REMOCIÓN DE ESTIRENO POR Phanerochaete chrysosporium EN CULTIVO LÍQUIDO

Teresa G. Roldán-Carrillo. Licenciada en Ingeniería Bioquímica Industrial, UAM-Iztapalapa. M.C. y cursante de doctorado en Biotecnología Ambiental, CINVESTAV-IPN, México.

Refugio Rodríguez-Vázquez. Licenciada en Química, Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas (E.S.I.Q.I.E.-IPN). M.C. en Química Orgánica, CINVESTAV-IPN. Ph.D. en Ciencias de la Madera, Universidad Estatal de Colorado, Fort Collins. Dirección: Depto. de Biotecnología y Bioingeniería, CINVESTAV-IPN, Av. IPN 2508, Zacatenco. AP 14740, 07000, México, D.F. e-mail: rrodrig@mail.cinvestav.mx.

Humberto Vázquez-Torres. Licenciado en Química, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). MC en Química y Dr. en Ciencias, UAM-I. Dirección: Depto. Física, Área Polímeros, UAM-I. Av. Michoacán y Purísima, Vicentina, 09340, México, D.F.

Judith Cardoso-Martínez. Licenciada y M.C. en Química, UNAM. Dr. en Ciencias en Química, UNAM. Dirección: Depto. Física, Área Polímeros, UAM-I. Av. Michoacán y Purísima, Vicentina, 09340, México, D.F.

Ángeles Torres-Domínguez. Licenciada  en Ingeniería Bioquímica Industrial, UAM-I. Maestría en Biotecnología E.N.S. A.I.A, Francia. Doctora en Química Biología, Universidad de Montpellier, Francia. Dirección: Centro de Investigación de Polímeros S.A. de C.V. del Grupo COMEX,  Marcos  Achar Lobaton No. 2. Tepexpan 55885, Edo. de México.

El objetivo de este trabajo fue demostrar si un hongo ligninolítico, Phanerochaete chrysosporium, podría tener la capacidad de 1) tolerar altas concentraciones de estireno y 2) remover el estireno en un cultivo líquido. Los resultados mostraron que el hongo fue capaz de crecer a concentraciones de estireno bajas (200mg/l) y relativamente altas (1500mg/l). Se mostró que 40 y 46% de estireno fue biodegradado, respectivamente, en 35 días. Sin embargo, 30 y 53%, fue removido por volatilización. La detección de la actividad enzimática de lignina peroxidasa en el cultivo del hongo con estireno a las dos concentraciones, quizás implique su participación en la biodegradación de este compuesto. El ácido benzóico fue detectado en el cultivo como producto de la biodegradación.

The object of this work, was to demonstrate if a recognized ligninolytic fungus Phanerochaete chrysosporium would be able to 1) tolerate high styrene concentrations, and 2) remove styrene in a liquid culture. It was observed that the fungus was able to grow at low (200mg/l) and relatively high concentrations (1500mg/l). It was shown that 40 and 46% of styrene was biodegraded, respectively, in 35 days. However, 30 and 53% was removed by volatilization. Detection of peroxidase activity on the fungal culture containing styrene at two concentration may imply its participation in the biodegradation of this type of compound. Benzoic acid was detected in the culture as a degradation product.

O objetivo deste trabalho foi demonstrar se um fungo ligninolítico, Phanerochaete chrysosporium, poderia ter a capacidade de 1) tolerar altas concentrações de estireno y 2) remover o estireno em um cultivo líquido. Os resultados mostraram que o fungo foi capaz de crescer a concentrações de estireno baixas (200mg/l) e relativamente altas (1500mg/l). Se mostrou que 40 e 46% de estireno foi biodegradado, respectivamente, em 35 dias. Porém, 30 e 53%, foi removido por volatilização. A detecção da atividade enzimática de lignina peroxidasa no cultivo do fungo com estireno às duas concentrações, talvez implique sua participação na biodegradação deste composto. O ácido benzóico foi detectado no cultivo como produto da biodegradação.

La producción y uso de hidrocarburos aromáticos sintéticos, tales como el estireno, ha resultado en su disposición inapropiada y por lo tanto un incremento en el ambiente de estos compuestos. El control inadecuado de materiales tóxicos ha propiciado el aumento de la contaminación en suelos, aire, agua subterránea y superficial. El estireno ha tenido muchos usos, como la manufactura de poliestireno, plásticos y copolímeros de estireno-butadieno utilizado en la elaboración de neumáticos. La incorporación del estireno en el ambiente, puede ocurrir por diversas rutas, incluyendo aguas residuales de industrias, evaporación y pirrólisis de poliestireno, causando serios problemas ambientales al ecosistema, debido a su potencial tóxico y propiedades carcinogénicas (Warhurst y Fewson, 1994), por lo que es necesario e importante desarrollar tecnologías para su eliminación (Braun-Lüllemann et al., 1997). Los métodos biológicos representan una alternativa adecuada para la eliminación de dichos compuestos. Sin embargo, se deben estudiar los mecanismos por los cuales los microorganismos llevan a cabo la degradación. En la actualidad la mayoría de las investigaciones sobre la degradación de estireno se han enfocado en bacterias, siendo muy pocos los trabajos reportados en el caso de los hongos. Los hongos de la pudrición blanca como Phanerochaete chrysosporium son capaces de degradar una amplia variedad de compuestos aromáticos (Reddy, 1995) a través de enzimas, entre las cuales se han reportado las ligninolíticas, como por ejemplo la lignina peroxidasa (LiP) (Tien et al., 1988) y la manganeso peroxidasa (MnP; Kuwuahara et al., 1984). No obstante, hay pocos estudios (Braun-Lüllemann et al., 1997) que muestran la degradación de compuestos monoaromáticos no polares, como el estireno, por hongos ligninolíticos.

El objetivo de este trabajo fue demostrar si P. chrysosporium era capaz de 1) tolerar altas concentraciones de estireno y 2) remover estireno.

Phanerochaete chrysosporium Burdsall (cepa H-298) fue obtenido de la colección de cultivos microbianos (CDBB) del CINVESTAV-IPN, México. El hongo fue conservado en aceite mineral a 4ºC antes de ser utilizado. El hongo se creció en agar bacteriológico/extracto de malta (AEM) al 2% a un pH de 4,5 a 39ºC durante 36 horas. Como inóculo se usaron dos rodajas de 0,5cm de AEM con hongo.

El cultivo líquido se realizó en botellas serológicas de 125ml selladas conteniendo 30ml de medio de cultivo deficiente en nitrógeno (Kirk et al., 1978) al cual se adicionó 10g/l de glucosa. Este medio es propicio para la expresión de las enzimas ligninolíticas. Se establecieron los siguientes tratamientos: a) Control, sin estireno; b) con estireno (200 y 1500mg/l); y c) controles con estireno (200 y 1500mg/l) pero sin hongo. Cada botella fue inoculada con 2 rodajas de AEM con hongo, incubadas a temperatura ambiente (25ºC) y aereadas diariamente bajo condiciones estériles durante 10 min. Cada tratamiento se realizó por duplicado.

Evolución de CO2. La evolución de CO2 fue utilizada como método indirecto para determinar la actividad y crecimiento de P. chrysosporium (Mitchel, 1992) y medida en un cromatógrafo de gases Gow-Mac 580, acoplado a un detector de conductividad térmica. Se empleó helio como gas acarreador a un flujo de 55ml/min. Las condiciones de operación fueron: temperatura de la columna, 28ºC, temperatura del detector, 100ºC, y temperatura del inyector, 40ºC. Los datos fueron procesados e integrados usando el paquete estadístico Primary Computing Integration (PCI), para la determinación de la producción de CO2.

Determinación de las actividades enzimáticas extracelulares. La actividad de lignina peroxidasa (LiP) fue determinada mediante la oxidación de alcohol veratrílico (Aldrich Chemical) a veratraldehído. Se midió la absorbancia a 310nm (e = 9300) según Tien y Kirk, (1988). La actividad fue reportada como la cantidad de veratraldehído producida por ml (U/ml). La actividad de manganeso peroxidasa (MnP) fue determinada de acuerdo al método de Kuwuahara et al, 1984, empleando rojo de fenol como sustrato.

Determinación de la remoción de estireno. La extracción de estireno se llevó a cabo con metanol grado HPLC dentro de las botellas serológicas. La cuantificación de estireno en el cultivo líquido se realizó mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), utilizando un cromatógrafo Varian 9050 con detector de UV a 254nm acoplado a una columna C18. La fase móvil fue acetonitrilo/agua (50:50%) a un flujo de 1ml/min y se empleó metanol como disolvente (Marconi et al., 1996). El tiempo de corrida de cada muestra fue de 15 min.

Figura 1. Crecimiento de Phanerochaete chrysosporium. a) Control sin estireno, agregados homogéneos con formación de polisacáridos y b) con estireno (200 ó 1500 ppm) agregados heterogéneos, de diferente tamaño, superficie lisa, sin la producción de polisacárido.

Las velocidades de producción de CO2 por P. chrysosporium, determinadas como una medida indirecta de la actividad del hongo (Mitchel, 1992; Rodríguez-Vázquez et al., 1999) fueron afectadas significativamente por la adición del estireno. En 30 días (Figura 2) el CO2 producido disminuyó a la mitad en 200mg/l de estireno (0,9314h-1) y a un tercio en 1500mg/l (0,6247 h-1), comparados con la cinética control (1,8197h-1), lo cual posiblemente fue debido a inhibición por la presencia del estireno (Hartmans et al., 1989). No obstante, hasta los 12 días no hubo diferencia significativa en la evolución del CO2 a 200mg/l de estireno con respecto a los controles. Probablemente la adición de glucosa al medio de cultivo permitió el incremento en el crecimiento del hongo, soportando la presencia de estireno, el cual se redujo a 40 y 46% para 200 y 1500mg/l de estireno, respectivamente (Figura 3). Tal disminución se relacionó con la presencia de enzimas ligninolíticas, que fueron detectadas después de 15 días. Las enzimas ligninolíticas fueron producidas durante el metabolismo secundario, con una actividad máxima de LiP (7,9 U/ml) detectada a los 20 días, después de que la evolución de CO2 disminuyó (Figuras 4 y 2, respectivamente). Se considera que las concentraciones relativamente altas de estireno limitaron el crecimiento del hongo, pero no la actividad ligninolítica. En la cinética de control la actividad de lignina peroxidasa se observó después de 10 días; sin embargo, a concentraciones de estireno de 200 y 1500mg/l, la actividad se desfasó a 20 y 24 días, respectivamente. No obstante que a 200mg/l la actividad se mantuvo por más tiempo (Figura 4). La actividad de MnP no fue detectada en el cultivo líquido, como se ha apreciado en estudios previos (Cruz-Córdova et al., 1999), empleando la misma cepa pero en cultivo sólido. Incluso en dichos estudios, durante el metabolismo secundario se detectaron cantidades relativamente altas de las enzimas ligninolíticas, atribuido a la presencia del manganeso en el bagazo. Lo anterior implica que en una primera etapa, antes de los 20 días, cuando se presenta la mayor remoción de estireno, a ninguna de las dos concentraciones hubo una participación significativa de las enzimas ligninolíticas, ya que la MnP no se detectó y la LiP presentó muy baja actividad (Figura 4). Por ello se podría atribuir a otras enzimas la biodegradación del estireno. Sin embargo, después de los 20 días fue evidente el aumento en la actividad de LiP, por lo que su participación es muy probable.

Figura 2. Evolución de CO2 producido por Phanerochaete chrysosporium durante su crecimiento: a) control sin estireno, b) con 200mg/l de estireno y c) con 1500mg/l de estireno.

Figura 3. Cinética de remoción de estireno por P. Chrysosporium. a) 200mg/l de estireno inicial. b) 1500mg/l de estireno inicial.

El estireno es un compuesto volátil, parcialmente soluble en agua a 300 mg/l (Warhurst y Fewson, 1994). Por ello, para evitar pérdidas, específicamente por volatilización, se emplearon botellas serológicas selladas y se controló el suministró de aire diario, con el fin de permitir el reintercambio de atmósfera y por lo tanto el crecimiento del hongo bajo condiciones aerobias. Mediante cromatrografía de HPLC se cuantificó la remoción de estireno en el cultivo. El estireno total removido del sistema con hongo fue de 70 y 99% en 30 días a concentraciones iniciales de 200 y 1500mg/l, respectivamente. En los tratamientos con estireno sin hongo (controles), se observó una disminución de estireno de 30 y 53% para 200 y 1500mg/l, respectivamente, correspondiente a una pérdida abiótica, atribuida principalmente a la volatilización a causa de las caracterísiticas fisicoquímicas del compuesto y de la aireación del sistema, que aunque fue controlada no evitó la pérdida de este compuesto. Por lo que únicamente el 40 y 46% de remoción de estireno, se atribuye a la biodegradación por el hongo (Figura 5).

Figura 5. Cinética de remoción de estireno por P. chrysosporium, debido a la biodegradación y por pérdidas abióticas (volatilización, adsorción por el hongo).

En los cromatogramas de HPLC se observaron 2 picos nuevos, a 2,5 y 7,5 min. El primero correspondió al ácido benzóico y el segundo no pudo ser identificado (Figura 6b). Hartmans et al. (1990) reportaron una mezcla de intermediarios de feniacetaldehido y ácido fenilacético, pero empleando bacterias aisladas de suelo y además se atribuyó la participación de actividades de monooxigenasas, óxido isomerasa y fenilacetaldehído dihidrogenasa en la producción de dichos metabolitos.

Figura 6. Cromatogramas de HPLC de estireno de la cinética de remoción: a) tiempo inicial, y b) a 35 días, se observó la aparición de dos picos adicionales, 1) de ácido benzóico o feniletanodiol, 2,5 min, y 2) 2-feniletanol, 5,5 min.

Estos resultados son promisorios, ya que indican el potencial de degradar cantidades relativamente elevadas de estireno mediante hongos de la pudrición blanca, con la subsecuente posibilidad de implementar una tecnología para la remoción de estireno de aguas, suelo y/o aire.

Los autores agradecen el apoyo del Instituto Mexicano del Petróleo FIES-95-106_VI/CONACYT y la beca otorgada a Teresa Roldán Carrillo, por el CONACYT.

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