Panton Valentine leukocidin in MRSA strains isolated from patients at the University Hospital of Maracaibo
Romero A. Sonia1, Castellano G. Maribel1, Ginestre P. Messaria1, Perozo M., Armindo2.
1 Bacteriología General. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela. 2 Práctica Profesional de Bacteriología. Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia-Venezuela.
Autor de correspondencia: Sonia Romero. E-mail: sromero272@hotmail.com
Resumen
Staphylococcus aureus se presenta como un patógeno cada vez más importante, debido al arsenal de factores de virulencia que presenta, sumado a su elevada capacidad de generar resistencia a los antimicrobianos Los objetivos de esta investigación fueron: confirmar la resistencia a meticilina mediante la amplificación del gen mecA y detectar la presencia de los genes que codifican el factor de virulencia leucocidina de Panton Valentine (PVL). Se investigaron estos genes empleando la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Todos los aislamientos presentaron el gen mecA, el 50% de estas cepas resultó portador del gen para PVL. El 54,17% de las muestras de pacientes pediátricos, dio positivo para esta leucocidina. El mayor porcentaje de aislamiento se encontró en muestras de piel y tejidos blandos (85,7%).
Palabras claves: S. aureus meticilino resistente; PVL; mecA
Abstract
Staphylococcus aureus is an increasingly important pathogen, due to the arsenal of virulence factors which presents, in addition to its high capacity to generate antimicrobial resistance. The objectives of this research were: confirm methicillin resistance by amplification the mecA gene and the presence of genes that encode Panton Valentine leucocidin (PVL) virulence factor. These genes have been investigated using polymerase chain reaction (PCR). All isolates showed the mecA gene, 50% of these strains were carrying the gene for PVL. 54,17% of the samples from pediatric patients, yield positive for this leukocidin. The highest percentage of isolation was found in samples of skin and soft tissues (85.7%).
]]> Keywords: Methicillin-resistant S. aureus, PVL; mecARecibido: 04-10-2016 Aceptado: 28-11-2016
INTRODUCCION
Las enfermedades infecciosas constituyen una de las primeras causas de morbilidad y mortalidad a nivel mundial y Staphylococcus aureus (S. aureus) es una de las especies más comúnmente implicadas en estas infecciones. Uno de los principales desafíos que enfrentan hoy en día los sistemas de salud a nivel mundial, es el gran aumento de la resistencia a los antimicrobianos. El género estafilococo, principalmente S. aureus, ha desarrollado resistencia a prácticamente todas las familias de antibióticos (1, 2).
Una amplia variedad de infecciones, desde infecciones menores de la piel hasta infecciones de heridas postoperatorias pueden ser causada por S. aureus. Por tanto, se describen con frecuencia procesos focales como: foliculitis, forunculosis, abscesos, infecciones como celulitis donde el compromiso tegumentario es de piel y tejido celular subcutáneo. Por vía hematógena puede afectar órganos nobles como corazón, pulmón o sistema nervioso central (SNC), causando infecciones severas como neumonía, endocarditis, meningoencefalitis y sepsis (3,4).
Desde la aparición de S. aureus resistente a meticilina (SAMR ) en Inglaterra en 1961, su incidencia ha ido en constante aumento constituyéndose en uno de los patógenos prevalentes en infecciones hospitalarias (5). Las infecciones por SAMR asociados a los hospitales (SAMR-AH), generalmente ocurren en personas con factores de riesgo predisponentes, como cirugías o presencia de dispositivos médicos permanentes (3, 6); sin embargo, la epidemiologia de SAMR ha ido cambiando con el transcurso del tiempo. En los últimos años, se ha observado un incremento de infecciones adquiridas en la comunidad causadas por este microorganismo, en pacientes sin factores de riesgo. Los primeros casos se reportaron en niños, luego en adultos y en la actualidad, están diseminados por todo el mundo (5,7).
La presión de los antibióticos ha favorecido la evolución genética de S. aureus, con la consecuente aparición de cepas con diferentes determinantes de virulencia y patrones variables de susceptibilidad, que difieren no solo epidemiológicamente sino también en los tipos de infecciones que producen. Así, se reportan cepas de S. aureus sensibles a meticilina (SASM), SAMR asociadas al ambiente hospitalario o nosocomiales (SAMR -AH) y SAMR asociado a la comunidad (SAMR -AC) (6, 8). Aunque existen diferencias genéticas entre las cepas adquiridas en la comunidad y las nosocomiales, ambas presentan genes comunes como el mecA y el gen del factor de virulencia que codifica para la leucocidina de Panton- Valentine, entre otros (9).
Actualmente, la resistencia a la meticilina es un hallazgo frecuente y representa un problema importante de salud pública a nivel mundial. El gen mecA, responsable de la resistencia a la meticilina en S. aureus, no es endógeno y se encuentra integrado al cromosoma bacteriano. Este gen se encuentra dentro de un elemento cromosomal móvil heterogéneo conocido como “Staphylococcal cassette chromosome mec” (SSCmec). Hasta la fecha se han descrito 11 tipos de SCCmec (10). Este elemento genético también ha sido encontrado en otras especies de estafilococos y se cree que las especies coagulasa negativa constituyen un reservorio para la adquisición de SSCmec; así, que el surgimiento de linajes de estafilococos resistentes a la meticilina se debe a la adquisición y la inserción del elemento de SCCmec en el cromosoma de cepas susceptibles (10, 11, 12).
La leucocidina de Panton-Valentine (Panton-Valentine leukocidin; PVL, por sus siglas en inglés), es una leucocidina bicomponente codificada por dos genes cotranscriptos, a saber, lukS-PV y lukF-PV (lukS/F-PV), que residen en el genoma de un bacteriófago templado phiPVL aislado de S. aureus V8 (ATCC 49775) (13, 14, 15). Este factor es una citotoxina que se une a los fosfolípidos de la membrana de los leucocitos y macrófagos, induciendo la formación de poros que alteran la permeabilidad celular, causando destrucción de leucocitos y necrosis tisular (16). Se cree que la PVL es uno de los factores de virulencia responsable de la alta patogenicidad de las cepas que la presenten, lo que ocasiona desde infecciones simples a nivel de piel y tejidos blandos, hasta enfermedades invasivas como neumonía necrotizante, sepsis severa y fascitis necrotizante, que ponen en riesgo la vida del individuo (5, 17).
Los intentos por demostrar que la PVL tiene un papel en la patogénesis de la enfermedad, ha llevado a realizar investigaciones con mutantes de deleción isogénica (lukF-PV y lukS-PV) en modelos animales infectados que han producido resultados no concluyentes y han llamado también la atención sobre la importancia potencial de otros determinantes de virulencia, tales como: α-hemolisina, péptidos solubles de modulina α, y el regulador de virulencia Agr (18, 19). Al mismo tiempo, la investigación ha demostrado que la asociación epidemiológica entre SAMR asociado a la comunidad y la PVL está lejos de ser absoluto, con varias cepas SAMR asociadas a la comunidad PVL negativas descritas en todo el mundo (20)
]]> Recientemente, numerosos estudios han informado la aparición de cepas SAMR-AC dentro del ámbito hospitalario, lo que representa una amenaza significativa para la salud pública (16, 21, 22); por lo que, durante los últimos años, la distinción entre SAMR -AH y SAMR -AC ha comenzado a desaparecer, por lo que cepas de SAMR -AC ahora son endémicas en muchos hospitales de Estados Unidos (23).Los objetivos de esta investigación fueron: a) confirmar la resistencia a meticilina mediante la amplificación del gen mecA. b) detectar la presencia de los genes lukF-PV y lukS-PV, que codifican el factor de virulencia PVL.
MATERIALES Y MÉTODOS
Cepas bacterianas
Se estudiaron 42 cepas SAMR aisladas en el laboratorio de referencia bacteriológica del Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM), de distintos tipos de muestras (secreciones de: herida, oído, conjuntiva ocular, traqueales; abscesos, úlceras y sangre), provenientes de pacientes adultos y pediátricos, que acudieron al centro hospitalario, en el lapso comprendido entre enero y marzo de 2015.
Amplificación del gen mecA y los genes productores de PVL mediante la reacción en cadena de la polimerasa
Extracción del ADN: Para la extracción del ADN genómico de estas cepas, se utilizó la técnica de lisis enzimática para lo cual, a partir de un cultivo puro de 24 horas, se tomaron aproximadamente un mínimo de 10 colonias, y se colocaron en un tubo con 400 μl de buffer TE (10mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA, pH 8,0; 25 ng/μl de lisostafina), como buffer de lisis, incubándose a 37°C por 1 hora. Luego, se le agregó 40 μl de SDS (dodecil-sulfato de sodio) al 1% y 10 μl de proteinasa K a una concentración de 250 ng/μl, y se incubó a 50ºC por 1 hora. Se tomaron 400 μl de la mezcla y se realizó la extracción con una mezcla de fenol-cloroformo 1:1.
La mezcla se agitó y se centrifugó a 14.000 rpm por 20 minutos. Con una pipeta, se extrajo la fase acuosa, colocándola en un nuevo tubo eppendorf. El ADN contenido en la fase acuosa fue precipitado con 1 ml de etanol absoluto (100%) y se almacenó a -20°C durante toda la noche. Al día siguiente, previo descongelado, se procedió a centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos. Se descartó el sobrenadante y al sedimento, se le agregó 400 μl de etanol al 70% y se dejó secar durante 30 minutos, colocando los tubos eppendorf destapados sobre un papel absorbente. El sedimento se resuspendió en 100 μl de buffer TE 10 mM. Para realizar los ensayos de amplificación se utilizaron 3 μl de la muestra.
Los iniciadores utilizados durante el proceso de amplificación para mecA fueron: 5’-AAC AGG TGA ATT ATT AGC ACT TGT AAG-3’ y 5’-ATT GCT GTT AAT ATT TTT TGA GTT GAA-3’. Como controles positivos se utilizaron secuencias 16s RNAr específico de Staphylococcus: 5’-AAT CTT TGT CGG TAC ACG ATA TTC TTC ACG-3’ y 5’-CGT AAT GAG ATT TCA GTA GAT AAT ACA ACA-3’ (24).
La caracterización genotípica de la PVL se realizó por coamplificación de los genes lukS-PV y lukF-PV mediante PCR. Se empleó el mismo ciclo de reacción, actuando como iniciadores luk-PV-1: 5’-ATC ATT AGG TAA AAT GTC TGG ACA TGA TCC A-3’ y luk-PV-2: 5’-GCA TCA AST GTA ATT GGA TAG CAA AAG C-3’ (14, 15, 16, 25).
]]> Una alícuota de 3 μl del ADN previamente extraído de S. aureus, se transfirió directamente a 20 μl de mezcla para PCR, que contiene: 50 mM KCl; 10 mM Tris-HCl (pH 9,0); 0,1% Tritón X-100; 2,5 mM MgCl2; 0,4 μM de cada uno de los iniciadores, 200 μM de cada uno de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato y 0,5 U de ADN polimerasa Taq (Promega®). Las mezclas de PCR fueron sometidas a un ciclo térmico en un termociclador modelo PTC-200 (MJ Research, Inc®, Massachusetts, USA), como se describe a continuación: 5 minutos a 96ºC; 35 ciclos de 20 segundos a 95ºC, 30 segundos a 55°C y 30 segundos a 72ºC. Luego, 5 minutos a 72°C y conservados indefinidamente a 4°C.Un volumen de 5 μl de los productos de la amplificación, fueron sometidos a la separación mediante electroforesis en gel de agarosa al 2,5% conteniendo 0,5 μg/ ml de bromuro de etidio, en buffer tris-borato-EDTA (89 mM Tris, 89 mM ácido bórico, 2 mM EDTA) a 80 V/cm, durante 90 minutos. Los geles fueron visualizados bajo luz ultravioleta (254 nm) y se fotografiaron con una cámara digital.
El tamaño de los productos de amplificación de la PCR se estimó por comparación con un marcador de peso molecular de 100 pb. De manera que, la presencia de una banda de 174 pb fue indicativa de la presencia de mecA y una de 433 pb, mostró la presencia del gen que codifica para PVL. Todas las cepas amplificaron la banda de 108 pb, correspondiente al control interno para la identificación de S. aureus.
El análisis estadístico de los datos de este estudio se realizó utilizando el paquete estadístico SPSSTM versión 21. Para determinar si existe asociación entre las variables estudiadas se utilizó el estadístico de contraste χ2 (chi-cuadrado), empleando un valor de p<0,05, como índice de confiabilidad estadística.
RESULTADOS
Todas las cepas amplificaron para el gen mecA, confirmándose genotípicamente su resistencia a meticilina. (Figura 1)
Figura 1. Amplificación mediante PCR del gen mecA en cepas SAMR
El análisis de PCR efectuado para determinar la presencia de los genes codificadores de PVL reveló que de las 42 cepas SAMR, 21 (50,00%) fueron positivas (Figura 2). Del total de cepas, 24 provenían de muestras de pacientes pediátricos (57,14%) y 18 cepas (42,86%) fueron aisladas de muestras de adultos. Al aplicar el chi–cuadrado, se encontró asociación significativa entre el tipo de paciente y la presencia de estos genes (p<0,05).
Figura 2. Detección del gen lukS/F-PV por PCR en cepas SAMR
]]>
De los 24 aislamientos SAMR de muestras pediátricas positivos para PVL, 13 (54,17%) presentaron genes que codifican esta toxina y 11/24 (45,83%) resultaron negativos. En relación con las cepas aisladas de muestras de pacientes adultos, los resultados obtenidos fueron 8/18 cepas, dieron resultados positivos (44,44 %) y 10 (55,56%) reflejaron negatividad para esta prueba (Tabla 1).
Tabla 1. Distribución del gen lukS/F-PV en grupos de pacientes
Los resultados obtenidos en la determinación de los genes para la PVL según el tipo de muestra clínica revelaron diferencia significativa (p<0,05) entre el tipo de muestra y la producción de esta toxina (Tabla 2); observándose, que el mayor porcentaje provenía de muestras de piel y tejidos blandos (PTB) (85,71%).
Tabla 2. Distribución de genes que codifica PVL de acuerdo al tipo de muestra
En la Tabla 3 se evidencia la relación entre presencia del gen lukS/F-PV que codifican la PVL, con los tipos de pacientes y tipo de muestras. Aquí se refleja que el tipo de muestras donde existe el mayor número de aislamientos SAMR productor de PVL fue en PTB (18), de las cuales 12 cepas provenían de muestras pediátricas y 6 de muestras de adultos.
Tabla 3. Relación entre presencia de genes para PVL, tipo de paciente y muestras
En la actualidad S. aureus es un patógeno cada vez más importante, debido al arsenal de factores de virulencia del microorganismo, sumado a su elevada capacidad de generar resistencia a los antimicrobianos. Los estudios sobre las características epidemiológicas moleculares de las cepas SAMR han demostrado su diversidad genética y geográfica (26).
Todos los aislamientos SAMR obtenidos en este estudio presentaron el gen mecA. Otros autores (5, 27, 28), obtuvieron resultados similares al de esta investigación, en cuanto a la presencia del gen mecA en todas las cepas SAMR aisladas. Sin embargo, Montes (5) en una investigación realizada en Colombia, de un total de 37 aislamientos, solo 7 (18.9%) presentaron este gen. En un estudio realizado en Irán (29) de 50 cepas SAMR, solo el 30% (15) de estas cepas fueron positivas para este gen.
El mecanismo que confiere resistencia a meticilina, es complejo, ya que la bacteria ha generado una variación genética, que se encuentra codificada por el gen mecA, la cual modifica la estructura de su proteína ligadora o fijadora a penicilina (PBP2a), lo que impide que la meticilina pueda adherirse al lugar donde va a ejercer la acción de bloquear la enzima transpeptidasa (cuya función en el ciclo de vida bacteriana es sintetizar la pared bacteriana) (11, 12, 30, 31). Este mecanismo confiere a esta bacteria resistencia absoluta contra las penicilinas semi sintéticas (meticilina y oxacilina) y cefalosporinas de primera y segunda generación. Pero además, es el determinante central que codifica la resistencia a los betalactamicos de amplio espectro; dejando sin efecto todos los betalactámicos, incluyendo cefalosporinas de tercera, cuarta generación y los carbapenemes (imipenem, meropenem). La resistencia conferida por este gen se extiende a otras familias de antibióticos como las quinolonas y lincosamidas, lo que limita grandemente el tratamiento terapéutico (10, 11, 12).
El gen mecA es una región altamente conservada entre las especies de estafilococos, muestra alto nivel de homología en SAMR y estafilococos coagulasa negativos resistentes a meticilina, por lo que es considerado como un marcador molecular adecuado en la determinación de resistencia en todas las especies de estafilococos (12). Sin embargo, en la actualidad se han descrito en varios países europeos, aislamientos SAMR portadores del gen mecC, procedentes de humanos y diversas especies animales. No obstante, los escasos estudios epidemiológicos realizados hasta la fecha indican que la prevalencia de SAMR portador de mecC es baja entre la población humana (32, 33). En esta investigación, la resistencia a meticilina estuvo codificada por el gen mecA ya que todos los aislamientos dieron positivo para este gen, razón por la cual no se investigó este nuevo gen.
Las cepas de S. aureus portadoras de los genes de leucocidina Panton-Valentine, son una amenaza emergente en todo el mundo, causando una variedad de infecciones incluso en individuos sanos. Se han realizado esfuerzos intensivos a lo largo de los últimos años hacia la detección y análisis de estos genes (15).
Los resultados obtenidos para verificar la producción del gen lukS/F-PV en el presente estudio son similares a los valores presentados por Guisty y cols (6) y Osman y cols (15), quienes obtuvieron 65,00% y 58,10% de positividad, respectivamente. Sin embargo, otros autores (29, 34, 35), reportaron porcentajes inferiores 18,8%, 7,1% y 6%, respectivamente, en la amplificación de estos genes.
En la población pediátrica evaluada en este estudio, los genes lukS/F-PV se detectaron en un 54,17%. Resultados diferentes obtuvieron Jiménez y cols (36) y Correa y cols (37), quienes mostraron cifras para estos genes de 73,00% y 80,92%, respectivamente.
Otros estudios han demostrado una fuerte predisposición de estas cepas en pacientes más jóvenes y previamente sanos, Munckhof y cols (38), observaron una disminución constante de la presencia de PVL con el aumento de la edad, esto lo atribuyeron al fortalecimiento de la inmunidad asociado a la edad y a la inclinación natural de niños y adultos jóvenes de adquirir estas cepas por contaminación de piel durante la práctica de algún deporte o por juegos propios de su edad (39).
La relación entre la presencia de PVL, tipos de pacientes y tipo de muestras en esta investigación, reflejan resultados similares con los presentados por Giusty y cols (6), quienes reportaron que la incidencia de SAMR productores de PVL en infecciones de PTB fue de 81% en pacientes pediátricos y 59% en adultos, no existiendo diferencia estadísticamente significativa en la prevalencia de dichas infecciones entre ambos grupos de pacientes.
]]> En España se han publicado alrededor de 40 casos, casi la mitad en edades pediátricas. La mayoría concierne a la experiencia obtenida de varios hospitales hasta el año 2007. Fundamentalmente concernientes a infecciones cutáneas leves, pero también se han comunicado casos graves de neumonía y meningitis (3).Todas las cepas SAMR analizadas en este estudio son productoras del gen mecA. La determinación de los genes de PVL revelaron un porcentaje de positividad de 50% (21 cepas). Se observó una mayor recuperación de genes codificadores para PVL en cepas asociadas con muestras de PTB tanto en pacientes pediátricos como adultos.
Tener conocimiento sobre la prevalencia de SAMR y sus factores de virulencia es útil para el tratamiento y control de las infecciones adquiridas en los hospitales y en la comunidad. Estudios moleculares han evidenciado, que algunos de estos aislamientos portan genes codificadores de PVL, las cuales conducen a infecciones con diferente apariencia clínica, cuya mortalidad puede llegar al 75%. Por lo tanto, la monitorización frecuente de este patógeno, su susceptibilidad a los antibióticos y la determinación de sus factores de virulencia es de gran importancia en el control y tratamiento de las infecciones (29).
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