Enzymes and glycoproteins present in extracts of adult Fasciola hepatica worms
Diana E. Ballen1*, Mairym Barrios1, Greslena Aparicio1 & Italo M. Cesari1,2
1 Unidad de Trematodiasis. Centro de Microbiología y Biología Celular. Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas, Altos de Pipe, Apartado 21827, Miranda, Venezuela.
2 Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular do Câncer, Instituto de Bioquímica Médica Leopoldo De Meis, Universidad de Federal do Rio de Janeiro, Brasil.
* Autor de correspondencia: eleanni@hotmail.com
RESUMEN
Fasciola hepatica es un trematodo que causa lesiones en el hígado y vías biliares afectando a herbívoros y al hombre, constituyendo un problema de salud pública en zonas agrícolas a nivel mundial. El parásito posee glicoproteínas y enzimas que facilitan su penetración y migración en los tejidos hospederos. El objetivo fue evaluar estos componentes en extractos [fracción soluble (FS) y fracción particulada (FP)] de vermes adultos de F. hepatica. Las fracciones fueron analizadas para proteínas, carbohidratos, actividades enzimáticas, y por electroforesis (SDS-PAGE-15%) en condiciones no reductoras (NR) y reductoras (R). En FS, la concentración de carbohidratos fue 5,63 μmol/mL; se detectó la presencia de fosfohidrolasas, glicosidasas y peptidasas, sobresaliendo la actividad Fosfatasa Acida (1,19 μmol/h/mg, pH 5,0). En FP, la concentración de carbohidratos fue más elevada (7,89 μmol/mL); se observaron valores elevados de Fosfatasa Alcalina (5,79 μmol/h/mg), Fosfatasa Acida (1,67 μmol/h/mg) y moderados de Fosfodiesterasa (0,280 μmol/h/mg pH 9,6). Se detectó actividad Acetilcolinesterasa mayor en FS que en FP (3,95 A/h vs. 1,68 A/h). En SDS-PAGE ambos extractos mostraron polipéptidos de ~80 a 10-kDa; el pre-tratamiento de las muestras con sodio-metaperiodato redujo el número de bandas en cada extracto, sugiriendo la presencia de glicocomponentes. En conclusión, se hallaron enzimas y glicocomponentes en los extractos de F. hepatica estudiados, lo cual constituye un aporte en la búsqueda de posibles blancos inmunológicos y farmacológicos para el control de esta parasitosis.
Palabras clave: Fasciola hepatica, actividades enzimáticas, glicoproteínas, trematodos.
SUMMARY
]]> Fasciola hepatica is a trematode that causes damage to the liver and biliary tract in both herbivores and man, and is thus an important public health concern in agricultural areas worldwide. This parasite contains glycoproteins and enzymes that facilitate its penetration of, and migration through, host tissues. The aim of this study was to evaluate the relative proportions of these components in the soluble fraction (SF) and n-butanol-solubilized extracts of the particulate fraction (PF) of whole homogenates of adult F. hepatica worms. Extracts were analyzed for protein and carbohydrate content, and hydrolytic activity. In addition, 15% SDS-PAGE electrophoresis was performed under non-reducing (NR) and reducing (R) conditions to identify other components. The SF contained 5.63 μmol carbohydrate/mL, as well as phosphohydrolases, glycosidases and peptidases, with a high acid phosphatase activity (1.19 μmol/h/mg, pH 5.0) that seemed to be characteristic of this fraction. The PF contained 7.89 μmol carbohydrate/mL, with high alkaline phosphatase (5.79 μmol/h/mg) and acid phosphatase (1.67 μmol/h/mg), and moderate phosphodiesterase (0.280 μmol/h/mg pH 9.6) values. Acetylcholinesterase activity was higher in the SF than the PF (3.95 A/h vs. 1.68 A/h). SDS-PAGE analysis showed the presence of polypeptides in both the SF and the PF of ~80 to 10-kDa . Pretreatment with sodium-metaperiodate reduced the number of bands in each extract suggesting the presence of glycocomponents. The notable presence of enzymes and glycocomponents in the SF and PF extracts of adult F. hepatica worms is a first step towards the eventual identification of new immunological and pharmacological targets for the control of this disease.Key words: Fasciola hepatica, enzymatic activity, glycoproteins, trematodes.
Recibido el 05/01/2014 Aceptado el 11/08/2014
INTRODUCCIÓN
La fascioliasis es una enfermedad parasitaria, causada por el helminto trematodo Fasciola hepatica de amplia distribución mundial, que afecta a herbívoros tales como rumiantes, cerdos, equinos, roedores y otros, así como también al hombre (Mas-Coma et al., 2009). A nivel mundial, alrededor de 17 millones de personas se encuentran infectadas y 180 millones están en riesgo de infección, constituyendo un problema de salud pública (WHO, 2010). Los vermes de F. hepatica migran a través de varios tejidos hospederos hasta alcanzar los conductos biliares causando daño hospedero en su desplazamiento. De manera similar a lo hallado en la mayoría de los trematodos, Fasciola sp. posee enzimas, necesarias para su migración, crecimiento, diferenciación, nutrición que le ayudan a adaptarse a su hospedador, y cumplir su ciclo de vida a fin de garantizar su persistencia (Norbury et al., 2011).
Se han identificado y caracterizado enzimas en los productos de excreción-secreción de F. hepatica, algunas consideradas como antígenos en el inmunodiagnóstico de la fascioliasis, otras como candidatas para el desarrollo de vacunas o como proteínas que protegen al parásito de la respuesta inmunitaria del hospedador, entre las cuales destacan: las catepsinas L y D, la tierrodoxina (TRX), la enolasa, la glutatión S-transferasa (GST), la leucina aminopeptidasa (LAP), así como la proteína de unión a ácidos grasos (FABP), la proteína tipo saposina y la superoxido-dismutasa Cu/Zn (SOD-Cu/Zn) (Acosta et al., 2008; Boukli et al., 2011; Dalton et al., 2003; Escalante et al., 2011; Figueroa-Santiago et al., 2011; Farhnaka et al., 2013; Gonzales-Santana et al., 2013; Morphew et al., 2007), y otras con potencial terapéutico en el tratamiento de enfermedades inflamatorias (Robinson et al., 2013).
En los helmintos, el tegumento es una estructura sincicial citoplasmática anucleada que recubre toda la superficie del parásito (Dalton et al., 2004). Es la interfase que ayuda al parásito a mantener su homeostasis, allí ocurre la absorción e intercambio de nutrientes importante para su supervivencia. En el tegumento residen componentes responsables de los mecanismos de evasión de la respuesta inmunitaria y que protegen al parásito contra agentes oxidantes (i.e., enzimas antioxidantes) (Dalton et al., 2004). Dada su importancia en la nutrición y en la evasión de la respuesta inmunológica, algunas proteínas presentes en el tegumento de los trematodos han sido consideradas blancos ideales para el desarrollo de drogas antihelmínticas y de vacunas (Loukas et al., 2007; Meaney et al., 2003; Mulvenna et al., 2010).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar la presencia de glicoproteínas y enzimas en la fracción soluble (FS) y la fracción particulada (FP) obtenidas de los vermes adultos de F. hepatica, con el propósito de facilitar su eventual identificación molecular y evaluación como potenciales blancos de acción contra este parásito. Se realizaron determinaciones enzimáticas a diferentes pH, según protocolos descrito previamente por Cesari et al. (2000), usando curvas de calibración (A405 nm vs. nmol) para interpolar la absorbancia de los grupos p-nitrofenol o p-nitroanilina liberados por la hidrolisis de los respectivos sustratos sintéticos, y se realizaron también análisis del respectivo perfil proteico mediante SDS-PAGE.
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de las fracciones soluble y particulada de vermes adultos de F. hepatica Vermes adultos de F. hepatica fueron resuspendidos en 2 mL de agua milli-Q, agregando inhibidores de enzimas proteolíticas [PMSF (1 mM), Na2-EDTA (1-2 mM), Leupeptina (5-10 μg/mL), Aprotinina (1 μg/mL), Pestatina A (1-15 μg/mL)]. Los parásitos fueron homogeneizados y la suspensión resultante fue ultracentrifugada a 100.000 g por 2 h a 4ºC (Ultracentrífuga Beckman Modelo L8-55). El sobrenadante representó la Fracción Soluble (FS); el sedimento se resuspendió en agua milli-Q, se re-homogenizó y se ultracentrifugó nuevamente bajo las mismas condiciones. El sobrenadante de esta última centrifugación se descartó y el sedimento membranoso o fracción particulada (FP) se resuspendió en 1 mL de agua milli-Q y la suspensión se sometió a un proceso de extracción butanólica.
]]> Extracción de la fracción particulada con n-butanolA 1 mL de FP se le añadió 1 mL de n-butanol saturado con agua (v/v), se agitó vigorosamente por 10 min y la emulsión se centrifugó a 20.000 g/20 min a 4ºC. Se descartó la fase orgánica y se recuperó la fase acuosa, mientras que el material sólido restante en la interfase fue re-extraído con n-butanol. A ambas fracciones se les determinó proteínas por el método de Bradford (1976) y carbohidratos por el método fenol-ácido sulfúrico descrito por Masuko et al. (2005).
Actividades enzimáticas
Las actividades enzimáticas ensayadas fueron: (1) Fosfatasa ácida (FAc, pH 5,0) y Fosfatasa alcalina (FAL, pH 9,6), utilizando p-nitrofenilfosfato (p-NPP) como sustrato. (2) Fosfodiesterasa alcalina (FDE, pH 9,6) con el sustrato 5'-timidina-monosfosfo-p-nitro-ester (5’-TMP). (3) Los sustratos L-leucin y L-α-alanil р-nitroanilida fueron usados para medir las actividades leucina (LAP; pH 8,0) y alanina aminopeptidasa (AAP; pH 8,0) respectivamente. (4) La N-acetil-β-D-glucosaminidasa (β-NAG; pH 5,5) se determinó con p-nitrofenil β-N-acetilglucosaminida y la α-Manosidasa (α-MAN; pH 5,6) con p-nitrofenil α-manósido (Cesari et al., 2000). Las reacciones realizadas a pH ácido y alcalino se detuvieron con 1 N NaOH, excepto las reacciones aminopeptidasas donde se utilizó ácido acético a 2 M. La absorbancia (A) a 405 nm se leyó en un lector de placas SpectraMax 250 (Molecular Devices). Los valores de A405 nm se interpolaron en curvas de calibración de A405 nm vs. nmol de p-nitrophenol [p-NP] o p-nitroanilida [p-NA]. La actividad enzimática fue expresada en términos de micromoles de sustrato hidrolizado por hora [μmol/h], definiéndose a la actividad específica como la actividad referida a la concentración de proteínas (μmol/h/mg). El ensayo para acetilcolinesterasa (AChE, pH 7,6) se realizó a 37ºC empleando como sustrato ioduro de acetilcolina (Ellman et al., 1961). La lectura se hizo a 405 nm y la actividad específica fue expresada como A/h referida a la concentración de proteínas [A/h/mg].
Electroforesis unidimensional en Geles de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
Los componentes proteicos (10 μg) de FS y FP se separaron mediante electroforesis SDS-PAGE al 15% en condiciones no reductoras (NR) y reductoras
(R, con β-mercaptoetanol) según Laemmli (1970). El gel fue teñido con Azul de Coomassie. Se evaluó la presencia de componentes glicosilados en FS y FP, utilizando un kit para detección de glicoproteínas (Immuno-Blot Kit for Glycoprotein Detection. Bio-Rad Nº 170-6490).Análisis Estadísticos
Todos los datos fueron procesados y analizados estadísticamente por Excel (Microsoft® Office®). Todas las actividades enzimáticas fueron reportadas como promedio ± 3 DEM de μmol/h/mg y A/h/mg para la actividad enzimática AChE de 3 experimentos independientes (n = 3).
RESULTADOS
Determinación de carbohidratos en las preparaciones FS y FP de adultos de Fasciola
]]> Se observó mayor presencia de compuestos glicosilados en FP (7,89 ± 0,55 μmol/mL) que en FS (5,63 ± 0,77 μmol/mL).Actividad enzimática en FS y FP
Los resultados indican que en la FP, las actividades enzimáticas FAL (pH 9,6; 5,79 ± 0,718 μmol/mg/h), FAc [pH 5,0; 1,67 ± 0.27 μmol/mg/h] y FDE [pH 9,6; 0,28 ± 0,08 μmol/h/mg] fueron más elevadas que en la FS [FAL, pH 9,6; 0,383 ± 0,18 μmol/mg/h; FAc, pH 5,0; 1,190 ± 0,089 μmol/mg/h; FDE, pH 9,6; 0,028 ± 0,02 μmol/mg/h] (Fig. 1a). Las actividades monoaminopeptidasas LAP [pH: 8,0; 0,299 ± 0,22 μmol/mg/h] y AAP [pH: 8,0; 0,123 ± 0,07 μmol/mg/h] se hicieron presentes solo en FS, mientras que las glicosidasas β-NAG [0,006 ± 0,010 μmol/mg/h] y α-MAN [0,002 ± 0,0 μmol/mg/h] fueron muy bajas en FP que en la FS [β-NAG, pH: 5,6; 0,173 ± 0,04 μmol/mg; α-MAN, pH: 5,6; 0,108 ± 0,06 μmol/h/mg] (Fig. 1a). Con respecto a la AChE (determinada a pH 7,6) fue mayor en FS [3,95 A/h/mg] que en FP [1,68 A/h/mg] (Fig. 1b).
1D SDS-PAGE (15%)
Perfil de proteínas: Se observaron bandas en FS [NR y R] con masa molecular comprendida entre 62 y 10 kDa (Fig. 2, carril 1 y 2). Las bandas NR detectadas en FS fueron de 62, 60, 48, 45, 38, 36, 32, 25, 24, 21, 15, 14, 13 12, 11 y 10 kDa (carril 1); luego de reducción, la mayoría de las bandas continuaron viéndose como tal en el gel pero con intensidad variable, excepto las de 62, 48 y 32 kDa que desaparecieron, apareciendo una banda de 40 kDa (carril 2).
En geles 1D de FP en condiciones NR (Fig. 2, carril 3), se observó un patrón más simple de aproximadamente 10 bandas en el intervalo de 120 a 10 (~ 120 kDa, 86, 66, 62, 44, 38, 32, 25, 24, 10). Luego de reducción (Fig. 2, carril 4), continuaron observándose las bandas de 62, 38, 32, 25 y 10kDa pero con intensidad variable, desapareciendo las bandas de alto p.m., las de 44 y 24 kDa, y apareciendo una banda de 21 kDa.
Perfil de glicoproteínas: Después de tratamiento de la FS con el kit para detección de glicoproteínas (Immuno-Blot Kit for Glycoprotein Detection), bajo condiciones NR (Fig. 3a, carril, 2), se observaron bandas de aprox. 64, 60, 42, 25, 23, 14 y 12 kDa; luego de reducción, se continuaron viendo las mismas bandas pero con intensidad variable; aparecieron bandas de 50, 39 y 28 kDa (carril, 4) y desaparecieron las de 64, 42 y 23 kDa (Fig. 3a, carril, 4). Los carriles 1 y 3 corresponden a la FS no tratada con el kit (Fig. 3a). En FP, tanto en condiciones NR como en R (Fig. 3b, carril 6 y 8), se detectaron bandas de 66, 60, 45, 42 y 32 kDa, excepto que en FP (R) aparecieron bandas de 39, 25 y 24 kDa (carril 8). Los carriles 6 y 7 corresponden a la FP no tratada con el kit (Fig. 3b).
La expresión y secreción de enzimas en los parásitos es de importancia fundamental en los procesos de invasión, nutrición, desarrollo, adaptación, virulencia, evasión y modulación inmune del hospedador por parte del parásito, todo lo cual ha sido descrito en Fasciola sp. (McVeigh et al., 2012; Norbury et al., 2011). En el presente estudio, reportamos la presencia diferencial de enzimas y glicocomponentes en las fracciones subcelulares soluble (FS) y particulada (FP) de vermes adultos de F. hepatica. Las actividades enzimáticas que se mostraron más relevantes en términos cuantitativos fueron las fosfomonoesterasas, estando la FAL (pH 9,6) y la FAC (pH 5,0) bastante elevadas en FP. El haber encontrado actividades con pH óptimo diferentes en la misma fracción se podría explicar porque el sedimento a 100 000 x g contiene tanto fragmentos de membrana plasmática del tegumento de estos
trematodos (sede usual de las enzimas que trabajan in vitro a pH alcalino) como fragmentos intracelulares de membrana que delimitan compartimentos ácidos y organelas enteras como los lisosomas (sede usual de enzimas catabólicas que funcionan a pH ácido). Las proteínas unidas a membrana se extrajeron utilizando el solvente orgánico n-butanol, que desnaturaliza y despolimeriza la mayor parte de proteínas de membrana sin afectar completamente aquellas que poseen cierto grado de glicosilación (glicoproteínas), muchas de las cuales logran preservar su estructura, función catalítica y antigenicidad después de este proceso, como ha sido demostrado en S. mansoni (Cesari et al., 2005; 2002).Hasta ahora no hemos encontrado descripción de actividad FAL asociada con preparaciones membranosas de
Fasciola sp. Por otra parte, la actividad FAc hallada en FS concuerda con resultados reportados por Probert & Lwin, (1974) quienes detectaron alta actividad FAc [pH 4,5 - 5,0] y baja actividad FAL [pH 9,0] en extractos solubles y fracciones subcelulares (mitocondrial y lisosomal) de F. hepatica. Los estudios realizados con S. mansoni han reportado que la FAL está asociada con fracciones membranosas de la cercaría, esquistosómulos, vermes adultos, particularmente en la superficie, donde parece jugar un papel importante en la invasión y adaptación del parásito al hospedador (Araujo-Montoya et al., 2011; Cesari et al., 1981; Fernández & Cortéz, 2002), y es considerada candidata a ser ensayada como vacuna contra la esquistosomiasis mansoni (Sulbaran et al., 2013). Se observó actividad Fosfodiesterasa alcalina (FDE) más elevada en FP que en FS. Esta enzima, hasta ahora con función desconocida en este parásito, fue detectada en extractos solubles de F. hepatica (Mansour & Mansour, 1979). La FDE hidroliza enlaces fosfodiésteres y es estimulada por cloruro de magnesio y calcio, formando parte del sistema de enzimas (junto con FAL y difosfohidrolasa) de recuperación de bases nucleotídicas (Braschi & Wilson, 2006; Cesari et al., 1992).No se observaron actividades monoaminopeptidasas en FP; pero en FS, se detectaron actividades de α-AAP (la cual libera preferiblemente alanina), y LAP (que libera leucina). Acosta et al. (1998) describieron actividad LAP en un extracto soluble de F. hepatica y su actividad se observó asociada principalmente con las células del tracto digestivo, lo cual concuerda con la actividad LAP hallada en FS. Por otra parte, la LAP forma parte de los productos de excreción-secreción de F. hepatica y es considerada un marcador de diagnóstico por ser un antígeno inmunodominante en esta fracción (Marcilla et al., 2008); además, es capaz de inducir protección contra la fascioliasis en animales (Acosta et al., 2008).
Las actividades glicosídicas N-Acetil-β-Glucosaminidasa (β-NAG) (que degradan oligosacáridos unidos por enlaces tipo-N, como en la mucina) y α-manosidasa (α-MAN), enzimas de origen lisosomal, solo se detectaron en FS. Hasta ahora, no hemos visto reportes de éstas actividades en Fasciola sp.; sin embargo, estudios realizados por Irwin et al. (2004) describieron la presencia de β-glucosaminidasa, β-galactosidasa y β-hexosaminidasa en productos de excreción-secreción de F. hepatica, extrapolando estar probablemente involucradas en la degradación de azúcares y glicoproteínas hospederas durante la penetración en los tejidos del hospedador y en la digestión de glicoproteínas que sirven para su nutrición. En el trematodo Paragonimus westermani, la actividad β-NAG se halló elevada en FS, siendo en este caso ser una enzima probablemente relacionada con la necesidad de degradar los numerosos sustratos glicosilados comúnmente presentes en las secreciones pulmonares, su hábitat natural (Gómez et al., 2010). La α-MAN, también involucrada en la degradación de mucinas, fue igualmente detectada en esta fracción de P. westermani (Gómez et al., 2010).
En el presente trabajo, la actividad AChE fue más marcada en la FS que en la FP, lo cual concuerda con los reportado por Frady & Knapp (1967), quien detectó esta actividad en extractos solubles de la etapa adulta de Fasciola sp. Arnon et al. (1999) hallaron esta enzima asociada al tejido muscular y en la superficie del tegumento de S. mansoni ayudando
a la adquisición de glucosa como nutriente para la supervivencia del parásito.Los estudios realizados en FS y FP mediante análisis por SDS-PAGE, en condiciones reductoras y no reductoras, mostraron la presencia de proteínas comunes en ambas fracciones, identificadas con las masas moleculares de: 62, 45-44, 38, 32, 25, 24, 21 y 10 kDa. Éstos resultados concuerdan, y además se ven reforzados, con los estudios de Meshgi
et al. (2008) obtenidos con una preparación de antígenos somáticos de adultos de F. hepatica en la cual se caracterizó el perfil de proteínas, reportando bandas de aprox. 62, 46, 36, 33y kDa. De manera semejante, De Almeida et al. (2007) observaron en un extracto soluble del parásito, luego de SDS-PAGE (15%) y WB bajo condiciones reductoras (R) y no reductoras (NR), bandas de 66, 45, 21, 12, 11, 10 y 9 kDa; estos autores reportaron además un reconocimiento especifico de antígenos de 57, 46-44, 38, 10, 9 y 8 kDa en FS por sueros de pacientes infectados, considerado relevante para el diagnóstico de ésta enfermedad parasitaria.En el presente trabajo, se halló mayor contenido glicosidico en la FP que en FS. El tegumento
de F. hepatica es de naturaleza sincicial cubierto de un glicocalix, contiene numerosas mitocondrias y vesículas secretoras, y está delimitado por dos capas membranosas de 12 nm (Threakdgold, 1976). En F. hepatica, el tegumento es una de las regiones de contacto del parásito con el medio que lo rodea y por lo tanto constituye una de las interfases entre el parásito y el hospedador, siendo la otra interfase la mucosa intestinal que recubre el aparato digestivo de estos parásitos. Se encuentra involucrado en la renovación de la membrana externa, nutrición (mediante la internalización de moléculas), modulación, secreción, transducción de señales y en la evasión inmune (Wilson, et al., 2011). Sin embargo, a pesar de varios estudios de proteómica en diferentes preparaciones de F. hepatica, incluyendo tegumento y secreciones, publicados recientemente (Haçariz, et al., 2014., Morales & Espino, 2012., Wilson, et al., 2011), no hemos podido encontrar aún información sobre las enzimas y los componentes que fueron objeto del presente estudio, los cuales, podrían ser de importancia funcional para el parásito y también para la respuesta inmunológica, pudiendo quizás ser eventuales blancos para el desarrollo de drogas y vacunas.Debido a la selectiva resistencia a la desnaturalización por n-butanol de glicoproteínas, asumimos en consecuencia que la mayoría de las moléculas que observamos en FP, luego de SDS-PAGE, está glicosilada. Usando un kit para la tinción de glicoproteínas, pudimos de hecho demostrar la mayoritaria presencia de bandas glicosiladas en los perfiles electroforéticos de FS y en el extracto butanólico de FP. En esta ultima fracción, entre las bandas fuertemente detectadas llama la atención, el componente de 42 kDa. La banda de 42 kDa podría corresponder a la actina, una proteína muy conservada entre especies con masa molecular de 45-42 kDa. En F. hepatica, los filamentos de actina están localizados en el tegumento del parasito adulto (Tansattit et al., 2006), y es considerada candidata potencial para vacuna contra la fascioliasis (Boukli et al., 2011).
Los resultados descritos en el presente trabajo muestran la presencia de actividades enzimáticas y glicocomponentes en las FS y FP de vermes adultos de F. hepatica. Las actividades enzimáticas FAL y FAc fueron las más relevantes en la FP, siendo la actividad FAL muy alta en esta fracción. Aunque la relevancia de la presencia y/o ausencia de cada componente glicosídico y enzimático en F. hepatica aún no está completamente definida, los componentes descritos, deben ser estudiados con mayor profundidad hasta confirmar su identidad molecular ya que podrían ofrecer posibles blancos para el entendimiento de la interacción parásito-hospedador, de intervención inmunológica y/o farmacológica, así como constituirse en antígenos con alta sensibilidad y especificidad para el inmunodiagnóstico de la fascioliasis.
]]> CONFLICTO DE INTERESESLos autores declaramos que no existen conflictos de intereses en la realización de este
trabajo.AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Douglas Oliva quien obtuvo los gusanos adultos de
Fasciola hepatica a partir de los conductos biliares de hígados infectados de ganado que llegaron al matadero Industrial de Paraguaná, Bel C.A, Yaracal- Edo. Falcón, y gentilmente nos los donó.REFERENCIAS
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