Agustín Membrillo Ortega, Alejandro Córdova Izquierdo, Juan José Hicks Gómez, Ivonne María Olivares-Corichi, Víctor Manuel Martínez Torres y Javier de Jesús Valencia Méndez

In aerobic organisms oxygen is essential for life, but it can be toxic when favorable situations are presented in which an exaggerated production of reactive oxygen species (ROS): superoxide anion (O₂^-) and hydroxyl (^-OH), and due to the generation of hydrogen peroxide (H₂O₂), a ROS that can be a precursor of free radicals. ROS contribute to the molecular and structural damage that is present in a series of ailments where the antioxidant capacity (antioxidants and enzymes) of the organism is surpassed and is therefore unable to inactivate them, giving rise to the process called oxidative stress. The oxidative damage in the cell membrane is induced by the free radicals that lead to lipoperoxidation. The freezing and unfreezing process of the semen reduces the percentage of live sperm cells, thus affecting their mobility and viability, and therefore the gamete’s fertility, a phenomenon that is attributed to diverse factors, including temperature changes and ROS effects. During the metabolism of the spermatozoa, the mitochondria generate, unavoidably, ROS that are inactivated by the antioxidative mechanisms. To counteract the ROS effects generated by non-physiologic mechanisms or their excess, a variety of antioxidants has been used, seeking to annul or to minimize the effects. The object of this review is to identify the causes of damage to the spermatic cells during semen preservation and the antioxidative defense systems, both enzymatic and non-enzymatic.

Nos organismos aeróbicos o oxigênio é essencial para a vida, mas pode ser tóxico quando se apresentam situações favoráveis nas que se há uma produção exagerada de espécies de oxigênio reativa (ROS): anion super óxido (O₂^-) e hidróxilo (^-OH), e pela geração do peróxido de hidrogeno (H₂O₂) que é uma espécie reativa do O₂ e pode ser precursora dos radicais livres. As ROS contribuem ao dano molecular e estrutural que se apresenta em uma série de padecimentos em donde a capacidade antioxidante do organismo é repassada e, portanto incapaz de inativar as ROS, dando lugar ao processo chamado estresse oxidante. O dano provocado na membrana celular é induzido pelos radicais livres que levam a lipoperoxidação. O processo de congelamento e descongelamento do sêmen reduz a porcentagem de espermatozóides vivos, afetando com a mobilidade e a viabilidade, e, portanto a fertilidade do gameta, fenômeno atribuído a diversos fatores, incluindo as mudanças de temperatura e ao efeito das ROS. Durante o metabolismo as mitocôndrias do espermatozóide geram ROS que são inativadas pelos mecanismos antioxidantes. Para amenizar os efeitos das ROS gerados por mecanismos não fisiológicos ou em excesso se tem empregado uma variedade de antioxidantes, pretendendo anular ou minimizar seus efeitos. O objetivo desta revisão é identificar as causas que danificam as células espermáticas na preservação de sêmen e os sistemas de defesa antioxidante, enzimáticos e não enzimáticos.

Recibido: 20/11/2003. Aceptado: 8/12/2003

Después de la espermiación y de abandonar los testículos, los espermatozoides de mamíferos no tienen habilidad para fecundar; esta capacidad es adquirida inicialmente en el epidídimo, después se pierde al entrar en contacto con el plasma seminal y posteriormente se reestablece en el aparato reproductivo o genital de la hembra durante el proceso de capacitación (Hicks et al., 1972; Visconti y Kopf, 1998). La capacitación culmina con la adecuada reacción acrosomal que permite la interacción de los gametos maduros de machos y hembras y la fecundación del ovocito. Finalmente, en el caso de que haya ocurrido la implantación, sigue el proceso de desarrollo y diferenciación conducente al nacimiento de un individuo (Vilar-Rojas et al., 1982a, b; Darszon et al., 1999).

Por medio de las técnicas de inseminación artificial (IA) se han alcanzado avances sustantivos en la reproducción. Esta técnica se ha desarrollado desde finales de los años 50, siendo uno de los principales factores de interés que contribuyeron a su desarrollo la certeza de que el germoplasma de los machos reproductores no estuviera contaminado con patógenos (Thibier y Guerin, 2000). El descubrimiento del glicerol como crioprotector marcó otro avance en la tecnología de congelación de semen; sin embargo, el éxito que se ha tenido con semen de toro, no se ha podido reproducir en otros mamíferos como el suino, el ovino, el caprino y especies exóticas (Holt, 2000a). Esto obedece a que el éxito de la congelación del semen depende de numerosos factores que pueden ser peculiares en cada especie y deben ser optimizados de acuerdo al tipo de semen que se va a preservar (Sansone et al., 2000). Las diferentes especies presentan una serie de factores de variabilidad que deben considerarse, como son la fisiología y la bioquímica de los espermatozoides, la variación en la anatomía y fisiología del transporte espermático en el aparato reproductivo de la hembra y las características de la implantación del cigoto. Mientras que para la fecundación del ovocito en la vaca se requieren pocos millones de espermatozoides, en las cerdas se necesitan cantidades sensiblemente mayores. Esta diferencia cuantitativa entre las especies constituye una desventaja cuando se utiliza semen criopreservado, ya que en ciertos casos se requiere un mayor número de espermatozoides para lograr la concepción, lo que se dificulta debido a una menor supervivencia espermática durante el proceso de congelación (Holt, 2000a).

Independientemente de la técnica de congelación y descongelación del material germinal criopreservado de que se trate, el número de células apoptóticas aumenta en comparación con el semen fresco (Anzar et al., 2002). El semen criopreservado es utilizado con éxito en pocas especies y su aplicación a otras puede ser un problema. Como se mencionó, la pobre supervivencia espermática es uno de los principales problemas, por lo que el conocimiento de las características biofísicas de la membrana plasmática espermática es fundamental para proponer soluciones (Holt, 2000b). El almacenamiento de semen, particularmente en estado congelado, causa cambios bioquímicos y funcionales en los espermatozoides, resultando en una reducción de la movilidad y la viabilidad, con el obvio perjuicio posterior durante el transporte y la fertilidad (Leboeuf et al., 2000). La fertilidad se ve reducida debido a que los espermatozoides dañados o defectuosos generan grandes cantidades de especies reactivas de oxígeno y éstas son responsables del daño oxidativo (Ball et al., 2001a).

Los radicales libres son especies químicas que tienen un electrón no pareado y se comportan como moléculas altamente reactivas (Hicks, 2001); pueden causar daño por reaccionar con las diversas biomoléculas sustrayendo electrones para lograr su estabilidad. Los sustratos moleculares más frecuentes incluyen a los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares, nucleótidos en el ADN, proteínas y carbohidratos (Machlin y Bendich, 1987; Vilar-Rojas et al., 1996; Beckman y Ames, 1998). Entre las especies reactivas de oxígenos, conocidas como ‘ROS’ por sus siglas en inglés, destacan fundamentalmente (Beckman y Ames, 1998; Sommer et al., 2000) el anión superóxido (O₂^-), el hidroxilo (^-OH) y el peróxido de hidrógeno (H₂O₂). Este último es la principal especie reactiva, y aunque no es un radical libre, es la molécula que más se ha involucrado en el daño de los espermatozoides de equino (Baumber et al., 2000). El H₂O₂ no posee electrones libres y por lo tanto no es un radical libre, sin embargo, es una molécula muy reactiva y puede ser precursora de radicales ^-OH en presencia de metales de transición (Hicks y Medina-Navarro, 1995; Hicks, 2001). La reacción inicial de la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados se denomina lipoperoxidación y es generada por las ROS que inducen una reacción en cadena (Medina-Navarro et al., 1997; Wang et al., 2001).

Por otro lado, se ha demostrado que la síntesis del oxido nítrico (NO), que es un radical libre del nitrógeno, en espermatozoides de ratón y de humano puede inducir la peroxidación de los lípidos de la membrana espermática (Herrero et al., 1996), en este proceso se involucra adicionalmente el anión superóxido (O₂^-) que es una ROS que al interaccionar con el óxido nítrico forma peroxinitrito, una molécula precursora de radicales ^–OH, que realmente sería la responsable de la lipoperoxidación.

La interacción del radical ^-OH con el material genético modifica el ADN, pudiendo generar mutaciones y deleciones de la molécula. Los radicales libres han sido asociados a procesos tan diversos como son la inducción de apoptosis neuronal por daño oxidativo in vitro e in vivo (Al-Abdulla y Lee, 1998).

Las ROS inducen daño a los fosfolípidos de la membrana y del ADN en espermatozoides humanos y están implicados en la infertilidad masculina. La producción de ROS y el daño del ADN son mayores en espermatozoides inmaduros con retención citoplásmica y anormalidades morfológicas de la cabeza (Ollero et al., 2001). La peroxidación lipídica asociada a ROS provoca una disminución de la movilidad y viabilidad espermática, de la integridad acrosomal y del potencial de membrana mitocondrial (Baumber et al., 2000).

Aunque los radicales libres del O₂ representan uno de los mecanismos de defensa del organismo durante una infección ya que causan la lisis bacteriana, se ha demostrado que un exceso en la producción de estas especies reactivas produce daño a los organismos vivos por el estrés oxidante (Hicks, 2001). Este tipo de estrés se ha definido como un desequilibrio entre oxidantes y los mecanismos antioxidantes de los organismos, que involucran sistemas enzimáticos y moléculas orgánicas diversas entre las que se incluyen algunas vitaminas, como la E y la C (Hernández-Alvarado et al., 1995; Frei, 1999).

Las ROS cumplen una importante función en la fisiología espermática normal, pero el desequilibrio entre su producción y degradación causa efectos adversos sobre el espermatozoide (Ball et al., 2002). El estrés oxidante causado por el H₂O₂ provoca un mal funcionamiento en la mitocondria y conduce a una muerte celular programada (Liu et al., 2000). La interrupción de la cadena mitocondrial de transporte de electrones, o la inhibición de la misma, predispone a una formación de radicales libres (Hicks, 2001).

En espermatozoides humanos, el H₂O₂ causa una elevada fragmentación del ADN, además de reducir su movilidad y capacidad de fusión con los ovocitos (Aitken et al., 1998). La peroxidación lipídica es un ejemplo de daño oxidante en membranas celulares, lipoproteínas y otras estructuras que contienen lípidos. La peroxidación suele acompañar a diversos procesos degenerativos (Girotti, 1998).

Con base en lo anterior se puede considerar que un área prometedora de estudio es el posible pre-tratamiento contra los procesos de peroxidación de los espermatozoides o en el medio de dilución para proteger o conservar la integridad de su membrana durante el proceso de congelación y descongelación (Leboeuf et al., 2000), ya que se sabe que los metabolitos generados por las ROS durante los procesos oxidantes trastornan la fusión espermatozoide-ovocito, la movilidad espermática y la integridad del ADN (Aitken et al., 1998).

Mientras que los espermatozoides de pavo in vitro requieren condiciones aeróbicas para mantener su viabilidad, los espermatozoides de mamífero que son mantenidos in vitro con exceso de O₂ sufren una peroxidación lipídica que les causa daño en la membrana, reduce su movilidad y subsecuentemente su fertilidad (Donoghue y Donoghue, 1997).

En el equino, el uso del semen almacenado en refrigeración se ha visto limitado debido a la baja capacidad de fecundación. Una de las causas de la disminución en la fertilidad es la peroxidación de los lípidos de la membrana de los espermatozoides, pues el alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados los hace sumamente susceptibles (Aurich et al., 1997).

La peroxidación de los ácidos grasos poliinsaturados puede ser analizada por medio de la cuantificación de malondialdehido (Miller et al., 1998; Poovala et al., 1999), cuya formación se considera como un indicador de lipoperoxidación ya que es uno de los productos resultantes de la peroxidación de los lípidos de la membrana celular (Lysiac et al., 2002). Por lo tanto, altas concentraciones de este compuesto indican un aumento en la peroxidación.

El malondialdehido, al ser mezclado con el ácido tiobarbitúrico, reacciona formando un pigmento rojo que puede ser detectado a una longitud de onda de 530nm (Takacs et al., 2000). En el equino, la prueba del ácido tiobarbitúrico se ha usado para cuantificar la producción de malondialdehido en los espermatozoides, siendo esta proporcional a la concentración celular (Stradaioli y Magistrini, 2002). La peroxidación ocurre principalmente en la pieza media del flagelo de los espermatozoides equinos (Neild et al., 2002).

Los radicales libres se pueden formar a partir de moléculas estables mediante ruptura homolítica y reacciones de transferencia de electrones. Estas reacciones se dan por 1) absorción de energía ionizante, como radiaciones ionizantes, ultravioleta, visible y térmica; 2) reacciones redox de transferencia no enzimática de electrones en el caso de reacciones catalizadas por metales de transición; y 3) reacciones catalizadas por enzimas como la superóxido dismutasa que cataliza la formación del H₂O₂ (Hicks, 2001).

Aunque fisiológicamente se forman radicales libres durante la respiración mitocondrial, las anomalías en la mitocondria pueden contribuir a su producción excesiva (Al-Abdulla y Lee, 1998; Thannickal y Fanburg, 2000; Yves, 2000).

Los espermatozoides dañados durante una rápida congelación o aquellos espermatozoides morfológicamente anormales generan una cantidad mayor de ROS que los espermatozoides morfológicamente normales (Ball et al., 2001a).

La presencia de un estado de estrés oxidante se cree que regula la función espermática en dos sentidos, tanto benéfico como perjudicial. Resulta benéfico que una peroxidación leve puede promover la capacitación y la activación del espermatozoide, actúa como interruptor en la tirosina cinasa, ocurre una hipermovilidad inducida por el anión O₂^- y un aumento en la afinidad por la zona pelúcida. Es perjudicial el hecho que la peroxidación excesiva resulta en daño espermático (Gadella et al., 2001).

Todos los organismos aeróbicos derivan su energía metabólica de la reducción del O₂ y consecuentemente son susceptibles al daño por peroxidación causada por los radicales libres (Wang et al., 2001). Las reacciones producidas por estos radicales son más activas cuando el semen es almacenado a temperatura ambiente que en estado congelado (Vishwanath y Shannon, 2000). Sin embargo, durante la congelación y descongelación se forman radicales libres y estos tienen un efecto perjudicial (Limaye, 1997). Además, la generación de ROS por espermatozoides dañados tiene un importante impacto sobre las células viables restantes, ya que representan un daño acumulativo para los espermatozoides en almacenamiento (Ball et al., 2001a).

Existe un estrés asociado a la congelación causado por los cambios de temperatura a que los espermatozoides son sometidos durante el proceso de enfriamiento, los efectos de los componentes del medio y los mismos crioprotectores durante el proceso y, finalmente, por los efectos de la descongelación (Vishwanath y Shannon, 2000). Los espermatozoides de equino generan ROS en forma natural, pero esta generación aumenta con la congelación y descongelación. La criopreservación somete al espermatozoide a un estrés oxidante y posible daño del ADN (Baumber et al., 2002a).

El proceso de congelación del semen causa daños bioquímicos y funcionales a los espermatozoides resultando en una reducción de la movilidad y la viabilidad, perjudicando el transporte y la capacidad de fecundación, por lo que la fertilidad del semen congelado es más baja comparada con el semen fresco (Leboeuf et al., 2000). El daño a bajas temperaturas ocurre en la membrana plasmática, en la membrana acrosomal, en la mitocondria y en la vaina del axonema. Generalmente, el daño es más severo en el espermatozoide de carnero que en el de toro (Salamon y Maxwell, 2000).

La membrana plasmática y la membrana del acrosoma son más sensibles que la parte locomotora de la célula espermática. La membrana externa del acrosoma es más vulnerable que la parte interna. El daño por congelación y descongelación está acompañado por cambios bioquímicos como la liberación de transaminasa glutámica oxaloacética, pérdida de lipoproteínas y ácidos, disminución en la actividad de fosfatasa, liberación del colesterol, aumento de Na y disminución de K, inactivación de la hialorunidasa, pérdida de prostaglandinas, disminución de ATP y síntesis de ADP, y disminución de la actividad proteolítica acrosomal. Estos cambios pueden ser los responsables de una disminución de la integridad funcional, de la sobrevivencia in vivo y de la capacidad de fecundación (Salamon y Maxwell, 2000).

El procesamiento y almacenamiento de semen reduce la movilidad y causa un trastorno de la integridad de la membrana del espermatozoide y estos cambios están asociados con pérdida de la capacidad de fecundación (Maxwell y Stojanov, 1996). Los cambios en la composición de los lípidos de la membrana plasmática de los espermatozoides, en la movilidad, viabilidad e integridad de los espermatozoides han sido evaluados en semen de pavo en almacenamiento líquido in vitro, donde la movilidad, viabilidad y la integridad morfológica de los espermatozoides se ha visto reducida durante el almacenamiento; cambios en el contenido de los lípidos pueden ser explicados por la lisis de los fosfolípidos de la membrana seguidos por el metabolismo endógeno o por una compleja combinación de lisis, metabolismo y peroxidación (Douard et al., 2000).

Un antioxidante con función biológica se define como una sustancia que disminuye o evita la oxidación del sustrato resultando un agente reductor más potente (Hicks, 2001).

Por el contrario, la adición de sulfato ferroso al semen equino almacenado a 5°C aumenta la peroxidación, disminuyendo la movilidad espermática debido a que coadyuva a la generación de ROS (Ball y Vo, 2002). La preservación de semen líquido a 5°C es una técnica utilizada en el manejo reproductivo de los equinos y el daño oxidativo en los espermatozoides durante el almacenamiento es una causa potencial en la disminución de la movilidad y fertilidad, por lo que se ha evaluado el efecto de adicionar antioxidantes solubles en agua y solubles en lípidos para mantener la movilidad. Sin embargo, la adición de catalasa no ha logrado mejorar significativamente el mantenimiento de la movilidad, la viabilidad y la integridad acrosomal del espermatozoide de equino (Ball et al, 2001b). De hecho, incluso la catalasa puede disminuir la movilidad progresiva de los espermatozoides en semen almacenado a 5°C (Aurich et al., 1997). Sin embargo los niveles de catalasa y superóxido dismutasa han sido evaluados en muestras de semen humano, en donde la astenospermia está relacionada con una disminución de antioxidantes en el eyaculado (Siciliano et al., 2001).

Los espermatozoides del epidídimo son protegidos de los agentes reactivos del O₂ que pueden perjudicar el complejo proceso de maduración (Hinton et al., 1995; Tramer et al., 1998). La protección radica en cinco enzimas principales (Jung y Henke, 1996; Tramer et al., 1998): glutatión peroxidasa (GPx), fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa (PHGPx), glutatión reductasa (GR), superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT). Las enzimas intracelulares SOD, CAT y GR inhiben el daño oxidativo (Borek, 2001).

En el eyaculado de humano, las mitocondrias de los espermatozoides contienen grandes cantidades de PHGPx, una de las principales enzimas que ayuda contra la peroxidación producida por el H₂O₂. La disminución en los niveles de esta enzima en los espermatozoides del hombre está asociada con infertilidad (Imai et al., 2001).

El glutatión reducido es un agente antioxidante que está presente en el ambiente que rodea al espermatozoide de carneros y equinos (Fouchécourt et al., 1999); funciona en una variedad de importantes procesos fisiológicos y metabólicos en todas las células de mamíferos, incluyendo la desintoxicación de los radicales libres, metales y otros compuestos electrofílicos (Wang y Ballatori, 1998).

El sistema endógeno de defensa antioxidante reduce la toxicidad molecular del O₂ y de las especies reactivas del nitrógeno (RNS). Entre las moléculas antioxidantes se ha mencionado repetidamente a la melatonina, que es un eficiente "scavenger", aunque bajo ciertas circunstancias también puede ser pro-oxidante (Guzmán-Grenfell et al., 1999). La melatonina inactiva a radicales altamente reactivos como es el caso del radical ^-OH, el singlete de O₂, H₂O₂, NO, y el anión peroxinitrito. Además estimula las diversas enzimas antioxidantes (El-Sokkary et al., 1999; Reiter, 2000). De la misma manera, la albúmina sérica representa el principal y predominante antioxidante en el plasma (Bourdon et al., 1999).

El sistema de defensa antioxidante exógeno derivado de los componentes de la dieta comprende a las vitaminas E y C, el b-caroteno (Tribble, 1999), el retinol y los carotenoides, que son poderosos antioxidantes (Schuneman et al., 2001). Las vitamina C y especialmente la vitamina E disminuyen el grado de peroxidación lipídica. En los últimos 10 años la función celular antioxidante del a-tocoferol ha sido ampliamente investigada (Azzi et al., 2000). Sin embargo, la vitamina E en el semen equino almacenado a 5°C no mejoró significativamente la movilidad (Ball et al., 2001b). Además de la vitamina E, se ha evaluado el butil hidroxitolueno (Sommer et al., 2000) en espermatozoides de pavo durante el almacenamiento líquido, logrando un mejoramiento en la integridad de la membrana, en la movilidad y en la sobrevivencia espermática (Donoghue y Donoghue, 1997).

La vitamina C o ácido ascórbico es el principal antioxidante en el plasma y dentro de la célula, al donar electrones al radical tocoperoxil de la vitamina E oxidada; de esta manera recicla la función antioxidante del a-tocoferol, ayudando a proteger la membrana lipídica de la peroxidación (May, 1999). Se le ha utilizado para prevenir el efecto oxidante (Donoghue y Donoghue, 1997) de las lipoproteínas de baja densidad (Carr et al., 2000a).

En semen equino, la vitamina C ha tenido efectos protectores sobre la integridad de la membrana de espermatozoides almacenados a 5°C (Aurich et al., 1997), sin embargo, no mejora significativamente el mantenimiento de la movilidad (Ball et al., 2001b). En el pavo tampoco ha tenido efectos benéficos sobre las características seminales (Donoghue y Donoghue, 1997).

Por otra parte, las proteínas aisladas del plasma seminal de carnero revierten los daños causados por el choque por frío, aumentan la proporción de membranas intactas de los espermatozoides y se repara el daño causado, restaurándose la permeabilidad de la membrana plasmática (Barrios et al., 2000). De la misma manera, una fracción del plasma seminal de equino contiene fosfocaseinato y parece estar implicada en una actividad antioxidante (Batellier et al., 2001).

La vitamina E tiene un impacto en la prevención de enfermedades crónicas; se cree que este efecto está asociado al estrés oxidante y sus efectos benéficos han sido demostrados (Upreti et al., 1997; Brigelius-Flohé y Traber, 1999; Upston et al., 1999; Carr et al, 2000a). Sin embargo, como ya se mencionó la adición de a-tocopherol al semen equino a 5°C no reduce la peroxidación (Ball y Vo, 2002).

Además de la vitamina E, también se han evaluado el butil hidroaxianisol, el n-propil galato, y el feroxamina mesilato, por su habilidad para preservar la movilidad de espermatozoides de carnero, aunque el diluyente definido puede anular los efectos benéficos de estos (Upreti et al., 1997). El a-tocoferol puede actuar como un antioxidante o pro-oxidante, ya que inhibe o facilita la peroxidación lipídica de las lipoproteínas de baja densidad. La actividad pro-oxidante del a-tocoferol es prevenida por el ascorbato, por lo que la vitamina E solo puede ser efectiva en combinación con la vitamina C (Carr et al., 2000b). La combinación de la vitamina E, un antioxidante lipofílico, con vitamina C, un antioxidante hidrofílico, y/o selenio, desintoxica los lípidos de los peróxidos (Schwenke y Behr, 1998).

Por último, se ha demostrado que los extractos de ajo fresco y los flavonoides contienen antioxidantes que previenen el daño oxidativo (Eastwood, 1999; Borek, 2001). Los flavonoides están presentes en las plantas y contribuyen a la defensa antioxidante (Borek, 1997; Fremont et al., 1998). El consumo de soya se ha aconsejado porque contiene de manera natural y en cantidades considerables la isoflavona, un fitoestrógeno que reduce la peroxidación lipídica in vivo y aumenta la resistencia de las lipoproteínas de baja densidad en el humano (Wiseman et al., 2000).

El proceso de congelación y descongelación de células espermáticas reduce la viabilidad de los espermatozoides. Los cambios de temperatura a los que son sometidos provocan un choque por frío, lo que ocasiona que una cantidad considerable de células mueran y otras sean dañadas, afectándose la movilidad, la viabilidad, y la fertilidad. Los radicales libres generados por el proceso de congelación-descongelación y por el metabolismo celular dañan la membrana plasmática espermática, que al estar formada por ácidos grasos poliinsaturados es altamente susceptible a una lipoperoxidación. Aunque los espermatozoides son protegidos por sistemas de defensa antioxidante, estos pueden ser rebasados bajo situaciones en las que las ROS son generadas en exceso, lo que conduce al estrés oxidante, por lo cual puede resultar benéfico el adicionar antioxidantes a los diluyentes definidos para preservación de semen de los machos reproductores.

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