1690-4648 1690-4648 S1690-46482013000100009 00 01 2013 00 01 2013 53 1 68 72

Primer registro de Anopheles (Nyssorhynchus) oswaldoi B y Anopheles (Nys.) albitarsis F en la cuenca del río Caura, Estado Bolívar, Venezuela

Yasmin Rubio-Palis1,2*, Freddy Ruiz-Lopez3,4 , Hernán Guzmán5 , Víctor Sánchez5 , Jorge E. Moreno5 , Yarys Estrada5 ,Mariapia Bevilacqua6 , Lya Cárdenas6  & Ángela Martínez7

1  Dirección de Control de Vectores, Dirección de Salud Ambiental, Ministerio del Poder Popular para la Salud. Maracay, Venezuela.
2  BIOMED, Universidad de Carabobo, Maracay, Venezuela.
3  Division of Entomology, Walter Reed Army Institute of Research, 503 Robert Grant Avenue, Silver Spring, MD 20910.
4  Department of Entomology, National Museum of Natural History, Smithsonian Institution. Museum Support Center, Suitland, MD 20746.
5  Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios “Dr. Arnoldo Gabaldon” (MPPS), Centro de Investigaciones de Campo “Dr. Francesco Vitanza”, Tumeremo, estado Bolívar, Venezuela.
6  Asociación Venezolana para la Conservación de Áreas Naturales (ACOANA), Caracas, Venezuela
7  Instituto de Salud Pública del estado Bolívar, Ciudad Bolívar, Venezuela
*Autor de correspondencia: rubiopalis@gmail.com ]]>
RESUMEN

  Se registran por primera vez Anopheles albitarsis F y Anopheles oswaldoi B recolectadas en localidades de los  Municipios  Sucre  y  Cedeño  del  estado  Bolívar.  Los análisis  morfométricos  de  hembras  adultas  mostraron que los caracteres analizados en las manchas claras y oscuras de  la  vena  Costa  del  ala  y  los  tarsómeros  de  las  patas posteriores para An. albitarsis F caen dentro de los rangos reportados para An. marajora sensu lato, mientras que para  An.  oswaldoi  B  los  rangos  de  variación  de  los  caracteres medidos están dentro del rango reportado para An. oswaldoi s.l., An. oswaldoi sensu stricto de Brasil y An. konderi. Sin  embargo,  el  análisis  de  ADN  mitocondrial  (región  código de barras, 658  pb) mostró una  divergencia genética entre An. oswaldoi B y An. oswaldoi s.s. de 3,2%, mientras entre An.  albirtarsis  F  y  An.  marajoara  s.s.  esta  fue  de  5,2%, valores que están por encima de los limites propuestos para  delimitación de especies.

Palabras clave: Anopheles oswaldoi B, Anopheles albitarsis F,  complejos de especies, malaria, Venezuela.

                              First record of Anopheles (Nyssorhynchus) oswaldoi B y Anopheles (Nys.) albi-tarsis F from the Caura river basin, Bolívar State, Venezuela

SUMMARY ]]>
Anopheles  albitarsis  F  and  Anopheles  oswaldoi  B were  first  recorded  from  collections  in  Sucre  and  Cedeño  Municipalities, Bolivar State. Morphometric analysis of dark  and pale spots on wing Costa and hind tarsomeres of adult females, showed that the range of variation for An. albitarsis  F are within the reported ranges for An. marajoara sensu latu For An. oswaldoi B the range of variation are within the ranges reported for An. oswaldoi s.l., An. oswaldoi sensu stricto from  Brazil and An. konderi. DNA mitochondrial analysis (Barcode region 658 bp) showed 3.2% of genetic divergence between  An. oswaldoi B and An. oswaldoi s.s., while this divergence  was 5.2% between An. albirtarsis F and An. marajoara s.s. Both these values are above the proposed limits for species  delimitation.
 
Key words: Anopheles oswaldoi B, Anopheles albitarsis F, species complex, malaria, Venezuela.

Recibido el 13/11/2012 Aceptado el 10/03/2013

  Hasta  el  presente  se  han  reportado  para Venezuela  42  especies  de  anofelinos  (Rubio-Palis, 2005. Bol. Mal. Salud Amb. 45: 1-10), de las cuales 11 han sido incriminadas en la transmisión de malaria (Moreno  et  al.,  2005.  Med.  Vet.  Entomol.  19:  329-332; Rubio-Palis, 2000. Anopheles (Nyssorhynchus) de  Venezuela:  taxonomía,  bionomía,  ecología  e importancia  médica.  Publicación  de  la  Escuela  de Malariología y Saneamiento Ambiental “Dr. Arnoldo Gabaldon”.  Maracay-Venezuela).  El  mayor  número de especies vectoras en Venezuela se encuentra dentro del subgénero Nyssorhynchus (n = 8), el cual ha sido considerado  complicado  desde  el  punto  de  vista taxonómico debido a la gran variabilidad morfológica intraespecífica y la presencia de especies isomórficas [Faran, 1980. Contrib. Am. Entomol. Inst. 15: 1-215; Harbach, 1994. Bull. Ent. Res. 84: 331-342; Knight &  Stone,  1977. A  catalog  of  the  mosquitoes  of  the   En cuanto al Complejo Oswaldoi, Marrelli et al. (1999. Op. cit.), usando secuencias de ITS2 (ADNr), sugirieron  que  An.  oswaldoi  estaba  formado  por  al menos cuatro especies: An. oswaldoi sensu stricto, An. konderi Galvão & Damasceno, y otras dos especies aun no descritas. Sin embargo, Ruiz et al. (2005. Op. cit.)  utilizando  secuencias  del  ITS2,  confirmó  que dos de los cuatro grupos reportados por Marrelli et al. (1999, Op. cit.) fueron errores taxonómicos y que en  realidad  se  trataba  de  especies  isomórficas ( An. benarrochi B, reportado como An. oswaldoi sensu lato en  Perú  (GB: AF055071)  y  An.  evansae,  reportado como An. oswaldoi s.s. (GB: AF055072) en Espirito Santo,  Brasil).  Los  especimenes  de  An.  oswaldoi B  secuenciados  por  Ruiz  et  al.  (2005.  Op.  cit.)  de Putumayo (Colombia), mostraron alta similitud con las secuencias previamente reportadas por Marrerlli et  al.  (1999.  Op.  cit.)  para Amapá  en  Brasil  (GB: AF056318)  y  Ocamo,  en  el  estado  Amazonas  de Venezuela (GB: AF055070). Posteriormente, Motoki et  al.  (2007,  Zootaxa.  1588:  31-51)  re-describieron el  lectotipo  de  An.  oswadoi  s.s.  y  confirmaron  los resultados  previamente  publicados  por  Ruiz  et  al. (2005. Op. cit.), los cuales sugieren An. oswaldoi B de  Putumayo  (Colombia)  (Ruiz  et  al.,  2010.  Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 105: 899-903) como una especie diferente de An. oswaldoi s.s.

  Los  resultados  anteriores  muestran  una situación  epidemiológica  compleja  en  Venezuela, puesto que An. albitarsis s.l. y An. oswaldoi s.l. han sido  incriminados  como  vectores  de  malaria  en  el occidente de Venezuela (Rubio-Palis et al., 1992, Acta Tropica. 52: 167-174), mientras que An. marajoara se ha señalado como vector principal de malaria en algunas  localidades  mineras  del  municipio  Sifontes del estado Bolívar junto con An. darlingi (Moreno et al., 2005. Op. cit.; 2009, Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 104: 764-768). ]]>  
  Las  recolectas  de  anofelinos  se  realizaron entre Marzo de 2008 y Julio de 2009 en tres localidades del Bajo río Caura, estado Bolívar: comunidad criolla Jabillal  (07°03’N,  64°  58’W)  (municipio  Sucre)  y comunidades indígenas El Palmar (06º 34´53.35”N, 064º  49´35.25”W)  y  Boca  de  Nichare  (06°  36’N, 64° 49’W) (municipio Cedeño). La descripción eco-epidemiológica  y  demográfica  del  área  de  estudio ha  sido  previamente  publicada  (Bevilacqua  et  al., 2009.  Bol.  Mal.  Salud  Amb.  49(1):  53-71;  Medina et  al.,  2011.  Bol.  Mal.  Salud  Amb.  51:  129-144; world  (Diptera:  Culicidae).  Ed.  2,  Entomol.  Soc. Am. (Thomas Say Foundation vol. 6). College Park; Linthicum, 1988. Mosq. Syst. 20: 98-271; Peyton et al., 1992. Mosq. Syst. 24: 51-69].

  Estudios  moleculares,  citogenéticos  y morfológicos han revelado la presencia de complejos  de especies dentro de este subgénero. Así tenemos el Complejo  Oswaldoi  (Marrelli  et  al.,  1999.  J.  Med. Entomol. 36: 679-684; Ruiz et al., 2005. Mem. Inst. Oswaldo  Cruz.  100:  155-160;  Sallum  et  al.,  2008. J. Med. Entomol. 45: 970-9819; Scarpassa & Conn, 2006.  Genet.  Mol.  Res..  5:  493-502),  el  Complejo Albitarsis (Krzywinski et al., 2011. Mol. Phylogenet. Evol. 58: 469-477; Lehr et al., 2005. Ann. Entomol. Soc.  Am.  98:  908-9178;  Merrit  et  al.,  2005.  Mol. Phyl. Evol. 35: 719-724; Motoki et al., 2009. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 104: 823-850; Ruiz et al., 2012. Parasit.  Vectors.  5:  44;  Wilkerson  et  al.,  1995.  J. Med.  Entomol.  32:  697-704),  el  Complejo  Strodei (Sallum et al., 2010. J. Med. Entomol. 47: 504-526) y el Complejo Nuneztovari (Calado et al., 2008. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 103: 791-799; Conn et al., 1993. J. Amer. Mosq. Control Assoc. 9: 294-301; Foster et al., 2013, PLoS ONE 8: e54063. doi:10.1371).
 
  El  Complejo  Albitarsis  incluye  cinco especies  formalmente  descritas:  An.  albitarsis Lynch-Arribálzaga, An. deaneorum Rosa-Freitas, An. marajoara Galvão & Damasceno, An. oryzalimnetes Wilkerson  &  Motoki  y  An.  janconnae  Wilkerson &  Sallum;  tres  especies  recientemente  postuladas, basadas en estudios moleculares (ADNm y ADNr): An.  albitarsis  F  (Brochero  et  al.,  2007.  Amer.  J. Trop.  Med.  Hyg.  76:  1113-1117),  An.  albitarsis  G (Krzywinski et al., 2011. Op. cit.; Ruiz et al., 2012. Op.  cit.)  y  An.  albitarsis  I  (Gutiérrez  et  al.,  2010. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 105: 1019-25; Ruiz et al., 2012.  Op.  cit.),  además  de  un  linaje  mitocondrial, An. albitarsis H (Ruiz et al., 2012. Op. cit.). Rubio-Palis  et  al.  (2003.  J.  Amer.  Mosq.  Control  Assoc. 19:  107-114)  basados  en  estudios  morfométricos  y moleculares  (RAPD-PCR),  habían  señalado  para entonces que An. marajoara era la única especie del Complejo presente en Venezuela; cabe destacar que los estudios morfométricos no reportaron diferencias significativas  entre  las  12  poblaciones  analizadas  y los estudios moleculares confirmaron la presencia de An. marajoara con base al análisis de especímenes de la población de Calabozo, estado Guárico.Rubio-Palis et al., 2010. Bol. Mal. Salud Amb. 50: 95-107).  Para  las  capturas  de  hembras  adultas  se utilizaron trampas Mosquito Magnet Liberty Plus® y en la localidad de Jabillal se realizaron capturas con cebos  humanos,  actuando  los  autores  como  cebos, práctica usual por parte del personal del MPPSalud.

La metodología de captura ha sido descrita en detalle por  Rubio-Palis  et  al.  (2012,  Mem.  Inst.  Oswaldo Cruz. 107: 545-549). Además se realizaron capturas en criaderos previamente caracterizados (Rubio-Palis et  al.,  2010.  Op.  cit.)  con  el  propósito  de  obtener estadios  inmaduros  y  desarrollar  crías  asociadas para  estudios  morfométricos.  Para  dicho  estudio  se incluyeron tanto las hembras silvestres y madres con su progenie asociada de las hembras adultas de An. oswaldoi  s.l.  (n=10)  colectadas  en  cada  localidad.

Para  An.  albitarsis  s.l.  (n=4),  solo  se  contó  con hembras adultas colectadas en Jabillal. Se siguió la metodología  descrita  por  Rubio-Palis  (1998,  Bol. Entomol.  Vzlana.  13:  141-172),  la  cual  consiste  en realizar  mediciones  de  caracteres  del  ala  derecha, patas anteriores y patas posteriores. La morfometría se realizó con un microscopio estereoscópico marca Leica  modelo  MS5  ocular  10x  con  micrómetro (50  div  =  5  mm)  y  zoom  4x.  La  nomenclatura  y abreviaciones  utilizada  es  la  de  Harbach  &  Knight (1980, Taxonomists’ glossary of mosquito anatomy. Plexus Publishing, Inc.) y Wilkerson & Peyton (1990, J. Med. Entomol. 27: 207-224).    ]]>
  Un  total  de  19  especimenes,  10  An. oswaldoi s.l. y nueve An. marajoara s.l. previamente identificados por morfología empleando las claves de Rubio-Palis (2000. Op. cit.) fueron secuenciados para la región código de barras, el cual es un fragmento del gen mitocondrial, Citocromo c Oxidasa subunidad 1 - COI (Hebert et al., 2003. Proc. R. Soc. Lond. B. 270: 313-321). Se utilizaron los cebadores diseñados por Folmer et al. (1994. Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 3: 294-299), para amplificar una región de 710 pares de bases (658 pb sin cebadores) y el ADN fue extraído usando el kit diseñado por QIAgen ®  (DNeasy Blood &  Tissue  Kit,  MD,  USA).  Para  la  amplificación  y secuenciación del ADN, se utilizaron los protocolos previamente  publicados  por  Ruiz  et  al.  (2010.  Op. cit.).  Datos  de  las  secuencias  (cromatogramas, secuencias  y  número  de  acceso  al  GenBank)  están disponibles  en  http://boldsystems.org  (Barcode of  Life  Data  Base  –  BOLD),  proyecto  Mosquito Barcode  Initiative  –  MBI.  Las  secuencias  fueron generadas en ambas direcciones usando el kit de Big Dye y un secuenciador 3730, ambos de PE Applied Biosystems (Warrington, UK). Las secuencias fueron editadas usando Sequencher™ v.4.10.8 (Genes Codes Corporation, MI, USA) y posteriormente analizadas en  MacClade  v.4.06  (Maddison  &  Madison,  2003, Analysis  of  phylogeny  and  character  evolution. Sunderland: Sinauer Associates).

  La  divergencia  genética  entre  las  especies colectadas y especies topotípicas de An. marajoara s.s. y An. oswaldoi s.s., fue calculada en MEGA v. 5  (Tamura  et  al.,  2011.  Mol.  Biol.  Evol.  28:  2731-2739)  usando  Kimura  2-parameter  distance  model (K2P)  (Kimura,  1980.  J.  Mol.  Evol.  16:  111-120) y  posteriormente  un  árbol  de  distancias  genéticas, Bootstrap (Felsentein 1985. Evolution. 39: 783-791) – Neighbor Joining (NJ- K2P) (Saitou & Nei, 1987. Mol. Biol. Evol. 4: 406-425) fue generado en Paup v.  4  (Swofford,  2003.  Phylogenetic  analysis  using parsimony,  version  4.0b  10,  Sinauer  Associates, Sunderland,  MA).  Las  secuencias  obtenidas  fueron comparadas  con  las  secuencias  disponibles  en  el GenBank,  usando  BLAST  -  (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), con el objetivo de buscar similitud con secuencias previamente publicadas.

  Todas  las  secuencias  generadas  en  este estudio  se  encuentran  depositadas  en  el  GenBank con los siguientes números de acceso: An. oswaldoi B  (KC555056,  KC555057,  KC555058,  KC555059, KC555060,  KC555061,  KC555072,  555073,KC555074), An. albitarsis F (KC555063, KC55064, KC555066,  KC555067,  KC555068,  KC555069, KC555070, KC555071), An. braziliensis (KC55062) y An. darlingi (KC555065).

  La Tabla  I  muestra  las  proporciones  de  los caracteres diagnósticos en la vena Costa del ala y en el segundo tarsómero de las patas posteriores de las especies estudiadas. Para An. albitarsis F se encontraron variaciones en la coloración de las escamas claras del ala; en algunos especímenes las escamas claras del ala variaron de blancas en las venas Costa y Subcosta, y el resto color crema, mientras otros especímenes poseían todas las escamas claras de color blanco, a diferencia de  las  demás  especies  del  complejo  en  donde  las escamas por lo general son blancas en la parte anterior de las venas Costa y Subcosta y amarillo pálido en el resto de las venas (Motoki et al., 2009. Op. cit.). El rango  de  variación  para  las  proporciones  PHD/HP y  SCP/L  de  0,22-1,00  y  0,02-0,10  respectivamente (Tabla I), está dentro de los rangos reportados para An. marajoara de Venezuela (Rubio-Palis et al., 2003. Op. cit.). No fue posible comparar estos valores para otras especies del Complejo Albitarsis, puesto que Motoki et al.  (2009.  Op.  cit.)  solamente  midieron  el  tamaño  del ala y el tamaño de las manchas claras y oscuras y no
las proporciones, lo cual resulta inadecuado puesto que el tamaño del ala y de las manchas varía en función de variables  ambientales  y  disponibilidad  de  alimento  en los  criaderos,  entre  otros  (Rubio-Palis,  1998.  Op.  cit.).
]]> Tabla I. Proporciones (media, desviación estandard y rango) de los caracteres diagnósticos en vena Costa del ala y segundo tarsómero de patas posteriores de Anopheles oswaldoi B (n=10) y Anopheles albitarsis especie F (n=4) de Venezuela.

En  cuanto  a  la  proporción  del  tamaño  de  la  mancha oscura  del  segundo  tarsómero  posterior  en  relación  al tamaño  del  tarsómero  (DsTa-III2/Ta-III2)  (Tabla  I),  se observó que la media y rango se solapan con los valores reportados para An. marajoara por Motoki et al. (2009. Op. cit.) y Rubio-Palis et al. (2003. Op. cit.), por lo tanto no es posible utilizando hembras adultas colectadas en el campo diferenciar morfológicamente An. albitarsis F de An. marajoara. Dadas las implicaciones epidemiológicas, resulta  fundamental  realizar  estudios  morfométricos de crías asociadas que incluyan todos los estadios a fin de  determinar  caracteres  diagnósticos  que  permitan diferenciar a An. albitarsis F de las demás especies del complejo, así como ampliar los estudios moleculares a otras regiones del país, puesto que Lehr et al. (2005. Op. cit.) y Ruíz et al. (2012. Op. cit.) confirmaron su presencia al  norte  del  río  Orinoco,  en  los  estados  Portuguesa, Cojedes y Zulia; más aún, existe la posibilidad que otras especies del complejo además de An. marajoara y An. albitarsis F estén presentes en Venezuela.

  Con respecto a An. oswaldoi B, encontramos que los rangos de variación de la longitud de la mancha oscura del segundo tarsómero posterior en relación a la longitud del tarsómero están dentro del rango reportado para An. oswaldoi s.l. (Faran, 1980. Op. cit.), An. oswaldoi s.s. de Brasil (Motoki et al., 2007. Op. cit.) y An. konderi (Flores-Mendoza et al., 2004, Proc. Entomol. Soc. Wash. 106: 118-132) así como para An. oswaldoi s.l. de Venezuela (Rubio-Palis, 2000. Op. cit.). Motoki et al. (2009. Op. cit.) señalan que un carácter diagnóstico confiable para la determinación taxonómica de las especies del Complejo Oswaldoi es mediante el análisis de la forma del ápice del  aedeagus,  al  menos  para  diferenciar  An.  oswaldoi s.s. y An. konderi de otras especies del complejo. En el presente estudio no se contó con especímenes machos a fin de analizar la morfología del aedeagus. Caracteres diagnósticos  que  permiten  diferenciar  An.  oswaldoi s.l., de las demás especies del Subgrupo Oswaldoi tales como  la  proporción  de  la  longitud  de  la  mancha  SCP en relación a la longitud del ala y la proporción de la longitud de la mancha PHD en relación a la longitud de la  mancha  HP  no  han  sido  consideradas  en  revisiones recientes en esta especie (Motoki et al., 2007. Op. cit.),
reportando sólo el tamaño de las manchas, lo cual es muy variable geográficamente y podría depender de variables ambientales (Rubio-Palis, 1998. Op. cit.).

  El  análisis  de  ADN  mitocondrial  (región código  de  barras,  658  pb)  confirma  la  presencia  por primera  vez  en  Venezuela  de  An.  oswaldoi  B,  así como de An. albitarsis F para el estado Bolívar. Dadas las  implicaciones  potenciales  de  las  especies  de  los Complejos Oswaldoi y Albitarsis en la transmisión de los parásitos maláricos, es fundamental en estudios futuros realizar  simultáneamente  estudios  morfométricos  de isofamilias  y  estudios  moleculares  que  permitan  la descripción de estas especies.

  El  análisis  de  la  región  código  de  barras mostró una divergencia genética mayor del 3,2% entre todas las taxas. Anopheles oswaldoi B y An. oswaldoi s.s presentaron una divergencia de 3,2%, mientras que en An. albitarsis F and An. marajoara s.s. esta fue de 5.2%; valores que se encuentran por encima del rango utilizado para delimitación de especies (Hebert et al., 2003. Op. cit.; Ruiz et al., 2010. Op. cit., 2012. Op. cit.). No se detectaron codones de parada a lo largo de las 658 bp analizadas (n = 19 secuencias), descartando la presencia pseudogenes. Cuando se sometieron nuestras secuencias consensos de An. oswaldoi B and An. albitarsis F a las registradas  en  el  GenBank  para  estas  especies,  estas mostraron  una  alta  homología  (98%  -  99%)  con  An. oswaldoi  B  de  Putumayo,  Colombia  (HQ315866  de Ruiz et al., 2010. Op. cit.) y An. albitarsis F de Venezuela y Colombia (JQ15035, JQ615005, JQ615037, JQ5009 y JQ515003; Ruiz et al. 2012. Op. cit.), confirmando la presencia de estas dos nuevas especies para el estado de Bolívar, Venezuela. Los valores de Bootstrap confirman claramente que An. albitarsis F y An. oswaldoi B son diferentes a las topotípicas especies An. marajoara s.s. y An. oswaldoi s.s. (Fig. 1). ]]>
Fig. 1. Árbol filogenético  basado en distancias genéticas (NJ/K2P) de An. oswaldoi B, An. albitarsis F (Bolívar, Venezuela) y secuencias previamente publicadas en el GenBank para la región código de barras:    An.  albitarsis  F  (JQ615035,  JQ615005,  JQ615037,  JQ615009,  JQ615003),  An.  marajoara  s.s. (JQ615455, JQ615459), An. oswaldoi B (HQ315866) y An. oswaldoi s.s. (JF923721, JF923724). Grupos externos:  An.  (Nys)  braziliensis  y  An.  (Nys.)  darlingi  (Bolívar,  Venezuela).  *Secuencias  previamente publicadas por Ruiz et al. (2012. Op. cit.; 2010. Op. cit.). Br: Brasil, Co: Colombia, Vn: Venezuela.

AGRADECIMIENTOS

  A todos los habitantes de El Palmar, Boca de Nichare  (especialmente Aurora  Rodríguez  y  Simón  Caura), y Jabillal (especialmente Ana María Ibañez y  Horacio Vargas) por permitirnos realizar el estudio en  sus comunidades y, conjuntamente con la Dirección  de Salud Ambiental del Estado Bolívar, por facilitar  el  apoyo  logístico.  A  los  vigilantes  entomológicos  comunitarios  entrenados,  por  su  acompañamiento  de  campo:  Héctor  Domínguez  y  Bonifacio.  Este estudio  fue  posible  gracias  al  financiamiento  del International Development Research Centre (IDRC-Canadá)  (Proyecto  103696-006),  Delegación  de  la Unión Europea en Venezuela (DCI-NSAPVD/2008/ 166-318),  Ministerio  del  Poder  Popular  para  la Ciencia,  Tecnología  e  Innovación  (FONACIT-Contrato  Número  200800777,  Sub-proyecto Malaria-Componente  Caura),  National  Institute  of  Health, USA (2R01AI054139 to JEC), Smithsonian Institution, y Walter Reed Army Institute of Research. ]]>