¹ Laboratorio de Bioquímica y Genética de Resistencia a Insecticidas. Instituto Experimental "J. W. Torrealba". Núcleo Universitario Rafael Rangel. Universidad de los Andes, Trujillo Venezuela. Sede Carmona. 3150.

² Laboratorio de Toxicología y Fisiología de Insectos. Universidad Autónoma de Nuevo León. México. Facultad de Ciencias Biológicas. Av. Universidad s/n Cd. Universitaria, San Nicolás de los Garza, N.L. México 66451.

*Autor de correspondencia: hleslieag@hotmail.com

RESUMEN

Se determinó la resistencia a la permetrina en Aedes aegypti de los estados Trujillo y Zulia mediante bioensayos de botella. Los insectos derribados durante la hora de exposición fueron registrados y usados para calcular la Concentración Knock-down cincuenta (CK₅₀) y los muertos a las 24 horas para la Concentración Letal cincuenta(CL₅₀). La resistencia al derribo y post-recuperación fueron determinadas calculando del Factor de Resistencia FRCK₅₀ y FRCL₅₀, comparando los valores de CK₅₀ y CL₅₀de las poblaciones de Ae. aegypti de campo con los de la cepa susceptible New Orleans obtenidos mediante análisis de regresión log-probit. Mecanismos metabólicos y no metabólicos asociados a la resistencia, fueron evaluados midiendo los niveles de las enzimas alfa-esterasas, beta-esterasas, oxidasas de función múltiple y glutatión-S-transferasas mediante la técnica de microplacas y determinando la frecuencia alélica I1016 por PCR alelo específico. Ambas poblaciones mostraron baja resistencia al derribo (FRCK₅₀ < 5) y moderada resistencia post-recuperación (FRCL₅₀ entre 5 y 10). Sobre-expresión de alfa-esterasas fue observada en la población Loma Linda la cual se correlacionó significativamente con la CL₅₀. En la población Pampanito la frecuencia del alelo I1016 fue de 0,1 y en Loma Linda de 0,17, observándose homocigotos mutantes solo en esta última población. Se evidencia la presencia de mecanismos metabólicos y no metabólicos asociados a la resistencia al derribo y post-recuperación a la permetrina en las poblaciones bajo estudio, lo cual debe ser considerado antes de la aplicación de piretroides para el control de Ae. aegypti en la zona de estudio.

Palabras clave: Culicidae, control químico, enzimas desintoxicantes, mutación kdr.

SUMMARY

Key words: Culicidae, chemical control, detoxification enzymes, kdr mutation.

Recibido el 01/11/2015 Aceptado el 11/03/2016

Aedes aegypti (L.), principal vector de los flavivirus de la fiebre amarilla, dengue, fiebre hemorrágica por dengue (VFA y DENV) y zika (ZIKV), así como del alfavirus de la fiebre chikungunya (VC) ha desarrollado resistencia a los insecticidas en numerosos lugares del mundo (Brown, 1986). El desarrollo de este fenómeno en los mosquitos constituye el principal problema que afecta a las estrategias de control y se debe a la selección de genes de resistencia en las poblaciones de esta especie (WHO, 1981). En las últimas décadas, los insecticidas piretroides han jugado un papel importante en el control de adultos de Ae. aegypti a nivel mundial, a menudo en combinación con el insecticida organofosforado temefos para el control de estadios inmaduros, sin embargo, la evolución de la resistencia a estos y otros insecticidas en este vector ha comprometido la eficacia de los programas de control (Flores et al., 2006, Thanispong et al., 2008). Los principales mecanismos implicados en la resistencia a piretroides son el incremento de enzimas desintoxicantes tales como: carbolxylesterasas, oxidasas de función múltiple P-450 (MFO) y glutatión-s-tranferasas (GST) (Vaughan& Hemingway 1995, Rodríguez et al., 1999, 2001, Kasai et al., 2000, Prapanthadhara et al., 2002, Hemingway et al., 2004, Flores et al., 2006) y mutaciones presentes en el gen para del canal de sodio dependiente de voltaje (Brengues et al., 2003, Saavedra et al., 2007,Yanola et al., 2011). En Venezuela, investigaciones señalan resistencia de Ae. aegypti a los piretroides permetrina, ciflutrina, lambdacialotrina y deltametrina (Mazzarri & Georghiou, 1995, Molina et al., 1995, Pérez, 2010, Álvarez et al., 2008, 2013) lo cual refleja la intensa presión de selección ejercida,bien por la aplicación de estos químicos para el control de Ae. aegypti, o para el control de plagas agrícolas.Sobre-expresión de esterasas y MFO determinadas mediante el uso de sinergistas han sido reportados por Pérez (2010) en poblaciones de Ae. aegypti del estado Aragua resistentes a lambdacialotrina y deltametrina, del mismo modo, Álvarez et al. (2013), encuentran sobre-expresión de GST y MFO en poblaciones de los estados Trujillo y Lara resistentes a deltametrina. Mutaciones en el gen para del canal de sodio dependiente de voltaje asociadas a resistencia a piretroides,han sido observadas en Ae. aegypti de Venezuela. Saavedra et al., (2007) refieren frecuencias para I1016 comprendidas entre 0,01 y 0,132 en poblaciones de los estados Anzoátegui, Lara, Bolívar y Apure. Recientes investigaciones realizadas por Álvarez et al., (2015) en poblaciones silvestres de Ae. aegypti de los estados Trujillo, Lara, Táchira y Guárico colectadas entre los años 2008-2012 demuestran la diseminación de la mutación V1016I con frecuencias del alelo I1016 comprendidas entre 0,01 y 0,37, así como la presencia de la mutación F1534C con frecuencias entre 0,35 y 1,0. Estos hallazgos acerca de los mecanismos metabólicos y no metabólicos responsables de la resistencia a piretroides en Ae. aegypti del territorio venezolano, exhortan al monitoreo de estas y otras poblaciones del país donde se observa emergencia de chikungunya y zika así como re-emergencia del dengue, lo anterior con la finalidad de ampliar la información necesaria para el manejo de la resistencia de este vector a los insecticidas usados para su control. Este estudio evalúa el nivel de resistencia de dos poblaciones de Ae. aegypti procedentes de los estados Trujillo y Zulia al piretroide permetrina, así como niveles de enzimas desintoxicantes y la mutación kdr V1016I.

El presente estudio comprende 2 poblaciones de campo de Ae. aegypti procedentes de las localidades Pampanito (9º24’42"LN, 70º29’39"LO) en el estado Trujillo y Loma Linda (10º43’26"LN, 71º37’24"LO) en el estado Zulia, al occidente de Venezuela.Estadios inmaduros fueron colectados en el 2014 y transportados al Instituto Experimental "J. W. Torrealba" de la Universidad de los Andes, Venezuela para el establecimiento de las colonias y obtención de las generaciones parentales, las cuales fueron trasladadas a la Universidad Autónoma de Nuevo León, México donde fueron obtenidas las generaciones filiales F1, tal como se describe en (Álvarez et al., 2013). Hembras de 1 a 3 días de emergidas y sin alimentación sanguínea fueron utilizadas para los bioensayos, pruebas bioquímicas y moleculares. La cepa de Ae. aegypti New Orleans (NO) mantenida durante varios años en el laboratorio sin exposición a insecticidas, fue usada como cepa de referencia susceptible.

Cada mosquito se homogenizó en 2 mL de buffer fosfato pH 7,2 y 100 μL fueron transferidos a pozos individuales por triplicado por enzima.Alfa y beta esterasas, oxidasas de función múltiple y glutatión-S-tranferasas (GST) fueron cuantificadas en 30 mosquitos de cada población de campo y de la cepa de referencia siguiendo la metodología descrita por Brogdon (1989) y CDC (1992). La absorbancia fue medida en un microlector de placas UVM-34 (ASYS HitechGmbH, Eugendorf, Austria) y promediada. La concentración de proteínas fue determinada según Brogdon (1984) y en caso de observarse variación en el tamaño de los mosquitos se realizó la dilución necesaria del homogenado. Se evaluaron los datos para cada ensayo bioquímico por análisis de varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey a un nivel de significancia de P >0,05, para comparar los promedios de absorbancia para cada enzima de las poblaciones estudiadas con el de la cepa de referencia. El umbral de resistencia correspondiente al valor de absorbancia máximo en la cepa NO, se comparó con los obtenidos en las poblaciones estudiadas. Se calculó el porcentajede individuos que excedían el umbral (CDC, 2002) y se clasificó la enzima como un mecanismo no alterado (NA), alterado incipientemente (IA), o alterado (A), si <15 %, 15- 50%, o>50 % de los individuos excedían el umbral, respectivamente (Montella et al., 2007). Análisis de regresión lineal fue realizado entre los valores de las CL50 y los niveles enzimáticos (promedio de valores de absorbancia). La correlación (r) fue determinada para conocer el grado de asociación entre ambas variables. Tres criterios fueron considerados para asociar algún mecanismo enzimático con la resistencia encontrada; valores promedio de absorbancia significativamente superiores con respecto a los mostrados por la cepa NO, más del 50% de los individuos excediendo el umbral de resistencia y alta correlación significativa entre los valores de CL50 y promedios de absorbancia para cada enzima.

El ADN se aisló de cada mosquito mediante la técnica de extracción sales modificada por Coen et al., (1982).El ADN se peletizó y antes de usarse se resuspendió en 200 μL de buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mMEDTA pH 8,0).La cantidad y la calidad de cada ADN se determinó en un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientyfic Inc).

Para la amplificación de los alelos V1016 e I1016 se realizó una sola reacción de PCR en tubo (Saavedra et al., 2007). Se preparó un Máster mix con buffer 10x, agua destilada ultrapurificada, cloruro de magnesio 1,5 mM, dNTP´s 25nM, 2 primers "alelo específicos" a 500 pM/μL: V1016 (5'-[GCGGGCAGGGCGGCGGGGGCGGG GCCACAAATTGTTTCCCACCCGCACCG]3') y I1016 (5'-[GCGGGCACAAATTGTTTCCCACCCGCACTGA]-3') y un primer anti sentido Ile1016r (5'-[TGATGAACCSGAATTGGACAAAAGC]-3') y Taq polimerasa 5U/μL. En cada tubo de PCR se mezclaron por pipeteo 1,5 μL de ADN y 23,5 μL del Master Mix y se colocaron en un termociclador Biocycler BIORAD® programado a 4 ciclos: 1er ciclo: 95ºC x 5 min, 2do Ciclo: 95ºC x 1min, 60ºC x 1min, 72ºC x 1,15 min x 29, 3er Ciclo: 72ºC x 10 min, 4ºC 24 horas. Tres controles fueron incluidos cada vez que se realizó la PCR: un control homocigoto susceptible (V1016/V1016 cepa NO), un homocigoto resistente cepa IMU5 (I1016/I1016 población resistente Isla Mujeres, México) donada por la Dra. Karla Saavedra Rodríguez de Colorado State University, USA y un control negativo que correspondía a agua destilada ultrapurificada. Los productos de PCR, un marcador de peso molecular de 12 bandas (de 25bp a 500 pb HyperLadderTMV, Bioline) y el control negativo se revisaron en geles de agarosa al 3% con gel red. La electroforesis se corrió por 20 minutos a 100 voltios y se visualizó el gel para la genotipificación según Saavedra et al. (2007) mediante fragmentación de productos de PCR de alelos específicos del sistema V1016I. La frecuencia de cada mutación (p), fue calculada como la suma de dos veces el número de homocigotos resistentes y el número de heterocigotos, todo dividido entre 2n, donde n es el tamaño de la muestra. El intervalo de confianza 95% alrededor de p, fue calculado como el intervalo Wald:

Para la población de Ae. aegypti Pampanito, la CK50 correspondió a 2,57 μg/botella y la CL₅₀ 2,60μg/botella, para Loma Linda la CK₅₀ fue 2,90μg/botella y 2,54 μg/botella la CL₅₀ y para NO la CK₅₀ fue de 0,67μg/botella y 0,46μg/botella la CL₅₀. Al determinar los FRCK50 encontramos un valor de 3,8 para Pampanito y 4,3 para Loma Linda mostrando baja resistencia al derribo y valores de FRCL₅₀ en Pampanito de 5,7 y 5,5 en Loma Linda mostrando moderada resistencia post-recuperación (Tabla I).Con respecto a los mecanismos enzimáticos, sobre-expresión significativa de las alfa-esterasas y oxidasas fue observada en la población Pampanito con porcentajes de individuos que excedían el umbral de resistencia inferiores a 15% quedando categorizadas como mecanismos enzimáticos NA según Montella et al., (2007), al evaluar la correlación entre los valores de CL₅₀ y los niveles enzimáticos (promedio de absorbancia) solo se encontró correlación significativa con las alfa-esterasas. En ninguno de los casos se cumplieron los tres criterios propuestos en este estudio, razón por la cual no se asocian estos mecanismos enzimáticos con la resistencia post-recuperación. En la población Loma Linda se observó incremento significativo de las alfa-esterasas, oxidasas y GST con porcentajes de individuos que excedían el umbral de resistencia superiores al 25%, quedando categorizados como mecanismos IA. Alta correlación significativa (r= 0,998; p: α 0,05) entre la CL₅₀ y los niveles de alfa-esterasas fue encontrada, asociando la participación de estas enzimas en la resistencia post-recuperación mostrada por esta población (Tabla II y Fig. 1). En la Tabla III se muestra el número de mosquitos para cada genotipo, la frecuencia del alelo I1016 e intervalo de confianza 95% alrededor de la frecuencia de las poblaciones naturales de Ae. aegypti de los estados Trujillo y Zulia para el 2014. El genotipo homocigoto silvestre V1016/V1016 fue el genotipo predominante, seguido por el genotipo heterocigoto V1016/I1016 presentes en ambas poblaciones. En contraste, el genotipo homocigoto mutante I1016/I1016 solo estuvo presente en la población Loma Linda (2/26). La frecuencia alélica I1016 en la población Loma Linda fue superior a la encontrada en Pampanito con valores de 0,17 y 0,10 respectivamente, en concordancia con los resultados obtenidos mediante bioensayos, ya que el mayor valor de FRCK₅₀ se obtuvo en la población Loma Linda. Todos los genotipos estuvieron en equilibrio para el locus 1016 según la Ley de Hardy- Weinberg con base en la prueba de α2 de Pearson, con valores calculados inferiores al valor tabulado (3,84).

Nuestros resultados evidencian resistencia knock-down y post-recuperación a la permetrina a pesar de ser una molécula que no ha sido incorporada en los ]]> Ae. aegypti en Venezuela, no obstante, la aplicación de insecticidas piretroides a nivel doméstico para el control de insectos voladores y en los programas de control de otras plagas de interés en salud pública pudiera ser un factor determinante. Adicionalmente, existen reportes de Ae. aegypti resistentes a piretroides debido a resistencia cruzada con DDT (Hemingway et al. 1989, Brengues et al. 2003), ya que comparten el sitio blanco, el canal de sodio dependiente de voltaje, lo cual pudiera ser un factor adicional presente en nuestras poblaciones, debido a la presión de selección ejercida con la aplicación de DDT por varias décadas en Venezuela para el control de la malaria y otras enfermedades metaxénicas. El ]]> Ae. aegypti procedentes de los estados Aragua y Falcón, no siendo afectada por los sinergistas DEF y butóxido de piperonilo (PBO), sugiriendo la presencia de un mecanismo no enzimático asociado a la resistencia encontrada. Ae. aegypti de la población Pampanito (estado Trujillo), ha sido evaluado desde el 2006, particularmente en el 2008 mostró resistencia al piretroide deltametrina evolucionando en el 2010, con niveles sobre-expresados de GST en individuos supervivientes luego de ser expuestos a la CL₅₀ del piretroide y aumento de las frecuencias de los alelos mutantes I1016 y C1534 para el 2012 ]]> et al., 2013; 2015). En el presente estudio encontramos resistencia knock-down y post-recuperación a la permetrina, por lo que esta población presenta resistencia cruzada a los piretroides permetrina y deltametrina, lo que limita el uso de estos químicos para el control de Ae. aegypti en la localidad. Similares resultados han sido obtenidos por Molina et al., (1995) en Venezuela, Harris et al., (2010) en Islas Gran Caimán, Fonseca et al., (2010) en Colombia y Flores et al., (2013) en México. A pesar de mostrar niveles sobre-expresados de alfa-esterasas y oxidasas, estos mecanismos enzimáticos no fueron asociados con la resistencia encontrada, debido al bajo porcentaje de individuos que excedían el umbral de ]]> 50, a diferencia de lo observado en la población Loma Linda resistente también a la permetrina, donde las alfa-esterasas se mostraron como un mecanismo incipientemente alterado (> entre 15% y 50%)correlacionándose significativamente con la CL₅₀, indicando la participación de estas enzimas en la resistencia desarrollada por esta población. El papel de las esterasas, oxidasas y GST en la resistencia a la permetrina es controversial, investigaciones realizadas por Mazzarri & Georghiou (1997), Prapanthadara et al. (2002) y Harris et al. (2010) afirman que no están involucradas en la resistencia a piretroides, en ]]> et al. (2009), Azirun (2010), Fonseca et al. (2010), Somwang et al. (2011) y Kasai et al. (2014), demuestran el papel de enzimas como oxidasas P450 y esterasas en la resistencia a permetrina. Con respecto al mecanismo de resistencia no metabólico mutación V1016I, este estudio evidenció el papel de esta mutación en la resistencia a la permetrina en Ae. aegypti de ambas poblaciones estudiadas, estando de acuerdo con diversos reportes que muestran que la resistencia a piretroides no se debe solo a la presencia de mutaciones en el gen del canal de sodio dependiente de voltaje sino también a mecanismos enzimáticos (Brengueset al., 2003; Rodríguez et al., 2007; Flores et al., 2005, 2006), tal como se presentó en ]]> Ae. aegypti de varios estados, entre ellos el estado Trujillo, de donde es originaria la población Pampanito (Saavedra et al., 2007; Álvarez et al., 2015) y se ha diseminado a otros estados como el estado Zulia, sugiriendo ser el reflejo de la situación general del país. Cada año en Venezuela se continúan reportando casos de dengue, fiebre hemorrágica por dengue, chikungunya y la reciente arbovirosis zika. Particularmente para chikungunya, durante el año 2014 fueron reportados 37.274 casos probables con 2.486 confirmados para la semana epidemiológica 52 (OPS, 2014) los cuales descendieron progresivamente, reportándose para mayo de ]]> Ae. aegypti durante los años 2014 y 2015 se basó en la eliminación de criaderos y la aplicación de los insecticidas químicos temefos granulado 1%,malatión 94%, fenitrotion CE 50% , pirimifosmetil 50% y deltametrina CE 2,5% en nebulizaciones de ultra bajo volumen, sin embargo, para la semana epidemiológica 41 del 2014, el Índice Aédico a Casas (IAC) a nivel nacional ascendió a 19,79,con respecto a la semana homóloga del 2013, resultando 2.136 casas positivas (MPPS, 2014) descendiendo en el 2015 a 17,54, lo cual se vio ]]> Ae. aegypti en Venezuela, se han realizado investigaciones sobre la susceptibilidad y/o resistencia a los diferentes grupos de insecticidas químicos, así como los mecanismos de resistencia, las cuales se han limitado a poblaciones procedentes de pocos estados venezolanos (menos del 30%), trayendo como consecuencia la falta de información detallada acerca de la respuesta de este vector a los insecticidas usados en la actualidad. Lo anterior se traduce en un manejo general de la resistencia a nivel nacional que repercute en el éxito de los programas de ]]> Ae. aegypti de dos estados venezolanos, el primero Trujillo, el cual se ha monitoreado desde el año 2008 hasta la actualidad, reportándose resistencia a los insecticidas piretorides con participación de mecanismos metabólicos y no metabólicos, así como susceptibilidad a los organosfosforados temefos y malatión usados para su control, el segundo Zulia, que a pesar de ser un estado referido durante los últimos cinco años como de alta casuística por dengue, no ha sido objeto de investigaciones acerca de la resistencia a insecticidas. La presente investigación viene a ser el primer reporte de resistencia a insecticidas a piretroides en Ae. aegypti del estado Zulia, Venezuela, así como la ]]> para del canal de sodio dependiente de voltaje. Recomendamos desarrollar investigaciones similares en otras localidades de este estado y otros estados del país con diferentes insecticidas con la finalidad de contar con información importante para el manejo de la resistencia. Adicionalmente, deben monitorearse continuamente las poblaciones de Ae. aegypti para evitar la evolución de la resistencia y considerar los resultados obtenidos para garantizar el éxito del control del vector en las localidades estudiadas.

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