Perrone M,1 González-Valencia G 2 , Camorlinga M 2 , Correnti M 3, Cavazza M 4, Lecuna V 5, Torres J 2.
1. Coordinación de Investigación, Instituto de Investigaciones Odontológicas, Facultad de Odontología, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela
2. Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, Coordinación de Investigación, IMSS, Ciudad de México, México
3. Instituto de Oncología y Hematología, Ministerio de Salud y Desarrollo Social, Caracas, Venezuela . Instituto de Biomedicina, Ministerio de Salud y Desarrollo Social, Caracas, Venezuela
5. Hospital Clínico Universitario, Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela
Resumen
La placa dental ha sido sugerida como un reservorio importante de Helicobacter pylori, pero la hipótesis de que esta bacteria pueda permanecer como parte integrante de la microbiota residente de la cavidad bucal. Estudios previos realizados en nuestro país demostraron la presencia del microorganismo en 12/32 pacientes, lo que representa un 37,6% de positividad. H. pylori se caracteriza por poseer una gran variabilidad genética, y se ha demostrado la presencia de genes bacterianos específicos que están asociados con la virulencia de las especies bacterianas. El objetivo de este estudio fue caracterizar los genotipos vacA y cagA de especies de H. pylori provenientes de placa dental de una muestra de la población venezolana con el fin de determinar los genotipos mas frecuentes de nuestra población a nivel de la cavidad bucal. Fueron evaluadas 69 muestras de placa dental de pacientes con indicación de endoscopia por enfermedad de las vías digestivas superiores, provenientes del Hospital Clínico Universitario de Caracas. Se tomaron muestras de placa dental de cada uno de los pacientes y se realizó la extracción de ADN para el análisis por Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP). Se amplificaron los segmentos de glm M, vac A and cag A. Los resultados demostraron que solo 1/69 muestras (1,4%) fue positiva para la amplificación de glmM. Ninguna de las muestras pudo ser tipificada para las diferentes formas alélicas de vacA , región media de vacA o cagA . Los resultados de la presente investigación demostraron que aún cuando en reportes previos observamos una importante prevalencia de H. pylori en muestras de placa dental, en esta investigación la prevalencia de la bacteria fue muy baja, no pudiéndose identificar los genotipos mas frecuentes a nivel de placa dental.
Palabras clave: Helicobacter pylori, placa dental, Genotipos
Abstract
]]> The aim of this study was to characterize the vacA and cagA genotypes of H. pylori strains from dental plaque of a Venezuelan population. 69 patients attending for routine gastroscopy were evaluated. Dental plaque samples were obtained for DNA extraction and PCR analysis. Amplification of glmM, vacA and cagA segments were performed as previously described. The results demonstrated that only 1/69 (1,4%) was positive for glmM amplification. None of the samples was typeable for vacA signal sequence genotype, vacA mid region or cagA. The results demonstrated that the prevalence of H. pylori in dental plaque of a Venezuelan population was not significant in this study and was not possible to identify the genotypes of H. pylori from dental plaque.Key words: Helicobacter pylori, dental plaque, genotypes.
Recibido para revisión:12/03/2004 Aceptado para publicación: 15/07/2004
Introducción
Helicobacter pylori es un importante patógeno humano que causa gastritis crónica y está asociado con el desarrollo de úlcera péptica, y gastritis atrófica. Este microorganismo es considerado como el principal factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico y linfomas.1,2,3,4,5 Sin embargo, la infección solo ocurre en el 15% de las personas infectadas, siendo influenciada su aparición, por la virulencia de la especie infectante, la susceptibilidad genética del hospedero y la presencia de cofactores ambientales.6,7
La bacteria tiene una gran variabilidad genética, evidenciada por estudios de genotipificación y secuenciación de ADN.8,9 Recientemente se han descrito genes bacterianos específicos que están asociados con la virulencia de las especies bacterianas.10,11,12
Aproximadamente entre un 60% a 70% de las especies de H. pylori contiene un gen denominado cag A (gen asociado a la citotoxina), que codifica para una proteína de 128 kDa denominada cagA. 13 La presencia de cagA está relacionada con ulceración duodenal, atrofia de la mucosa gástrica y cáncer gástrico.11 Este gen representa una parte de una gran entidad genómica denominada isla de patogenicidad,13 la cual contiene múltiples genes relacionados con la virulencia y patogenicidad de las especies de H. pylori.
De esta forma, la presencia de cagA pude ser considerada como un marcador de la isla de patogenicidad, que está relacionada con una mayor virulencia de las especies que la presenten.14
Otro factor de virulencia producido por aproximadamente un 50% de las especies de H. pylori, es una citotoxina que induce la formación in vitro, de vacuolas en las células mamíferas, que determinan la muerte celular.15 Esta toxina es codificada por el gen VacA, presente en prácticamente todas las especies de H. pylori.
Ha sido reportada la existencia de diferentes variantes alélicas en dos partes de este gen. La región señal N terminal (s) ocurre como alelos s1a, s1b o s2 . La región media (m)), está presente como alelos m1 o m2. Esta estructura de mosaico de este gen ocurre por las diferencias en la producción de citotoxinas entre las especies. Las especies tipo s1/m1 producen altos niveles de toxina, las especies tipo s1/m2 producen de bajo a moderado niveles de toxinas activas, mientras que las especies tipo s2/m2 no producen ninguna toxina activa. Las especies s2/m1 han sido muy poco reportadas.16
]]> Las regiones vacA s y m parecen tener diferente relevancia clínica. 17 Al respecto, las especies vacA s1a están más asociadas con la presencia de un infiltrado de linfocitos y neutrófilos en la mucosa del antrum, que los tipos s1b o s2. Las especies vacA m1 están más asociadas con daños al epitelio gástrico que las especies m2, mientras que las úlceras duodenales son mas prevalentes en pacientes infectados con especies tipo s1a que con pacientes colonizados por especies tipo s1b o s2.El objetivo de este estudio fue identificar los genotipos de H. pylori en muestras provenientes de placa dental en un grupo de pacientes venezolanos, con el fin de caracterizar las especies de H. pylori más frecuentes en nuestra población, así como establecer la posible asociación existente entre los tipos de especies residentes a nivel de cavidad bucal y estómago
Materiales y métodos
Pacientes: Fueron evaluados 69 pacientes del Hospital Clínico Universitario, referidos por presentar enfermedad de las vías digestivas superiores. Se les presentó el consentimiento informado a cada uno de ellos y el protocolo de experimentación fue previamente aprobado por el comité de ética del CONICIT (Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología). A cada sujeto se le realizó una detallada historia clínica. Fueron considerados los índices de placa, que fueron medidos de acuerdo a Sillness y Loe. El índice de caries se basó en el número de lesiones cariosas presentes en cada sujeto. Los criterios de exclusión del presente trabajo fueron, tratamiento con antibióticos y compuestos que contuviesen bismuto u omeprazol, durante dos semanas previas al examen.
Recolección de la muestra: Las muestras fueron tomadas, raspando la superficie dentaria con cureta de Gracey, antes de la realización de la endoscopia. Igualmente se tomaron dos biopsias del antrum por cada paciente, para la realización de otros ensayos.
Tipificación de vacA y cagA usando el ensayo de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP).
Para la detección de ADN de H. pylori de placa dental, las muestras fueron agitadas. La suspensión fue lavada con agua estéril y centrifugadas a 12000X g por 3 min. El pellet resultante fue resuspendido en 500ul de buffer de lisis (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 25nM EDTA, 0,5% dodecilsulfato de sodio), y 10 ul de proteinasa K (10mg/ml) fue añadido. La incubación se realizó a 50ºC por 20 h; esto fue seguido por la extracción con fenol cloroformo y precipitación con etanol. El pellet resultante fue disuelto en 100 ul de buffer TE (10 mM), Tris-HCl [pH 7.4}, 0.1 mM EDTA [pH 8.0] por 20 h a 37º C. Las muestras fueron mantenidas a –20ºC hasta su posterior procesamiento. Los primers usados son presentados en la Tabla N°1.
Tabla 1 Primers de oligonucleotios usados para tipificar vac A and cag A
| Gen y región tipificada ]]>
Genotipo identificado, Designación del primer de bases |
Secuendia del primer | Tamaño-del producto de RCP pares |
| m1 | ]]> | |
| VA3-F | 5’-GGTCAAATGCGTCATGG-3’ | 290 |
| 5’-CCATTGGTACCTGTAGAAA-3’ | - | |
| m2 | ]]> | |
| VA4-F | 5’-GGAGCCCCAGGAAACATTG-3’ | 352 |
| VA4-R | ]]> 5’-CATAACTAGCGCCTTGCAC-3’||
| vac A signal region | ||
| SS1-Fa | ]]> 5’-GTCAGCATCACACCGCAAC-3’ | 190 |
| S1b | ]]> | |
| SS3-Fa | 5’-AGCGCCATACCGCAAGAG-3’ | 187 |
| S2 | ]]>||
| SS2Fa | 5’GCTAACACGCCAAATGATCC-3’ | 199 | ]]>
| VA1-R | 5’-CTGCTTGAATGCGCCAAC-3’ | _ | ]]>
| cagA | ||
| F1 | 5’-GATAACAGGCAAGCTTTTGAGG-3’ | ]]> 349|
| B1 | 5’-CTGCAAAAGATTGTTTGGCAGA-3’ | - |
| B7628 | ]]> 5’-AAGAAAGGCAAGAAAGCAGAAA-3’335 | |
| B7629 | 5’-ACACAGAAGACAGAGCGTTATT-3’ | ]]>|
| Ure C | ||
| 5´- GGATAAGCTTTTAGGGGTGTTAGGG 3´ | ||
| GLMM-R | 5´- GCTTACTTTCTAACACTAACGCGC 3´ |
Los tipos vacA s1 y s2 se diferencian en base a diferencias en el tamaño de los productos del PCR
NOTA. RCP, Reacción en Cadena de la Polimerasa.
a Usado con VA1-R
El Método para la tipificación de la secuencia señal vacA y la región media fue ligeramente modificado del descrito por Atherton y col.17 Todas las mezclas para la RCP consistieron en 1 ul del ADN, Buffer RCP 1X (Gibco BRL, Gaithersburg,MD), 1.5 mM de MgCl 2, 0.2 mM de cada deoxinucleótido (Gibco BRL), 0.5 uM de cada primer específico, y 1.25 U de Taq polimerasa (Gibco BRL) en un volumen final de 25 uL.
Los ciclos de amplificación fueron realizados en un termociclador o sistema de amplificación (Perkin-Elmer, Foster City, CA) Las condiciones para la RCP fueron de 35 ciclos a 94°C por 1 min, 72°C por 1 min, y una extensión final de 72°C for 6 min. Para la tipificación de cagA, dos juegos de primers fueron usados F1-B118 y B7628-B7629 (gentilmente donado por M.K.R. Tummuru, Vanderbilt University, Nashville, TN). Para F1-B1, las condiciones de la RCP fueron las mismas que para vacA, excepto que el anillado fue a 55°C for 1 min. Para B7628-B7629, las condiciones de la RCP fueron de 25 ciclos a 94°C por 1 min, 46°C por 1 min, y 72°C por 1 min.
Como control positivo fueron usadas las siguientes cepas específicas, 8822 ( vacA s2m2) y 8823( vacA s1m1 ) (ATCC 49503) genotipo cag A +, vac A s1a/m1; Tx30a (ATCC 51932) genotipo cag A-, vac A s2/m2; y 84-183 (ATCC 53726) genotipo cag A +, vac A s1/m1. Se incluyó ADN de las cepas controles en cada ensayo, y un control negativo que era una muestra sin ADN.
De esta forma cada reacción de RCP tuvo un control positivo (ADN de la especie con los tipos alélicos vacA o cagA ) y algunos controles negativos (muestra sin ADN, y ADN de genotipos diferentes). Los productos ampilificados de la RCP fueron analizados por electroforesis en geles de agarosa. Una alicuota de 6ul ( 5 µl de cada producto amplificado, le fueron añadidos 1ul de buffer de muestra) (20 ml de glicerol 50%, 25 mg de azul de bromofenol, 3 gotas de 1 N NaOH) y se realizó la electroforesis con geles preparados al 2%, los cuales fueron teñidos con bromuro de etidio (0.5 ug/ml).
Resultados
]]> Tabla 1Frequencia de Helicobacter pylori en muestras de placa dental determinado por Reacción en Cadena de la Polimerasa.
|
| Muestras de placa dental n=69 |
| Positivos | 1(1,4%) |
De las 69 muestras de placa dental evaluadas solo una fué positiva para la amplificación de glmM, como se puede evidenciar en la Foto N° 1. La misma se correspondió con la cepa 8822 que se usó como control positivo y que es vacA s2-m2. En la misma corrida se incluyó la muestra de la biopsia de estómago del mismo paciente, el cual también se correspondió con la cepa 8822 (vacA s2-m2).
Discusión
La cavidad bucal ha sido propuesta como un reservorio de infección de Helicobacter pylori, usando datos provenientes de una variedad de técnicas empleadas, con resultados muy variables19,20,21. Algunos estudios han demostrado frecuentemente la presencia de H. pylori en muestras de la cavidad bucal, particularmente de placa dental22,23. Otros lo han observado solo en aislamientos ocasionales24, y muchos han fallado para demostrar la presencia del microorganismo en la cavidad bucal25,26. Estos resultados conflictivos en la incidencia de H. pylori en la placa dental, pueden ser explicados por diferencias en los métodos de recolección de muestras y técnicas de detección o por contaminación causada por el reflujo gástrico en el momento de la endoscopia
La prevalencia de la infección varía notablemente en todo el mundo, con una tasa del 40 al 50% en los países desarrollados y cerca del 90% en aquellos países en vías de desarrollo. El modo de transmisión de H. pylori es ampliamente discutido.27 Aunque algunas evidencias sugieren que este ocurre predominantemente por contacto de persona a persona, otros autores proponen la vía fecal-oral. Más recientemente ha sido sugerido que la bacteria puede existir de forma natural en el ambiente28.
La edad de adquisición del microorganismo puede ser crítica en determinar el inicio clínico de la infección.29. Actualmente, las evidencias a favor y en contra de la transmisión vía oral-oral del microorganismo son muy debatidas. Desde que H. pylori fue exitosamente aislado mediante cultivo de la placa dental de algunos pacientes, la cavidad bucal ha recibido especial interés como un posible reservorio del microorganismo23.
De esta forma tanto la saliva como la placa dental han sido implicadas como posibles vías de adquisición de la infección por H. pylori. Aún cuando en la actualidad existen numerosos esfuerzos dirigidos a mejorar los métodos diagnósticos para detectar este agente30,31, su identificación a nivel bucal se percibe como muy complicada, quizás porque su tasa de recuperación es muy controversial. Así, mientras que la bacteria pudo ser aislada de la cavidad bucal en algunos estudios19,20,21, muchos esfuerzos para cultivarla han fracasado32,33.
A este respecto, algunos investigadores han sugerido que posiblemente formas cocoides , no cultivables del organismo puedan sobrevivir en la boca34. Muchas técnicas de RCP han sido desarrolladas con la finalidad de detectar el microorganismo a nivel de la cavidad bucal35; algunas de ellos basadas en la secuencia del gen ureasa y otras en el gen de ARN 16S ribosomal. Una alta prevalencia de H. pylori ha sido demostrada empleando estos ensayos22, Sin embargo, a diferencia de estas observaciones, una muy baja prevalencia o ninguna ha sido reportada por otros autores36,37, En muchos casos pacientes con resultados positivos a nivel de biopsias de estómago son también positivos a nivel de placa dental, pero otros pacientes no presentan coinfección a nivel bucal. Estos resultados son realmente muy inconsistentes, y no están relacionados con la gran prevalencia a nivel mundial que ha sido demostrada a nivel de estómago.
Aún cuando trabajos previos realizados por nuestro grupo en nuestro país, demostraron la presencia de H. pylori en 12/32 (37,5%) muestras de placa dental de los sujetos evaluados38, en la presente investigación solo 1/69 (1,4%) resulto positiva para el microorganismo.
Es importante referir que como fue señalado anteriormente los reportes sobre la prevalencia de H. pylori en cavidad bucal son muy conflictivos. De hecho existen estudios con una alta prevalencia y otros que indican no haber podido demostrar su presencia en cavidad bucal. En nuestro caso resulta aún mucho más contradictorio que habiendo realizado investigaciones previas en el mismo hospital (Hospital Universitario de Caracas), los datos hayan sido diferentes.
Si evaluamos las condiciones de la toma de la muestra estas fueron las mismas que las empleadas en la investigación previa, al igual que el método de extracción de ADN, las condiciones del ensayo de reacción en cadena de la polimerasa, los primers utilizados, por lo que consideramos que la razón fundamental de las diferencias reportadas radica básicamente en la muestra per se, es decir obviamente la cantidad de microorganismos alojados en la cavidad bucal de estos sujetos fue menor que los antes citados, lo que nos hace presumir que la presencia del microorganismo en la cavidad bucal no tiene una prevalencia muy alta en nuestra población, y que deben ser realizadas otras investigaciones ampliando el número de pacientes con la finalidad de complementar los datos referentes a la presencia de H. pylori en la cavidad bucal de sujetos en nuestro país.
]]> Si sería importante considerar que para la toma de la muestra de placa dental deberían ser incluidos sujetos que tengan una cantidad mediana de placa en sus superficies dentarias o quizás solicitarle al paciente el no cepillado el día de la toma de la muestra, ya que lógicamente el paciente como en este caso acude a una consulta para una evaluación endoscópica refuerza su cepillado ese día específicamente. Igualmente es necesario tratar de recolectar la mayor cantidad posible de muestra de cada uno de los pacientes, ya que como sabemos las posibilidades de detección del microorganismo serán mayores.Es importante referir que en la presente investigación aún cuando nos dieron negativas casi todas las muestras para glmM, procedimos a realizar el ensayo para las diferentes formas alélicas de vacA, región media de vacA, cagA, e inclusive incluimos algunas muestras en la detección de la isla de patogenicidad.. Es más se tomó un grupo de las muestras al cual se le realizó un tipo de RCP denominado “nested PCR”, o RCP anidado para el cual también resultaron negativas las muestras. En cada uno de los ensayos se incluyeron controles positivos y negativos los cuales funcionaron adecuadamente, lo que nos indicaba que las condiciones de la técnica estaban siendo realizadas de una forma adecuada.
Como parte del trabajo de nuestro grupo, es importante señalar que como estos pacientes presentaban indicación de endoscopia y uno de nuestros objetivos era el de correlacionar los genotipos presentes en la cavidad bucal con los del estómago, a cada uno de los pacientes le fueron tomadas dos biopsias del antrum, una para análisis histopatológico y otra para RCP. De esta forma incluimos en el gel presentado en este reporte, además de la muestra de placa dental, la biopsia de estómago del mismo paciente, la que nos dió resultados similares a la de placa dental, es decir las dos corrieron como la especie 8822 que es s2/m2, la cual se caracteriza por no producir toxinas activas.16
Los resultados de las muestras de estómago (datos aún no publicados) demostraron que de 29 biopsias procesadas, 17/29 (57%) fueron positivas para la amplificación de glmM, lo que demuestra una alta frecuencia de la bacteria en nuestra población. Es importante referir que estas muestras fueron procesadas conjuntamente con las de placa dental, lo que nos ratificaba aun más, que las condiciones de los ensayos y primers estaban usándose de forma adecuada.
De estas muestras, 17 (59%) tenían la señal vacA genotipo s1 (1 fue s1a, 4 s1b, 1 s1a+s1b y 4 fueron no tipificables) y 7 (41%) de las muestras tenían el subtipo s2. Los análisis de la región media revelaron que 6 (35%) fueron vacA m1, 4 (24%) fueron m2 y 7 (41%) no fueron tipificables para m1 o m2. Con respecto a cagA este fue detectado en 11/29 (65%) de las biopsias evaluadas. Estos datos nos indican que la infección con mas de una especie de H. pylori (definida por los diferentes tipos de vacA). Asimismo, la presencia de especies sin regiones amplificadas o no tipificadas de vacA s o m, sugiere que subfamilias adicionales de las formas alélicas s y m pueden existir.
Con respecto a cagA es importante señalar que la presencia de este gen es reconocido como un importante marcador de las especies, que les confiere un riesgo incrementado para el desarrollo de ulcera séptica y cáncer gástrico.39,40,41,42
Entre un 60 a un 70% de las especies de H. pylori contienen este gen denominado cag A (gen asociado a la citotoxina), que codifica para una proteína de 128 kDa denominada cag A. Este gen representa una parte de una gran entidad genómica denominada isla de patogenicidad,13 la cual contiene múltiples genes relacionados con la virulencia y patogenicidad de las especies de H. pylori.
Referente a las regiones vacA s y m, estas parecen tener diferente relevancia clínica. 17 Al respecto, las especies vacA s1a están más asociadas con la presencia de un infiltrado de linfocitos y neutrófilos en la mucosa del antrum, que los tipos s1b o s2. Las especies vacA m1 están mas asociadas con daños al epitelio gástrico que las especies m2, mientras que las úlceras duodenales son mas prevalentes en pacientes infectados con especies tipo s1a que con pacientes colonizados por especies tipo s1b o s2.
Es importante, con los resultados obtenidos de nuestras biopsias de estómago, establecer la asociación de vacA y cagA con el diagnóstico clínico de los pacientes, con el fin de establecer nuestros propios patrones de asociación entre estas dos variables.
De la presente investigación podemos concluir que la cavidad bucal no se mostró como un reservorio para H. pylori en estos pacientes, por lo que no fue posible identificar los genotipos mas frecuentes a nivel de cavidad bucal. Otros estudios deberán ser realizados con la finalidad de ampliar el número de pacientes, y así establecer la prevalencia real de H. pylori en la cavidad bucal de pacientes venezolanos.
]]> AgradecimientoEste trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela y la Unidad de Investigación en Enfermedades Infecciosas, Coordinación de Investigación, IMSS, Ciudad de México, México
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