 30°C y periodos muy marcados de lluvias (Benítez, 2004). En varios caseríos al norte del estado se ha determinado el incremento en los índices de infección con T. cruzi e infestación con T. maculata dentro de las viviendas (Gamboa, 1962; Morocoima, 2008 Com pers).

El estado Portuguesa está compuesto por bosques húmedos y relieves montañosos al pie de los Andes venezolanos y la temperatura media es de 25ºC. La infestación peridomiciliar con T. maculata se encuentra localizada principalmente en áreas bajas (Benítez, 2006).

En los caseríos estudiados, la mayoría de las viviendas están construidas con madera, cemento o bahareque y techos de palma o zinc. El peridomicilio está compuesto por refugios de animales domésticos, gallineros y otros anexos, así como por la presencia de palmas alrededor de los ranchos (más abundante en Anzoátegui), que reúnen las condiciones óptimas y constituyen un importante albergue para los insectos.

Material biológico

La búsqueda activa de insectos se realizó con ayuda del personal de Malariología y el tiempo de búsqueda por vivienda fue de 45 minutos aproximadamente. Se analizaron para ambas regiones un total de 120 biotopos, entre los que se incluyeron 82 viviendas y 38 ambientes extra-domésticos (gallineros, nidos de aves, palmeras y cúmulos de madera), seleccionados al azar por medio del muestreo aleatorio simple (Spiegel & Stephens, 2001).

Los triatominos silvestres se colectaron luego de la disección de las palmas y a través de la colocación de trampas en árboles y palmeras que se encontraban en la proximidad de las casas (máximo 300 metros) (Noireau et al., 1999). Se capturaron 124 T. maculata (74 adultos y 50 ninfas), clasificados de acuerdo con la clave de Lent & Wygotzinsky (1979). Estos insectos fueron codificados según sexo, ecotopo y estado, de los cuales 72 insectos provenían de Anzoátegui (23 del peridomicilio, 22 del domicilio y 27 silvestres), y 52 de Portuguesa. (36 del peridomicilio y 16 silvestres). Para el análisis parasitológico, las heces frescas se obtuvieron por presión abdominal.

Diagnóstico parasitológico de Infección por Trypanosoma cruzi Observación directa al microscopio (ODM): Fue examinado el total de triatominos capturados utilizando la muestra fecal diluida en solución salina al 0,85% para luego realizar la búsqueda de tripanosomas activos según el método de Brener modificado (Brener, 1962). Posteriormente se calcularon los índices de infección natural de T. maculata presente en las comunidades.

Aislamiento y amplificación por PCR de la región variable de los minicírculos del ADN del kinetoplasto (k-DNA) de T. cruzi

La extracción de ADN del parásito se realizó del resto sanguíneo del promesenterón de cada insecto siguiendo el protocolo Wizard® (Genomic DNA Purification, Promega). La amplificación del k-DNA del parásito, se realizó en 20 μL de volumen final de reactivos de PCR y 100 ng ADN blanco, utilizando los iniciadores S35 (5`- AAA TAA TGT ACG GG (T/G) GAG ATG CAT GA-3`) y S36 (5`- GGG TTC GAT TGG GGT TGG TGT-3`) (Sturm et al., 1989). El control negativo consistió en la amplificación del ADN extraído a partir de heces de triatominos sanos criados en el laboratorio. Los productos del PCR fueron verificados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %, en buffer TBE 1X (45mM Tris-borato, EDTA 1mM). Los geles fueron visualizados en un transluminador UV a través del programa de captura de imágenes KODAK DC 120.

]]> Aislamiento, amplificación y digestión de un fragmento del gen citocromo b (cyt-b) de T. maculata

Una muestra representada por el 35 % de la población total (41 insectos de ambas regiones) fue sometida a la extracción de ADN a partir de las patas, las cuales fueron previamente lavadas con buffer PBS (Phosphated Buffered Saline) para evitar contaminación y posteriormente fueron criofracturadas en nitrógeno líquido según el método reportado por García et al., (1998). Con el pellet obtenido se realizó el protocolo de extracción del Wizard ® (Genomic DNA Purification Kit, Promega) y el producto final fue resuspendido en 40 μL de solución de rehidratación (Miller et al., 1988).

Para la amplificación del fragmento del gen mitocondrial citocromo b y su posterior digestión enzimática fueron utilizados 20 triatominos de Portuguesa (13 de peridomicilio y 7 silvestres) y 21 de Anzoátegui (7 de peridomicilio, 8 silvestres y 6 de domicilio). La mezcla de reacción se realizó en 25 μL de volumen final que contenía 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8,6), 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 1,0 U. de enzima ADN Taq Polimerasa (BIOTAQ™ DNA Polymerase, Bioline), 10 pmol de los cebadores Cytb-32F y Cytb-82R (Monteiro et al., 2000) y 50 ng de ADN genómico. La amplificación del gen se realizó bajo las siguientes condiciones, desnaturalización a 95°C por 5 minutos, seguida de 95°C por 1 minuto, 60°C por 50 segundos, 72°C por 45 segundos (35 ciclos), con extensión final a 72°C por 5 minutos. El control negativo incluyó todos los componentes con excepción del ADN molde. El producto de PCR fue visualizado mediante electroforesis en gel de agarosa 1% teñido con bromuro de etidio y una alícuota del mismo fue digerida durante toda la noche a 37°C, con 5 U de endonucleasa de restricción de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las enzimas utilizadas fueron AluI, BamHI, HhaI, PstI, NotI, HindIII y SalI (BioLabs Inc., New England y Promega Corp. USA), seleccionadas acorde al análisis de restricción sobre secuencias del mismo gen en otras especies que fueron tomadas del Gen Bank.

Los perfiles de restricción fueron visualizados en agarosa 2,5 % y digitalizados en el software Quantity One de BIORAD. La interpretación del patrón de bandas se realizó a través de la estimación del tamaño de pares de bases de los fragmentos amplificados comparados con la escalera de 200 pb (HyperladderTM I de BIOLINE) disponible en el laboratorio.

RESULTADOS

Diagnóstico parasitológico de Infección por T. cruzi

En la Tabla I se resume el número de triatominos capturados por caseríos y ecotopos de acuerdo a la región de la cual provienen, así como los índices de infestación y colonización por cada ecotopo. Para el análisis por ODM y PCR, se utilizó el 100 % de los ejemplares y se observó la mayor sensibilidad del PCR, obteniéndose para Anzoátegui 29/72 individuos positivos por microscopia y 34/72 positivos por PCR. Para el estado Portuguesa se obtuvieron 8/52 positivos por observación directa y 16/52 positivos por PCR (Tabla II). El método de amplificación por PCR evidenció la presencia del fragmento de 330pb, correspondiente a la región variable de los minicírculos del kinetoplasto de T. cruzi, según Sturm et al. (1989) (Fig. 2).

]]> Reacción en Cadena del ADN Polimerasa -Polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (PCR-RFLP)

Con la amplificación del gen Cyt-b se obtuvo un producto de aproximadamente 580 bp (Fig. 3), el cual fue digerido con las enzimas de restricción ya mencionadas: Las enzimas HhaI y PstI no mostraron diferencias en los fragmentos generados para los individuos provenientes de los dos estados, mostrando un único sitio de restricción. La Fig. 4 corresponde a la digestión con la enzima AluI, que generó fragmentos diferentes según el origen geográfico de los triatominos. Para los individuos de Portuguesa, se generaron dos fragmentos de restricción; de 430 y 150 bp aproximadamente, mientras que para las poblaciones de Anzoátegui se observaron varios fragmentos de digestión parcial y al menos tres fragmentos de restricción bien definidos de aproximadamente 350bp, 150bp y 80bp. Las enzimas restantes no exhibieron sitios de restricción en ninguna de las poblaciones estudiadas (foto no mostrada).

DISCUSIÓN

La frecuencia de infección encontrada por el método parasitológico directo, sugiere que el riesgo que T. maculata podría representar en la transmisión de la Tripanosomosis puede estar subestimado, sin embargo con la amplificación del k-DNA del parásito, utilizando ADN de las deyecciones de triatominos, se logró mejor aproximación de los índices reales de infección con T. cruzi (Brito et al., 2001; Guevara et al., 2005; Zalloum et al., 2005). Los niveles de infección subestimados muestran limitado potencial de transmisión para T. maculata, hecho que podría no ser real en estos caseríos, principalmente cuando se les compara con los índices de infección obtenidos (5,8 a 20%) para R. prolixus (Benítez, 2006). A pesar de esto, el papel del T. maculata en la transmisión de la Tripanosomosis en Venezuela, es difícil de evaluar, debido a la escasa información sobre la especie, habiéndose reportado en la década del 70, índices de infestación entre 0,8% y 4,5% (Gamboa & Pérez-Ríos, 1965; Tonn et al., 1978). Posteriormente en el 2003, Alvarez et al., (2003) reportaron que la infección de T. maculata con T. cruzi varió entre 0,78 % y 13,2 %, y datos más recientes dieron índices de infección de 0.36% para tres especies de vectores, incluido T. maculata (Rojas et al., 2008). Ambos estudios fueron para los estados Lara y Yaracuy. Por otra parte, en algunas áreas rurales colombianas asociadas a la presencia de T. maculata, se registraron índices de infestación del 20% e infección de 58,3%, así como casos seropositivos en niños menores de 9 años (Cortes & Suárez, 2005). En nuestro trabajo, los triatominos presentaron índices de infección por ODM, de 15,3% y 40,2% y por PCR de 30,7 % y 47,2% para Portuguesa y Anzoátegui respectivamente, lo que podría involucrar a esta especie como un vector eficiente en la transmisión del parásito.

Aunque son escasos los estudios realizados en el estado Anzoátegui, se han registrado casos seropositivos para la enfermedad de Chagas con riesgo de transmisión activa (Añez et al., 2003). Sin embargo la mayor infección vectorial observada podría atribuirse a la simpatría con R. prolixus y a la presencia de Didelphis marsupialis (principal reservorio de T. cruzi) en los ecotopos silvestres, los cuales, en algunos casos se encuentran a menos de 300 metros del peridomicilio, que aunado a la tala y quema de bosques de la zona, ha facilitado la migración y colonización de viviendas por T. maculata (Morocoima et al., 2005). Esta característica coincide con el caserío Pica de Neveri, debido a que en el mismo fueron encontradas ninfas intradomiciliares (6/50), aunque el hallazgo se observó en solo tres viviendas, esto se explicaría por la colonización peridomiciliar (principalmente gallineros) favorecida por la presencia de animales que actúan como fuente de alimento; e incluso por el desorden peridomiciliar que incrementaría su infestación en detrimento del domicilio, como ya lo afirmaron otros autores (de Andrade et al., 1995). La menor infección hallada en los caseríos de Portuguesa, podría ser explicada por la mayor densidad de R. prolixus, que por ser vector primario tiene la capacidad de desplazar a los de menor importancia epidemiológica y mantenerlos en su biotopo original, donde su fuente principal de alimento son las aves, las cuales son refractarias al parásito.

Por otra parte, el PCR-RFLP es una prueba alternativa para la diferenciación entre poblaciones de vectores, la cual es importante para orientar el control y contribuir al señalamiento de tendencias de la transmisión natural. Los haplotipos diferentes en las dos poblaciones de T. maculata obtenido con la enzima Alu I, muestra la utilidad del gen citocromo b como marcador de polimorfismo intraespecífico y el perfil de restricción obtenido sugiere que las poblaciones naturales retienen algunos índices de variabilidad genética, probablemente como indicador de estructura poblacional en la distribución de haplotipos del gen amplificado. Es decir, que la variación observada en la longitud de los fragmentos de restricción con Alu I infiere en forma preliminar, la existencia de alelos diferentes para ambas poblaciones, afirmación basada también en otros resultados hallados en el análisis de secuencias del mismo gen (datos no publicados). Aun así, los autores consideran que se requiere profundizar el estudio con genes menos conservados. Por otro lado, cuando se consideran las poblaciones de una misma localidad, es difícil establecer afirmaciones concluyentes sobre el polimorfismo genético, debido al hallazgo de variaciones propias del individuo, afectado por factores ambientales o fuentes alimenticias, como parece observarse en un ejemplar adulto (Fig. 4, carril 7) proveniente de una palma silvestre que ha mostrado perfil distinto a otros insectos del mismo biotopo. Por otra parte, debido al reducido número de ejemplares utilizado por ecotopo (± 8 ejemplares/ecotopo) en este tipo de análisis, no es posible concluir acerca de características genéticas específicas. Sin embargo, apoyados en otros resultados obtenidos con morfometria geométrica, se sugiere la similaridad morfológica entre individuos de diferentes ecotopos correspondientes a una misma localidad (datos no mostrados).

De esta manera, aunque el polimorfismo se observó con una única enzima, el elevado índice de infección natural nos lleva a pensar en la ocurrencia de cambios en el comportamiento y la dinámica adaptativa de T. maculata, principalmente en Anzoátegui, lo que incrementaría su relación con la transmisión del parásito. Estos cambios son ayudados por las acciones antropogénicas (deforestación, caza) que impactan el hábitat natural y por ende su fuente de alimento, por lo cual los insectos son presionados a migrar y buscar microambientes similares a su hábitat natural, hecho que podría conducir a la domiciliación de los vectores (Wolff & Castillo, 2002). En el estado Anzoátegui, la proximidad de los biotopos silvestres a las viviendas favorecen el desplazamiento de los vectores y esto les permite establecerse exitosamente como nuevo eslabón de los focos domiciliarios (Noireau et al., 1999). La movilidad de los insectos entre hábitats adyacentes nos lleva a pensar en la mayor facilidad de colonización vectorial, acorde a un estudio obtenido por Sánchez-Martin et al., (2006), donde reportaron que las palmeras infestadas dentro de los 100 metros de la vivienda representa un factor de riesgo importante para la colonización domiciliar, aunado al elevado índice de infección natural que mantiene la infección humana en las comunidades.

Debido a ésto es importante la vigilancia epidemiológica para los vectores secundarios que buscan ocupar el espacio dejado por el vector domiciliario; con el fin de asegurar que estas especies no se conviertan en un severo problema de salud pública. Para ello es necesario, incrementar las medidas de control a través de la capacitación activa de la comunidad, así como disminuir la colonización triatominica en áreas suburbanas, de manera que este control sea sostenible en el tiempo.

]]> Por ultimo, señalamos que el análisis del k-DNA puede representar un método sencillo y práctico para el diagnóstico durante el monitoreo epidemiológico de la enfermedad de Chagas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado por los autores con el apoyo financiero del FONACIT a través del proyecto de grupo G-2005000827. Agradecemos también la ayuda brindada por los técnicos David Chique y Marlene Rodríguez, a la dirección de Malariología, Acarigua, estado Portuguesa y finalmente a los habitantes de las localidades estudiadas por su cordial receptividad y colaboración.

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