REDUCCIÓN DEL DESARROLLO DE HONGOS FITOPATÓGENOS CON EXTRACTO DE CARDÓN LEFARIA (Cereus deficiens OTTO & DIERT)
Renzo Zapata, María E. Sanabria y Dorian Rodríguez
Renzo Zapata. Ingeniero Agrónomo, Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado (UCLA), Venezuela. e-mail: renzoj@latinmail.com
María E. Sanabria. Licenciada en Biología y M.Sc. en Botánica, UCLA Profesora, UCLA. e-mail: mesanabria@ucla.edu.ve
Dorian A. Rodríguez. Ingeniero Agrónomo y Ph.D. en Fitopatología, UCLA. Profesor, UCLA. e-mail: rdorian@ucla.edu.ve
Resumen
Con el objeto de buscar alternativas naturales para el control de enfermedades en plantas, se hicieron extracciones etanólicas desgrasadas (EED), etanólicas sin desgrasar (EESD) y acuosas (EA) de secciones medias del tallo de Cereus deficiens (Cactaceae) colectados en El Tocuyo, estado Lara, Venezuela. Se determinó cualitativamente la presencia de metabolitos secundarios en el EED y se evaluó el efecto de los extractos sobre el desarrollo in vitro de 10 hongos fitopatógenos crecidos en papa-dextrosa-agar con 0, 25, 50 y 75% de los extractos. Los resultados indicaron la presencia de aceites esenciales, polifenoles, taninos y saponinas. Se encontró un efecto significativo (P<0,001) de los extractos sobre la reducción del crecimiento micelial de todos los hongos ensayados, especialmente de Phytophthora infestans y Sclerotium rolfsii, donde se obtuvieron reducciones de 70 a 94% en el crecimiento micelial. El mayor efecto lo mostraron EED y EESD. El efecto reductor de los extractos fue directamente proporcional a la concentración utilizada. Los resultados indican el potencial de C. deficiens como controlador de hongos fitopatógenos.
Summary
In search for natural alternatives of plant disease control, mid sections of stems of Cereus deficiens (Cactaceae) collected at El Tocuyo, Lara State, Venezuela, were subjected to ethanolic degreased (EDE), ethanol non-degreased (ENDE) and aqueous (AE) extractions. Secondary metabolites were determined qualitatively in EDE and the effect of extracts on mycelial growth of 10 plant pathogenic fungi was tested. The latter test was performed at extraxct concentrations of 0, 25, 50 and 75%. Results indicated the presence of essential oils, polyphenols, tanins and saponins. There was a significant effect (P<0.001) of the extracts in reducing mycelial growth of all tested fungi, especially Phytophthora infestans and Sclerotium rolfsii, where the extracts caused 70-94% reduction. The largest effect was shown by EDE and ENDE. Growth reduction increased as did the extract concentration. Results indicate the potential of C. deficiens as a controller of plant pathogenic fungi.
]]> ResumoCom o objetivo de buscar alternativas naturais para o controle de enfermidades em plantas, fizeram-se extrações etanólicas desengorduradas (EED), etanólicas sem desengordurar (EESD) e aquosas (EA) de secções médias do caule de Cereus deficiens (Cactaceae) coletados em El Tocuyo, estado Lara, Venezuela. Determinou-se qualitativamente a presença de metabolitos secundários no EED e avaliou-se o efeito dos extratos sobre o desenvolvimento in vitro de 10 fungos fitopatogêneos crescidos em papa-dextrosa-agar com 0, 25, 50 e 75% dos extratos. Os resultados indicaram a presença de azeites essenciais, polifenois, taninos e saponinas. Encontrou-se um efeito significativo (P<0,001) dos extratos sobre a redução do crescimento micelial de todos os fungos ensaiados, especialmente de Phytophthora infestans e Sclerotium rolfsii, onde se obtiveram reduções de 70 a 94% no crescimento micelial. O maior efeito foi mostrado por EED e EESD. O efeito redutor dos extratos foi diretamente proporcional à concentração utilizada. Os resultados indicam o potencial de C. deficiens como controlador de fungos fitopatogêneos.
PALABRAS CLAVE / Extracto Vegetal / Metabolitos Secundarios/ Phytophthora infestans /
Recibido: 12/02/2003. Modificado: 08/05/2003. Aceptado: 12/05/2003
Introducción
Las plagas (insectos y patógenos) constituyen la principal limitante de la producción agrícola. Su control se ha basado, tradicionalmente, en el uso de productos químicos sintéticos, muchos de los cuales han producido, como efecto secundario, problemas de desequilibrio ambiental, de salud humana y el surgimiento de poblaciones de plagas más agresivas y resistentes a ellos (FAO, 2002). En humanos, existe referencia de una alta incidencia de enfermedades y diversos cuadros clínicos por intoxicación (Ramírez, 2001), detectándose elevados niveles de pesticidas en la población (Tagliaferro, 2002).
Estos problemas han llevado a la búsqueda de alternativas de control de plagas que se inserten en el desarrollo de agrosistemas sostenibles, basados en un manejo integrado del cultivo sin alterar el equilibrio del sistema (Bunch, 1997). Una de estas alternativas es el uso de extractos de plantas que actúan como pesticidas o simplemente como reguladores del desarrollo de los patógenos (Cuttler y Schmutteres, 1999). El efecto fungistático o fungicida de extractos de plantas cultivadas o silvestres ha quedado demostrado en diversos patosistemas (Dubey y Kishore, 1987; Rao et al., 1992; Northover y Schneider, 1993; Awuah, 1994; Pandey y Dubey, 1994; Müller-Riebau et al., 1995; Tewari, 1995; Bianchi et al., 1997; Rodríguez y Montilla, 2002).
La actividad antimicrobiana de los extractos de plantas está asociada a la presencia de metabolitos secundarios. La fracción fenólica de aceites esenciales de varias plantas aromáticas ha mostrado ser tóxica contra Fusarium moniliforme, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum y Phytophthora capsici (Müller-Riebau et al., 1995). Los aceites esenciales combinados de Ocimum canum, Chenopodium ambrosioides y Lippia alba también fueron tóxicos contra un amplio rango de hospederos, entre los que estaban R. solani, Alternaria solani, A. alternata, F. moniliforme y F. oxysporum f. sp. vasinfectum (Dubey y Kishore, 1987). Rao et al. (1992) determinaron la fungitoxicidad de los aceites esenciales de la semilla de Cuminum cyminum L y de los botones florales de Syzigium aromaticum L, así como que la fracción aldehídica y fenólica de éstos eran los responsables del efecto contra los hongos.
La vegetación tropical constituye un inmenso recurso de diversidad biológica cuyo potencial de uso ha sido escasamente estudiado (Bermúdez, 1999; Vele et al., 1999). Una de las especies abundantes en las zonas xerofíticas de Venezuela es el cardón lefaria (Cereus deficiens Otto & Dietr.), de la familia Cactaceae. Los miembros de esta familia son conocidos por su rusticidad y algunos de ellos han sido estudiados en el área de la alimentación humana (Vélez y Chávez, 1980) y por su capacidad de actuar como acondicionadores del suelo (Henríquez et al., 2000).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de los extractos acuoso y etanólico de C. deficiens sobre el desarrollo micelial de 10 hongos fitopatógenos y determinar los metabolitos secundarios presentes en los extractos.
]]> Materiales y MétodosObtención de los extractos
Se colectaron secciones medias del tallo (cladodio) de cardón lefaria en el Tocuyo, Municipio Morán, estado Lara, Venezuela. Las mismas se secaron en una estufa a 60ºC y se molieron en un molino rotativo convencional. El polvo obtenido se utilizó para la preparación de los extractos etanólicos desgrasado y no desgrasado siguiendo la metodología de Marcano y Hasegawa (1991), y del extracto acuoso según la metodología de Bianchi et al. (1997).
Extracto etanólico desgrasado (EED). A 250g del material molido se le agregó 200ml de hexano y se dejó reposar por 24h a temperatura ambiente (27 ±2ºC). Posteriormente, se filtró el líquido con papel Whatman #4 y se repitió el mismo procedimiento por cuatro veces. Luego del último filtrado, el material vegetal se dejó secar a temperatura ambiente hasta la completa evaporación del hexano y una vez seco se cubrió con 200ml de etanol al 96% y se mantuvo en reposo por 24h. Nuevamente se filtró y se realizó la extracción del crudo por destilación en un rotavapor marca Brikmann a 100ºC. Este proceso se repitió hasta que el alcohol extraído no presentó coloración alguna. El extracto se guardó bajo refrigeración (10ºC) hasta que se efectuaron las pruebas de bioactividad y fitoquímicas.
Extracto etanólico sin desgrasar (EESD). El material molido (250g) se cubrió con 200ml de etanol al 96% y se dejó reposar por 24h. Posteriormente se filtró el líquido y se obtuvo el extracto crudo mediante la destilación siguiendo el procedimiento anteriormente descrito.
Extracto acuoso (EA). Se utilizaron 20g de material vegetal seco y molido al cual se le practicó un prelavado con solución de hipoclorito de sodio al 0,26% por 2min y luego 4 lavados con agua destilada estéril; se agregó 400ml de agua doblemente destilada y esterilizada y se licuó la preparación por 5min. Posteriormente se filtró utilizando cuatro capas de gasa esterilizada y la suspensión acuosa se almacenó en el refrigerador.
Determinación de metabolitos secundarios
Los metabolitos secundarios se determinaron de forma cualitativa, según Marcano y Hasegawa (1991). Se utilizó un crudo obtenido por arrastre de vapor a partir de 20g de material vegetal seco, molido y desgrasado; diluido en 300ml de etanol. La presencia o ausencia de aceites esenciales se determinó por el olor característico, tanto en el material vegetal fresco como en el extracto. Los polifenoles y los taninos se detectaron por la presencia o ausencia de una coloración parda en el extracto al agregarle una solución de cloruro férrico al 1%. Para ello, el extracto se evaporó hasta sequedad, se retomó en agua y se filtró. Si los polifenoles y taninos estaban presentes, al tratar el crudo con solución de gelatina 1% en NaCl 1% se formaba un precipitado. Las saponinas se determinaron por la aparición de una espuma consistente que permanecía por 20min luego de la agitación manual del extracto acuoso. El extracto casi seco, se disolvió con KOH 0,5N y se filtró; luego se agregó ácido acético y se agitó con benceno. Al alcalinizar con NH40H, la manifestación de una coloración rojiza indicó la presencia de antraquinonas. Las cantidades de reactivos utilizadas fueron menores de 1ml.
Evaluación de bioactividad
La evaluación de bioactividad se realizó in vitro con cepas de los hongos Phytophthora infestans, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, F. oxysporum. f. sp. cubense, Lasiodiplodia theobromae, Sclerotium rolfsii, Colletotrichum gloeosporioides, F. moniliforme, Alternaria solani, Rhizoctonia solani y Bipolaris maydis. Las cepas se obtuvieron de la colección del laboratorio de Micología del Postgrado de Fitopatología de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado. Los hongos se mantuvieron en Agar Papa Dextrosa (APD) en cápsulas de Petri y tenían de 1 a 4 semanas de edad al instalar los ensayos.
]]> Los extractos EED, EESD y EA se agregaron al medio ADP después de esterilizar en autoclave, en las concentraciones de 0, 25, 50 y 75% (v/v) y se dispensaron 15ml en cada cápsula de Petri. Discos de 5mm de diámetro de cultivo de cada uno de los hongos en estudio se sembraron en las cápsulas que contenían el medio y se incubaron bajo condiciones de laboratorio a 27 ±2ºC, excepto P. infestans, el cual se incubó a 18 ±2ºC.Análisis estadístico
El diseño experimental del ensayo fue un factorial con 10 especies de hongos, 3 extractos y 4 concentraciones. Se evaluaron 4 platos de Petri distribuidos completamente al azar, en los cuales se hicieron 3 mediciones del diámetro de la colonia de cada hongo, cada 2 días hasta que el tratamiento testigo (0% concentración del extracto) llenó por completo las cápsulas de Petri (9cm). Posteriormente se construyeron las curvas de crecimiento para cada hongo y con los valores obtenidos el último día, se realizó el análisis de varianza de cada tratamiento y las pruebas de comparación de medias por el método de Tukey. Además, mediante interpolación, se calculó la Dosis Efectiva Media (ED50), definida como la dosis del extracto que ocasionaba el 50% de reducción del crecimiento de la colonia, en comparación con el testigo.
Resultados
Determinación de metabolitos. Las pruebas indicaron la presencia de aceites esenciales, saponinas, polifenoles y taninos y la ausencia de antraquinonas en los cladodios de C. deficiens.
Evaluación de la bioactividad de los extractos
Se encontraron diferencias altamente significativas entre los hongos, los extractos, las concentraciones y las diferentes interacciones (Tabla I). La comparación de los tipos de extractos, combinando todos los hongos y las concentraciones, indicó diferencias significativas (P<0,001) de EED y EESD con EA, pero no entre EED y EESD (Figura 1), donde el crecimiento micelial de los hongos fue menor. En las pruebas con el extracto acuoso no se incluyó P. infestans debido a las continuas contaminaciones observadas.
Igualmente, al combinar los diferentes hongos y los tipos de extractos, se observaron diferencias significativas (P<0,001) entre las concentraciones de los extractos (Figura 2), con una continua disminución del tamaño de la colonia a medida que se incrementaba la concentración de los extractos. Dentro de cada (tipo de) extracto, se observaron ligeras variaciones en el comportamiento de los hongos (Tabla II).
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La DE50 (Tabla III) se mantuvo más o menos constante en los diferentes extractos en los casos de P. infestans, S. rolfsii y F. oxysporum f. sp. lycopersici. La reacción ante los extractos fue diverso en el caso de A. solani, F. moniliforme, C. gloeosporioides, B. maydis y F. oxysporum f. sp. cubense. Con la excepción de C. gloeoporioides, los valores de DE50 fueron menores con los extractos etanólicos que con el acuoso, estando estos entre 22 y 44% de concentración (Tabla III).
Algunos hongos, como L. theobromae, R. solani y B. maydis, mostraron valores de DE50 entre 45 y 75%, indicando la baja susceptibilidad de los hongos a los extractos de C. deficiens.
Discusión
Los metabolitos secundarios encontrados en los extractos de C. deficiens son similares a los obtenidos por Pérez (2000) en el parénquima de los cladodios del cardón dato (Lemaireocereus griseus Haw. Britton & Rose) y del C. deficiens, demostrándose que no existen diferencias en este sentido entre esas especies, aún cuando fueron colectados en diferentes épocas y localidades. De los metabolitos estudiados, los aceites esenciales, y específicamente la fracción fenólica, han sido asociados con efectos fungistáticos o fungicidas. Dubey y Kishore (1987) encontraron una alta toxicidad de C. ambrosoides, L. alba y O. canum contra el crecimiento micelial de R. solani, en el cual lograron una reducción del 100, 100 y 97%, respectivamente, utilizando una concentración de 1000ppm del extracto. Encontraron, además, que la combinación de los tres extractos tuvo efecto controlador sobre 15 hongos a la concentración de 500ppm, lo cual demostró el efecto sinergístico de los aceites. Entre estos hongos se encontraban A. solani, F. moniliforme y F. oxysporum.
Rao et al. (1992) separaron y evaluaron el efecto fungistático de los aceites esenciales de varias plantas y encontraron la mayor efectividad contra Colletotrichum gloeosporioides, Curvularia pallescens y Periconia atrovirens, con aquellos extraídos de C. cyminum Mill y flores de S. aromaticum L. Ambas plantas mostraron un efecto fungistático a 1000ppm y un efecto fungicida a 2000 y 3000ppm. Determinaron también que el efecto fungitóxico del aceite mineral residía en sus fracciones aldehídica y fenólica.
Müller-Riebau et al., (1995) encontraron que los aceites esenciales de Thymbra spicata y Satureja timbra fueron altamente efectivos en la reducción del crecimiento de R. solani, S. sclerotiorum, F. moniliforme y P. capsici en la dosis de 1000ppm. Estos extractos contenían una mayor proporción de fenoles (carvacol y thymol) que los extractos de las plantas que no tuvieron efecto y se estableció que cuando la concentración de estos era superior a 100mg/ml se presentaba la actividad inhibitoria. Otros fenoles no tuvieron el mismo efecto, aunque estuviesen presentes en altas cantidades.
En el presente estudio se determinó la presencia de aceites esenciales y polifenoles. Aunque no se realizó la separación de dichos compuestos se sospecha que éstos son los responsables de sus efectos sobre el hongo. La diferencia en su nivel de susceptibilidad puede deberse a las cantidades y tipos de las fracciones fenólicas.
]]> Ninguno de los hongos ensayados fue totalmente controlado con cualquiera de los tres extractos, pero sí se obtuvieron reducciones significativas en el crecimiento micelial. P. infestans, por ejemplo, fue el más susceptible al extracto de C. deficiens. P. infestans es el microrganismo responsable de la enfermedad conocida como candelilla tardía de la papa y el tomate, y recientemente fue transferido del Reino Hongos al Reino Stramenopila, debido a sus características morfológicas, bioquímicas y genéticas (Alexopoulus et al., 1996). Debe investigarse si su mayor susceptibilidad al extracto de C. deficiens es debida a esas características diferenciales.Los extractos de C. deficiens fueron consistentemente efectivos contra S. rolfsii, un patógeno que habita en el suelo y causa la enfermedad conocida como pudrición blanda en varios cultivos (Agrios, 1988). Para reproducirse y diseminarse, este hongo produce esclerocios. Una reducción de su crecimiento vegetativo, por efecto del extracto, ocasionaría una disminución del número de esclerocios producidos y en consecuencia de la diseminación de la enfermedad.
El control de un hongo con el extracto acuoso de la planta indicaría la posibilidad de su uso inmediato por los productores. Los resultados de la presente investigación muestran que ese potencial podría ser en el caso de control de S. rolfsii y C. gloeosporioides (causante de la antracnosis en varios cultivos), en preparaciones similares a las utilizadas en este trabajo. Sin embargo, la fitotoxicidad, dosis y frecuencia de aplicación, son aspectos que deben ser determinados antes de su recomendación definitiva. Además de estos hongos, otros como A. solani pueden ser controlados con el extracto etanólico. En este caso, el extracto puede obtenerse con un equipo mínimo de destilación, como el utilizado en la presente investigación. Sin embargo, aspectos importantes del extracto, como la fitotoxicidad, termoestabilidad, durabilidad del efecto fungitóxico, sensibilidad a la luz y solubilidad, además de la dosis y frecuencia, deben determinarse antes de su recomendación.
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