Oswgladys Garrido1,2, Teresa Gárate3 & Elizabeth Ferrer1,4
1 Instituto de Investigaciones Biomédicas "Dr. Francisco J. Triana Alonso" (BIOMED), Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Sede Aragua, Maracay, Venezuela.
2 Departamento de Bioquímica, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo, Valencia, Venezuela.
3 Servicio de Parasitología, Centro Nacional de Microbiología, Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España.
4 Departamento de Parasitología, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad de Carabobo Sede Aragua, Maracay, Venezuela. *Autor de correspondencia: elizabeth.ferrer@gmail.com
RESUMEN
La neurocisticercosis es una enfermedad neurológica causada por la presencia de cisticercos de Taenia solium en el sistema nervioso central. La clonación de genes del parásito es importante para la identificación y estudio de moléculas claves en la biología del parásito, en diagnóstico, protección y en las relaciones parásito-hospedador. En T. solium, ocurre un mecanismo alternativo en el procesamiento de algunos ARNm, denominado trans-splicing, en el cual una pequeña molécula de ARN (Spliced Leader, SL) es añadida al extremo 5´ de una molécula de pre-ARNm, formando diferentes ARNm maduros que contienen un extremo 5´ común. El objetivo de este trabajó fue realizar el análisis de las secuencias de algunas moléculas que utilizan este procesamiento, para conocer mejor este mecanismo en T. solium. Para ello, se realizó un cribado mediante PCR de genotecas de expresión de cisticerco de T. solium utilizando como cebador directo SL y como reverso ZAP-3´UP, oligonucleótido que hibrida con la secuencia del vector. Se obtuvieron diferentes ADN complementarios (ADNc), que fueron clonados en el plásmido pGEM-T-easy, secuenciados y comparados con las bases de datos (GenBank). Un total de 14 moléculas diferentes fueron obtenidas, las cuales muestran similitud principalmente con proteínas de T. solium, Echinococcus sp. e Hymenolepis sp. Se obtuvieron transcriptos completos que codifican una variedad de proteínas que forman parte de la biología propia de organismos vivos, tales como; enzimas, transportadores, proteínas estructurales, entre otras. Aunque no fue posible determinar si existen grupos específicos de ADNc (con funciones comunes), escogidos para llevar a cabo esta modificación post-transcripcional, se pudo observar que el proceso de trans-splicing ocurre en una gran variedad de ARN que codifican diferentes proteínas de importancia biológica para T. solium.
Palabras clave: T. solium, secuenciación, Spliced Leader, trans splicing.
Sequences analysis of molecules of Taenia solium post-transcriptionally processed by trans-splicing
]]> SUMMARYNeurocysticercosis is a neurological disease caused by the presence of Taenia solium cysticerci in the central nervous system. T. solium uses an alternative mechanism for processing some mRNAs, known as trans-splicing, in which a small RNA molecule (Spliced Leader, SL) is added to the 5' end, of one pre-mRNA molecule, leading to the formation of different mature mRNAs that all contain a common 5' end. The aim of this study was to analyze the sequences of some of the molecules that undergo this type of post-transcriptional processing in order to learn more about this mechanism in T. solium. Expression libraries of T. solium cysticerci were screened using PCR with SL as the forward primer and ZAP 3' UP, an oligonucleotide that hybridizes to the vector sequence, as the reverse primer. Different cDNAs were obtained which were cloned in the pGEM-T-easy plasmid, sequenced and then compared with sequences in databases (GenBank). A total of 14 different molecules showing similarities to T. solium, Echinococcus sp. and Hymenolepis sp. proteins were obtained. Complete transcripts encoding a variety of proteins that are part of the biology of living organisms, such as enzymes, transporters and structural proteins, were also identified. Although we could not determine whether specific cDNA groups (with common functions) are selected to carry out this post-transcriptional modification, we were able to observe that the process of trans-splicing occurs in a variety of RNAs that code for several proteins biologically important for T. solium.
Key words: T. solium, sequencing, Spliced Leader, trans splicing.
Recibido el 23/10/2014 Aceptado el 04/05/2015
INTRODUCCIÓN
La teniasis/cisticercosis son enfermedades producidas por los parásitos Taenia solium y T. saginata; en las cuales el hombre es el hospedador definitivo del estadio adulto y el ganado porcino y bovino son los hospedadores intermediarios del estadio larvario, respectivamente. La teniasis ocurre en el hombre por la presencia del parásito adulto en el intestino y la cisticercosis ocurre como consecuencia de la infección por el estadio larvario de los parásitos (cisticerco) en los hospedadores intermediarios y en el hombre cuando de forma accidental ingiere los huevos de T. solium en alimentos y aguas contaminadas (Botero & Restrepo, 2012).
Cuando los cisticercos invaden el Sistema Nervioso Central (SNC) se produce la neurocisticercosis (NCC), un problema de salud pública, no solo en países en vías de desarrollo, sino también en Estados Unidos y en algunos países europeos por migraciones de personas proveniente de áreas endémicas (Bruno et al., 2013; Zammarchi et al., 2013; Cantey et al., 2014; Ferrer & Gárate, 2014; Moyano et al., 2014). En Venezuela se han realizado pocos estudios epidemiológicos, por lo que no se conoce la prevalencia de la enfermedad en el territorio nacional. Por trabajos de varios grupos de investigación se sabe que la cisticercosis se encuentra principalmente en zonas rurales de los Estados Carabobo, Yaracuy, Lara, Cojedes, Mérida, Táchira, Zulia, Sucre y Amazonas (Alarcón de Noya & Colmenares, 2002; Ferrer et al., 2002, 2003, 2005; Guzmán et al., 2004; Meza et al., 2005; Villalobos et al., 2007; Cortez et al., 2010).
La cisticercosis es una enfermedad que afecta a 50 millones de personas en el mundo y causa 50.000 muertes anuales. El binomio teniasis/cisticercosis ha sido por mucho tiempo parte de las enfermedades olvidadas, pero se han producido iniciativas importantes para su control y se las considera como enfermedades potencialmente erradicables (Schantz et al., 1993). En este sentido, se ha realizado una propuesta para declarar a la neurocisticercosis como una enfermedad de denuncia obligatoria (Román et al., 2000) y la OMS la añadió a la lista de las principales enfermedades tropicales desatendidas en el 2010 (OMS, 2013).
Para el diagnóstico de la NCC se deben analizar los hallazgos clínicos, inmunológicos y de neuroimágen, ya que muchas veces la enfermedad puede pasar desapercibida debido a que puede cursar asintomática o con síntomas inespecíficos. Las técnicas de neuroimágenes presentan limitaciones cuando el número de cisticercos es bajo, además, estas técnicas son costosas y de difícil acceso en la mayoría de las áreas donde la cisticercosis es endémica (Del Brutto, 2005). Las pruebas inmunológicas son de gran importancia en el diagnóstico de NCC, pero pueden carecer de adecuada especificidad debido a reactividad cruzada con otras parasitosis (Gottstein et al., 1987). Para mejorar la especificidad de las pruebas inmunológicas, se han utilizado antígenos purificados, los cuales han mostrado buena sensibilidad y especificidad (Tsang et al., 1989; Ng & Ko, 1994), sin embargo, la purificación de éstos requiere gran cantidad de material parasitario, de equipos sofisticados y técnicas laboriosas, por lo que se ha recurrido a la clonación de genes de interés diagnóstico (Ferrer, 2007).
La clonación de genes hace posible la obtención de proteínas recombinantes para su uso en diagnóstico o protección (vacunas) y además para el estudio de moléculas importantes en la biología del parásito. Para la clonación de los genes generalmente se requiere del conocimiento de las secuencias de los mismos, esto ha sido solventado con algunas estrategias de clonación.
]]> Hace años fue descubierto en el extremo 5` de ARNm codificantes de glicoproteínas de superficie de Trypanosoma brucei un secuencia de ARN no traducible común, a una la cual se le conoció como Spliced Leader (SL) (Sather & Agabian, 1985); esta molécula es insertada en los pre-ARNm mediante un mecanismo conocido como trans-splicing, formando diferentes ARNm maduros que contienen un extremo 5´ común. Después de este primer reporte, el mecanismo ha sido descrito en una gran diversidad de organismos, entre ellos nemátodes, tremátodes y céstodes (Bitar et al., 2013).Aunque en el género Trypanosoma todos los ARN sufren esta modificación post-transcripcional, en los demás géneros la mayoría de los transcriptos no sufren trans-splicing, y se desconoce cuáles son las características de las moléculas de ARNm inmaduro que las seleccionan para sufrir esta modificación (Liang et al., 2003).
La caracterización del gen Spliced Leader de cisticercos de T. solium fue realizada empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés, Polymerase Chain Reaction) con cebadores degenerados dirigidos contra secuencias conservadas 5´ y 3´ del SL de Echinococcus y tremátodes y utilizando como molde ADN aislado a partir de cisticerco de T. solium (Brehm et al., 2000, 2002).
La estrategia de clonación empleando la secuencia SL conocida y secuencias de un vector ha permitido la clonación de ADN complementarios (ADNc) (secuencias codificantes formadas por transcripción reversa de ARNm del parásito), a partir de genotecas de expresión de cisticercos de T. solium (Brehm et al., 2002; Garrido et al., 2012).
El propósito del presente trabajo fue secuenciar y caracterizar mediante análisis bioinformáticos 30 ADNc de cisticercos de T. solium previamente obtenidos a partir de una genoteca de expresión empleando la PCR utilizando como cebadores el SL y una secuencia del vector, a fin de clonar moléculas que fueron secuenciadas y analizadas, con la finalidad posterior de tratar de determinar su posible utilidad como antígenos, vacunas, blancos terapéuticos o que ayuden a entender mejor la biología del parásito y las relaciones parasito-hospedador. Además, tratar de identificar las características que presentan los ARNm que llevan a cabo el procesamiento de trans-splicing. Es un trabajo preliminar donde se demuestra la utilidad del uso de la secuencia del SL en la estrategia de clonación, lo que ha permitido identificar algunas de las moléculas que emplean este mecanismo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Biológico
Se contaba con 56 clones de ADNc de cisticerco de T. solium, previamente obtenidos a partir de una genoteca de expresión empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando como cebador directo TSSL-DW2 (5´-GGTCCCTTACCTTGCAATTTTGT-3´), específico de la secuencia SL de T. solium diseñado previamente por Brehm et al. (2002) y como cebador reverso ZAP-3´UP (5´-GTAATACGACTCACTATAGGG-3´), específico del vector Uni-λZAP® XR (Fig. 1) e incorporados en el vector de mantenimiento pGEM®-T easy (Garrido et al., 2012).
Extracción y purificación del ADN plasmídico
]]> El ADN plasmídico de cada uno de los clones fueron extraídos de las células de mantenimiento que los albergaba E. coli XL1-Blue MRF´, mediante la ruptura de las células por lisis alcalina y la purificación de los mismos se llevó a cabo empleando las técnicas de fenol-cloroformo y precipitación salina (Sambrook & Russel, 2001).Secuenciación
La secuenciación de los insertos clonados en el vector pGEM®-T -easy se realizó mediante el método enzimático (Sanger et al., 1977), a partir de ADN plasmídico extraído y purificado, utilizando los cebadores universales correspondiente al vector SP6 (5´-GATTTAGGTGACACTATAG-3´) y T7 (5´-TAATACGACTCACTATAGGG-3´) y siguiendo el protocolo de reacción Big-Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI-3130XL, Applied Biosystems). La secuenciación propiamente dicha se llevó a cabo en la unidad de genómica del Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, Madrid, España.
Análisis bioinformático de las secuencias
Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias depositadas en los bancos de datos; GenBank/algoritmo BLAST (Altschul et al., 1990), EMBL/algoritmo FASTA (Pearson & Lipman, 1988) y Swiss-Prot (Boeckmamm et al., 2003). Para la búsqueda del marco abierto de lectura se utilizó el programa GENSCAN (Burge & Karlin, 1998). La alineación múltiple de secuencias se llevó a cabo utilizando el programa ClustalW del EMBL (Thompson et al., 1994) y la edición de los mismos con el programa BioEdit 5.0.9 (Hall, 1999). La traducción a secuencia de aminoácidos se realizó con el programa EditSeq del paquete DNAstar de Lasegene®.
RESULTADOS
Análisis de las secuencias
De los 56 clones con los que se contaba, se lograron secuenciar 33, de los cuales, 3 fueron secuencias de β galactosidasa de la región lacZ del vector pGEM®-T easy, por lo que no fueron tomadas en cuenta para efecto de este estudio. Al resto de las secuencias de ADNc obtenidas (30) se les realizó alineamiento múltiple de secuencias, encontrándose 14 moléculas distintas, ya que algunas moléculas estaban repetidas (varios clones idénticos que formaron grupos de la misma secuencia). El primer grupo formado por 6 clones idénticos, el segundo por 5, el tercero por 3, del 4 al octavo estaban formados por dos clones idénticos, y las siguientes moléculas correspondían a clones únicos (Tabla I). En cuanto al número de nucleótidos de las secuencias clonadas, se obtuvieron moléculas entre 309 y 938 nucleótidos (nt), con marcos abiertos de lectura (ORF, del inglés Open Reading Frame) entre 201 y 636 nt, que codifican proteínas entre 66 y 211 aminoácidos (aa) (Tabla I).
De los grupos se obtuvieron las secuencias consenso, las cuales se analizaron al igual que las secuencias individuales. Se pudo observar que las secuencias de 9 moléculas se encuentran completas desde la región SL hasta la señal de poliadenililación, en las cuales se pudo determinar la ubicación del marco abierto de lectura y la secuencia aminoacídica deducida. En 4 moléculas las secuencias se encontraban incompletas en algunos de los extremos 5´ o 3´ e incluso ambos (en dos de ellas faltó la parte media de la secuencia por lo que no se pudo determinar el ORF), en otro caso, aunque la secuencia se encontraba completa desde la región SL hasta la secuencia poliA no se encontró ORF (Tabla I). Sin embargo, se encontró una característica común en todas las secuencias consensos y únicas y es que en todos los casos la secuencia del SL se encuentra inmediatamente antes de un codón ATG (SL-ATG), aunque no siempre este funcionase como ATG de inicio.
]]> Al realizar la comparación con las secuencias depositadas en las bases de datos (GenBank/EMBL/Swiss-Prot), la mayoría de las secuencias fueron similares a ADNc codificantes de proteínas de parásitos de los géneros Taenia, Echinococcus, Hymenolepis y Schistosoma, un solo clon no presentó similitud alguna con moléculas ya descritas. Se identificaron transcriptos completos que codifican proteínas típicas del metabolismo de organismos vivos, tales como; factores de transcripción, proteína activadora de GTPasas, proteínas de unión a ATPasa de membrana, enzimas nucleósidos trisfosfato kinasa, proteínas del sistema ubiquitina, y proteínas ribosomales (Tabla II).
En la Fig. 2, se observa el alineamiento múltiple de secuencias de uno de los grupos más grandes formados (6 clones) que presentó similitud con un factor de transcripción nuclear y está compuesto por 529 nucleótidos (nt), el marco abierto de lectura está conformado por 288 nt y se observa la presencia en el extremo 5` de la secuencia del cebador SL de 23 nt, y la región de poliadenililación en el extremo 3´.
DISCUSIÓN
El mecanismo Trans-splicing ocurre en pocos phyla de células eucariotas, entre los que se encuentran euglenozoa, nematoda, platyhelminthes, chordata, rotifera, dinoflagellata y cnidaria (Bitar et al., 2013). En el phylum nematoda ya ha sido descrito que ocurre este mecanismo principalmente en los géneros Caenorhabditis, Ascaris (Bektesh & Hirsh, 1988; Nilsen et al., 1989) y Toxocara (Gems et al., 1995), mientras que en los platyhelminthes se ha descrito principalmente en los géneros Echinococcus, Taenia (Brehm et al., 2000, 2002) y Schistosoma (Rajkovic et al., 1990; Mourão et al., 2013). La presencia del SL en una molécula de ARNm se ha asociado a una mayor estabilidad del mensajero, pues el SL, lo provee de la caperuza 5´ de trimetilguanosina (TMG) (Piecyk et al., 2012); se ha asociado también al procesamiento de grandes ARNm policitrónicos en varios ARNm individuales (Blumenthal, 1995) y a la regulación de la traducción en algunos organismos (Zeng et al., 1990).
Este rasgo ha sido utilizado en diferentes investigaciones con el objetivo de buscar, a partir de ARN por transcripción reversa a ADNc, o de genotecas de ADNc, nuevas moléculas que sean de interés en estos organismos que llevan a cabo este mecanismo post-transcripcional (Gems et al., 1996; Brehm et al., 2002; Fernández & Maizel, 2009, Mourão et al., 2013; Pettitt et al., 2014). En este estudio se obtuvieron un conjuntos de secuencias de clones de ADNc codificantes de proteínas de cisticercos de T. solium empleando la misma estrategia.
Al comparar las secuencias obtenidas de todos los clones con las depositadas en la base de datos GenBank, se obtuvieron elevados porcentajes de similitud (del 96 al 100%) con proteínas del propio parásito T. solium y de parásitos de géneros cercanos, siendo el género Echinococcus con el que se obtuvo el mayor porcentaje de similitud, seguido de Hymenolepis, ambos céstodes y Schistosoma (tremátode), lo cual era de esperarse debido a la cercanía evolutiva de estos géneros con Taenia, ya que todos pertenecen al phylum Platyhelminthes.
No se observaron patrones comunes en las funciones biológicas de las posibles proteínas codificadas por estos transcriptos, las cuales estarían involucradas en procesos celulares tan diferentes como transcripción (1, 13), señalización celular (3 y 4), traducción (5), transporte de lípidos (6), metabolismo de nucleótidos (7), cadena de transporte de electrones (12) y enzimas que actúan en diversos procesos (9, 11). Sin embargo, tal como Brehm et al. (2002) demostraron en su trabajo, existe hasta cierto punto patrones comunes entre los transcriptos de estos miembros de familias cercanas y es que todas las moléculas encontradas están involucradas en procesos imprescindibles para la supervivencia del parásito (genes house-keeping).
Es de resaltar que no se encontraron moléculas posiblemente implicadas en las relaciones inmunológicas parásito-hospedador, tales como posibles antígenos o moléculas involucradas en mecanismos de evasión de respuesta inmune, quizás los 3 casos de las proteínas hipotéticas de función desconocida (2, 8, 10) y la que no presentó similitud con ninguna otra (14) pudiesen ser proteínas muy específicas de Taenia involucradas en estas relaciones.
]]> De los 30 clones secuenciados, 20% (6) codifican un factor de transcripción nuclear y 10% (3) una proteína asociada a ATPasa de membrana, lo que pudiera sugerir que los ARNm que predominantemente llevan a cabo este mecanismo post-transcripcional sean factores de transcripción y proteínas del sistema ATPasa o quizás los genes codificantes de estos transcriptos son abundante en el genoma del cisticerco de T. solium. De igual manera se estima que solo el 25% de los ARNm de E. granulosus llevan a cabo trans-splicing (Fernández et al., 2002), dato que pudiera ser similar en Taenia debido a la cercanía de ambos géneros.Todas las secuencias obtenidas presentaron una característica en común y es que luego de la secuencia SL inmediatamente continuaba un codón ATG (SL-ATG), aunque no siempre este funcionase como ATG de inicio, hallazgo común con los resultados obtenidos por Brehm et al. (2002), quienes clonaron ADNc de cisticercos de T. solium empleando una PCR con cebador directo TSSL-DW2 y obtuvieron 35 clones, los cuales presentaron la secuencia SL inmediatamente antes del ATG, lo que confirma que los ADNc clonados derivan del empalme del SL y no ocurrió una unión inespecífica del cebador durante la fase hibridación en la PCR. Sin embargo, en nuestro caso SL-ATG fue el punto de partida de la traducción del 55,5% (5/9) de los grupos formados, en el resto de los grupos el ATG de inicio se encontraba entre 5 a 59 nt después de la secuencia SL, lo cual es similar a los resultados obtenidos por Fernández et al. (2002) durante un estudio en el que realizaron la amplificación de transcriptos de E. granulosus por PCR utilizando un cebador SL de E. multilocularis y en donde obtuvieron que el 43% de los transcriptos tenían como punto de inicio de la traducción el codón SL-ATG, mientras que en E. granulosus el 50% de los transcriptos obtenidos por Brehm et al. (2000) muestran el SL-ATG como codón de inicio. Igualmente, Zheng et al. (2008) obtuvieron diferentes tamaños de la secuencia 5´ UTR después del SL cuando realizaron transcripción reversa sobre ARN de cisticerco de T. solium empleando como cebador la secuencia SL del parásito. Todo esto demuestra que esta secuencia, SL-ATG, aunque es un rasgo conservado en familias de proteínas de miembros homólogos (Brehm et al., 2000) y un potencial punto de partida de la traducción no en todo los casos la traducción se inicia desde allí.
De los clones secuenciados 2 codifican proteínas de unión a Apolipoproteína A-I, proteína que funciona como cofactor para la enzima Lecitina Colesterol Acil transferasa (LCAT) que se encarga de esterificar el colesterol libre que adquiere la High-density lipoprotein (HDL), este hallazgo tiene relación con la biología del parásito ya que los céstodes son incapaces de sintetizar de novo lípidos como el colesterol y los ácidos grasos, y deben adquirirlos del hospedador durante la infección ya sea para que formen parte estructural de las membranas o como generadores de energía por β-oxidación peroxisómica, por lo que el sistema de transporte de los lípidos debe estar bien desarrollado (Bernthaler et al., 2009).
Aunque algunas investigaciones han demostrado que todas las moléculas de Spliced Leader presentan similitud estructural y funcional (Bitar, 2013) y ya es conocido el mecanismo complejo por el cual se lleva a cabo el trans-splicing (Lasda & Blumenthal, 2011), aún se desconoce las características estructurales y funcionales que presentan los ARNm que llevan a cabo este mecanismo. Sin embargo, como se demostró en este estudio los ARNm que contiene SL codifican proteínas de funciones muy variadas y es posible que exista patrones conservados entre las secuencias de los transcriptos que llevan a cabo trans-splicing de Taenia solium y las de los otros parásitos platelmintos cercanos.
Es evidente que se requieren diversos estudios en los diferentes phyla para poder comprender mejor estos mecanismos tan importantes para la supervivencia del parásito. Este es un trabajo preliminar donde se demuestra el éxito de la estrategia de clonación empleada y se logró identificar algunas de las moléculas que emplean este mecanismo. Estudios posteriores necesarios en esta línea de investigación estarían orientados a tratar de determinar las posibles funciones de estas moléculas en la biología del parásito y las relaciones parásito-hospedador.
Conflicto de intereses
Los autores manifiestan que no hubo conflicto de intereses con persona o institución alguna en ninguna de las etapas de ejecución de este trabajo.
AGRADECIMIENTO
Agradecemos al Servicio de Genómica del Instituto de Salud Carlos III, Madrid-España, por su colaboración con las reacciones de secuenciación que se realizaron en este estudio.
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