Marisela Rivera-Domínguez
Marisela Rivera-Domínguez. Químico Biólogo, Universidad de Sonora, México. Maestría en Nutrición y Alimentos, Centro de Investigación y Desarrollo, A.C. (CIAD), México. Doctorado en Ciencias en Biotecnología de Plantas, CINVESTAV/IPN, México. Investigador, CIAD, México. Dirección: CIAD, A.P.1735, Hermosillo, Sonora, 83000 México. e-mail: marisela@cascabel.ciad.mx
Resumen
El presente trabajo analiza aspectos biotecnológicos generales para el mejoramiento de características agronómicas de plantas hortofrutícolas, utilizando la tecnología del ADN recombinante. Mediante la misma se ha logrado obtener plantas transgénicas resistentes a insectos, hongos, bacterias y herbicidas, con mejores características de calidad durante poscosecha y con alto contenido nutricional. Se ha dado un enfoque especial a los aspectos biotecnológicos para el mejoramiento del mango, dado que durante las pasadas dos décadas muy pocos cultivares han sido mejorados. En algunos ensayos, los principales aspectos estudiados son la eficiencia en la inducción de embriones durante la embriogénesis somática y en la recuperación de plantas, la inducción al azar de mutantes para obtener plantas resistentes a agentes selectivos y la transformación con genes que regulan ciertas características agronómicas. La biotecnología tiene un alto potencial para proveer soluciones alternativas a problemas que demandan no sólo los productores de mango, sino también para los demás productores agrícolas.
PLANT BIOTECHNOLOGY AND BIOTECHNOLOGICAL ASPECTS OF MANGO
Summary
This paper gives an overview of general biotechnological procedures for the improvement of agronomical characteristics of plants using DNA recombinant technologies. Transgenic plants have been obtained which show resistance to insects, fungi, bacteria and herbicides, high nutritional value and improved quality traits during pre and post harvest. Special emphasis is placed on efforts to improve mango through biotechnology, given that very few improved mango cultivars have been released during the past two decades. Some assays involved studies on the induction of efficient embryo induction during somatic embryogenesis and on plant recovery, the random induction of mutants to obtain resistance to selective agents, and the transformation by genes that regulate given horticultural traits. Biotechnology has a high potential to provide alternative solutions to the problems claimed by mango producers as well as other horticultural producers.
A BIOTECNOLOGIA EM PLANTAS E ASPECTOS BIOTECNOLÓGICOS DA MANGA
Resumo
]]> O presente trabalho analisa aspectos biotecnológicos gerais para o melhoramento das características agronômicas de plantas hortofrutigranjeiras, utilizando a tecnologia do ADN recombinante, mediante a qual, tem-se logrado como objetivo a obtenção de plantas resistentes à insetos, fungos, bactérias, herbicidas, com melhores características de qualidade durante a pre e pós-colheita e com alto conteúdo nutricional. Tem-se dado um foco especial aos aspectos biotecnológicos para o melhoramento da manga, uma vez que, durante as duas décadas passadas muito poucas cultivares têm sido melhoradas. Em alguns ensaios, os principais aspectos estudados são a eficiência na indução de embriões durante a embriogenese somática e na recuperação de plantas, a indução ao acaso de mutantes para obter plantas resistentes à agentes seletivos e a transformação com genes que regulam certas características agronômicas. A biotecnologia tem um alto potencial para prover soluções alternativas a problemas que demandam não só os produtores de manga, mas também para os demais produtores agrícolas.Palabras clave / Biotecnología de Plantas / ADN Recombinante / Mango / Transformación Genética de Plantas /
Recibido: 26/08/2005. Aceptado: 13/12/2005.
Aspectos Generales de la Biotecnología en Plantas
La biotecnología tiene como objetivo el desarrollo de productos comerciales que contribuyan de forma benéfica para la humanidad. Esta disciplina fue definida como la aplicación de los conceptos teóricos de la ingeniería genética, la microbiología, la bioquímica y la ingeniería química, para procesar materiales con el uso de agentes biológicos y proveer productos con mejor calidad. Empíricamente, por muchos años los microorganismos tales como las bacterias y los hongos han sido utilizados en procesos de fermentación; actualmente se sabe que tanto los microorganismos como las células de eucariontes superiores pueden ser modificados, transfiriendo unidades específicas de información genética de un organismo a otro para obtener organismos modificados con propiedades nuevas y útiles para el ser humano (Glick y Pasternak, 1998).
Los principales problemas a los que se enfrenta la industria agrícola son ocasionados principalmente por la competencia de las plantas con las malezas, el ataque de patógenos tales como bacterias, hongos o virus, y el ataque por plagas de insectos, roedores y aves. Todo esto ocasiona la reducción del volumen de cosecha y la consecuente pérdida económica para los productores de granos, frutas y hortalizas. Muchas son las técnicas tradicionales de cultivo que se han empleado para contrarrestar dichos problemas. Entre ellas se encuentran el uso de productos químicos (fungicidas, insecticidas, herbicidas, etc), trampas, control biológico y el mejoramiento tradicional mediante la selección de variantes y de líneas resistentes (Gómez-Kosky, 1998). En poscosecha, las técnicas más comunes para la conservación de productos perecederos son la refrigeración, el encerado, los tratamientos químicos, la irradiación, el tratamiento hidrotérmico y la aplicación de ceras y atmósferas controladas (Carrillo-López y Félix, 1996)
Sin embargo, muchas de estas tecnologías cuando son utilizadas inadecuadamente pueden ocasionar, en algunos casos, daños en los tejidos que pueden provocar una maduración irregular, daño por frío, etc. y en otros, la acumulación de residuos químicos, todo ello redundando en pérdidas económicas. Como alternativa, la biotecnología de plantas y en particular la transferencia de material genético, representa una herramienta potencial para resolver problemas agrícolas con el mínimo riesgo, debido a que es una tecnología limpia, donde solo es modificada aquella característica que se quiere contrarrestar (Singh y Sansavini, 1998).
Los métodos biotecnológicos y moleculares ofrecen una alternativa a las técnicas convencionales debido a que permiten introducir uno o mas genes para la corrección de deficiencias de cultivares líderes (Mehlenbaker, 1995). La transformación de genotipos altamente adaptados, y su producción, dependerá de la estabilidad de la integración del material genético foráneo al genoma de la planta, seguida por la propagación in vitro y la consecuente regeneración para producir plantas intactas que expresen la información deseada (Singh y Sansavini, 1998).
Los altos niveles de productividad asociados con la agricultura moderna dependen generalmente de la protección de las especies cultivables contra la competencia de las malas hierbas, el ataque de virus, hongos e insectos. De ahí que desde finales de los años 40 estos agentes nocivos han sido controlados con el uso extensivo de productos químicos, trayendo consigo serios problemas agrícolas debido a su peligro potencial sobre los consumidores y sobre el ecosistema por el desarrollo de cultivares resistentes. La ventaja de la ingeniería genética en plantas es que provee de nuevos métodos de protección contra tales plagas, diminuyendo el potencial peligro del control químico (Fuller y Gallon, 1995). A continuación se mencionan algunas características que han sido manipuladas utilizando la biotecnología molecular con la finalidad principal de reducir las grandes pérdidas económicas en los productos hortofrutícolas.
Resistencia bacteriana. Las enfermedades bacterianas ocasionadas por Erwinia amilovora, Xantomonas campestris pv junglandis y Pseudomonas solanacearum por mencionar sólo algunas, causan grandes pérdidas en los productos hortícolas. Recientemente, genes antibacterianos como los que codifican para la proteína lactoferrina fueron utilizados para transformar células de tabaco en cultivo, las cuales exhibieron actividad antimicrobiana (Sun-Mee et al., 2003). Otros genes sintéticos o naturales han sido transferidos y expresados en plantas (Kuenhle et al., 1995); varios de ellos como el de la atacina, la lizosima, la lactoferrina y la cecropina B, o la SB5 (gene sintético) han sido utilizados para desarrollar vectores que se expresen en plantas (Hippe et al., 1989; Deste'fano-Beltran et al., 1990; Trudel et al., 1992; Duering et al., 1993; Tae-Jin et al., 2002).
]]> Resistencia a hongos. Las pérdidas económicas ocasionadas por hongos son muy elevadas, y el uso y abuso de los fungicidas como medidas de control aumentan el costo de la producción, seleccionan fitopatógenos resistentes y liberan residuos al ambiente. Se han desarrollado investigaciones sobre genes que codifican enzimas (estilbeno sintetasa) que están involucradas en la biosíntesis de compuestos que son tóxicos para los hongos (Hain et al., 1990) y otros genes que codifican para enzimas que hidrolizan la pared celular de los hongos y por lo tanto son antifúngicas, tales como las quitinasas y las glucanasas (Mikkelsen et al., 1992; Neuhaus et al., 1991). Zhue et al. (1994) mostraron que la co-expresion constitutiva de la quitinasa de arroz y la ß-1,3-glucanasa de alfalfa en arroz dan una gran protección contra Cercospora nicotinae. Los genes rip (proteína que inactiva ribosomas) y de un péptido antimicrobiano semejante a la heveína también han sido expresados en plantas para conferir resistencia contra hongos (Ja Choon et al., 2002; Ju-Kon et al., 2003).Tolerancia a herbicidas. Genes resistentes a herbicidas comerciales han sido aislados de microorganismos y plantas tales como el gen bar, aroA y als. El gen bar de Streptomyces hygroscopicus, que codifica para la fosfinotricina acetiltransferasa, provee resistencia mediada por la acetilación de la fosfinotricina (herbicida Basta; Murakami et al., 1986). Cabrera-Ponce et al. (1995) reportaron que la papaya "Maradol" transgénica que expresa el gen quimérico nos-bar exhibe resistencia al herbicida Basta. Otros genes utilizados para el control de malas hierbas son el gen hpt (higromicina fosfotransferasa) y el gen del citocromo P50 (Ohkawa et al., 1999; Chen y Punja, 2002).
Resistencia a insectos. Se han desarrollado plantas resistentes a insectos en las que se expresan genes tales como la d-endotoxina de Bacillus thuringiensis (Bt), inhibidores de proteasas, enzimas, metabolitos secundarios y lectinas de plantas. Los inhibidores de proteasas e inhibidores de tripsina afectan el sistema digestivo de los insectos. Se ha demostrado que las lectinas e inhibidores de proteasas afectan el crecimiento y desarrollo de los insectos y en muchas instancias no provocan su muerte (Hari et al., 2004). Los genes insecticidas que codifican para proteínas (cristal Bt) aisladas de Bacillus thuringiensis son los genes mas comúnmente probados para la resistencia a insectos (Fischoff et al., 1987). Plantas transgénicas de nuez que expresan la proteína Bt han mostrado resistencia al gusano "naval orange" (Amyelois transiella; Dandekar et al., 1994). Los genes de avidina y estreptavina (proteína que une biotina) han sido ensayados en tabaco y manzana para conferir resistencia contra insectos predadores Phthorimae operculella Zeller y Ephiphyas postvittana Walter, respectivamente (Markwick et al., 2003). El gen de la lectina gna de Galanthus nivalis confirió resistencia contra BHP ("brown planthopper") y GLH ("green leafhopper"; Nagadhara et al., 2003).
Control de la maduración. La maduración de los frutos es considerada como un proceso metabólico regulado durante el desarrollo. Originalmente, estos procesos fueron considerados procesos catabólicos en los que había ruptura de la organización celular. Sin embargo, el desarrollo de nuevas herramientas analíticas han puesto de manifiesto que se trata de un proceso regulado bajo estricto control genético (Goméz-Lim, 1999).
Es bien conocido que los frutos tienen la capacidad para sintetizar proteínas durante la maduración (Tucker y Grierson, 1987). En varias frutas hay un considerable incremento en el contenido de las proteínas durante este proceso. Por otro lado, también se ha reportado la síntesis de tRNA y rRNA y ciertos mensajeros (Marei y Romani, 1971). Se ha demostrado que ciertos mensajeros disminuyen, otros permanecen constantes y otros aumentan su expresión durante la maduración (Piechulla et al., 1985).
Se ha aislado y examinado la expresión de genes específicos de maduración de una gran variedad de frutos, pero poco se conoce acerca de su papel fisiológico en el desarrollo del fruto y solamente unos pocos, como son los que codifican para poligalacturonasas, pectinmetilesterasas, ACC oxidasas y ACC sintetasas, están relacionadas con alguna función particular de la maduración (Gómez-Lim, 1999). Mediante técnicas de biología molecular se ha expresado o bloqueado la expresión de algunas de estas enzimas. La Tabla I muestra los procesos de la maduración que han sido estudiados utilizando la transformación genética.
Mejoramiento de la calidad nutricional. Más de la mitad de la población pobre del mundo depende fuertemente de la agricultura y cerca de 3 billones de personas están comúnmente mal nutridas por falta de micronutrientes y vitaminas, lo que trae como consecuencia aumento en la morbilidad y mortalidad (Koundal, 2001; Welch y Graham, 2004). Más de las dos terceras partes de los niños del mundo mueren debido a deficiencias nutricionales de Fe, Zn y vitamina A, por lo que es importante utilizar las estrategias del enriquecimiento de los productos agronómicos comestibles (fortificar o biofortificar) para aumentar los niveles nutricionales de los alimentos (Welch y Graham, 2004). Algunos ensayos para la fortificación de alimentos, cual es el caso de las plantas transgénicas de arroz ("golden rice") con alto contenido de b-caroteno (precursor de la vitamina A), y el arroz con hierro ("ferritin-Fe rice"; Beyer et al., 2002; King, 2002). También se ha elevado el contenido del aminoácido metionina en plantas de papa, mediante la inhibición de treonina sintetasa (Altenbach et al., 1989), así como el contenido de lisina en tabaco mediante la sobreexpresión del gen dihidrodipicolinato sintetasa (Galili et al., 1997).
Estrategias de transformación genética en plantas
]]> Las técnicas de transformación utilizadas para generar plantas transgénicas se listan a continuación (Glick y Pasternak, 1998).- Transferencia mediada por el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Este es un sistema excelente y altamente eficiente, limitado principalmente a plantas monocotiledóneas.
- Bombardeo con microproyectiles (biobalística). Técnica utilizada en un amplio rango de plantas y tejidos. Es un método fácil y económico.
- Vectores virales. Una vía no muy efectiva para cultivos celulares y plantas completas.
- Transferencia directa a protoplastos. Puede usarse solo en protoplastos celulares de plantas que pueden ser regeneradas a plantas completas.
- Microinyección. Tiene uso limitado dado que sólo una célula puede ser inyectada. Además, requiere de entrenamiento altamente específico.
- Fusión de liposomas. Puede ser utilizado sólo en protoplastos.
- Electroporación. Generalmente limitado a protoplastos.
Regeneración de tejidos vegetales in vitro
El cultivo de tejidos no es un prerequisito para llevar a cabo la transformación genética de plantas, pero es empleado en casi todas las prácticas comunes de transformación, para llevar la transferencia eficiente del gen y para la selección y regeneración de las transformantes (Gamborg y Phillips, 1995).
]]> En un sistema de cultivo de tejidos lo mas importante es obtener un gran número de células regenerables que sean accesibles para la transformación genética y que puedan conservar la capacidad de regeneración durante la proliferación celular y los tratamientos de selección (Livingstone y Birch, 1995). No hay preferencia de utilizar la embriogénesis o la organogénesis en la regeneración de plantas transformadas.Embriogénesis somática. Es la formación de un embrión a partir de una célula sin que se haya dado la fusión de gametos. No es un fenómeno artificial y se le conoce en la naturaleza como una forma de apomixis llamada embrionía adventicia. La embriogénesis somática es un fenómeno biológico basado en la totipotencialidad de las células vegetales. Esta teoría expone la posibilidad de regenerar plantas completas a partir de cualquier célula de la planta, debido a que cada célula tiene la información genética necesaria para producir un organismo completo (Gómez-Kosky, 1998).
Los embriones somáticos se definen como una estructura bipolar producida de manera asexual, sin conexión vascular con el tejido madre. Contrariamente a los embriones cigóticos, los somáticos no contienen un nuevo juego de genes, sino que conservan la misma combinación genética del progenitor del cual es originario. Estas estructuras bipolares son capaces de crecer y formar plantas normales. El desarrollo de un sistema experimental para la regeneración de plantas vía embriogénesis somática incluye los siguientes pasos: inducción de embriones somáticos, desarrollo, proliferación, maduración, germinación y regeneración a planta completa (Gómez-Kosky, 1998).
Organogénesis. La organogénesis es un evento morfogenético que se caracteriza por su desarrollo unipolar, es decir, la formación de un primordio unipolar a partir de una yema, con el subsecuente desarrollo de aquel en un brote vegetativo, existiendo siempre una conexión entre los nuevos brotes y el tejido paterno. Estos brotes vegetativos son posteriormente puestos a enraizar en otra etapa, vía formación de primordios de raíces y el subsecuente enraizamiento final. En la organogénesis directa los brotes se forman directamente del explante y en la organogénesis indirecta lo hacen a partir de la formación de callos (Jiménez-González, 1998).
Aspectos Biotecnológicos del Mango
El mango (Mangifera indica L.) tuvo su origen en la India, donde ha sido cultivado por más de 4000 años. En México la introducción del mango tuvo lugar en 1779 (Mosqueda et al., 1996). Actualmente México ocupa el tercer lugar en producción, tras India y China, y es sin duda el país que mayor volumen exporta, siendo los EEUU, el principal país importador (www.fao.org).
Las variedades actualmente cultivadas en México son Haden, Tommy Atkins, Kent, Keitt, Ataulfo, Zill, Sensation, Oro, Manila, Manililla y otros materiales criollos (Agrovisión, 1994). Las primeras cuatro variedades, y recientemente la Ataulfo, han sido las variedades con mayor demanda en el mercado de exportación (Agromundo, 1996; www.mangoemex.org.mx).
La industria del mango se ve seriamente afectada por plagas y enfermedades. Es bien conocido que la antracnosis provocada por Colletotrichum gloeosporioides Penz es una enfermedad de alta dispersión e incidencia durante la floración y maduración de los frutos de mango, es controlada mediante la aplicación de productos químicos y en los frutos con el tratamiento hidrotérmico. Con respecto a las plagas, las moscas de la fruta son las plagas mas importantes para los productores de mango a nivel mundial y especialmente para México, por ser el principal exportador en el mercado internacional. El trampeo es la medida de control más importante, así como el tratamiento hidrotérmico para los frutos de exportación (Lizada, 1993).
Con la finalidad de contrarrestar algunos de los problemas más significativos en la producción del mango, existen programas de mejoramiento de cultivares donde se seleccionan variantes y líneas resistentes. Sin embargo, el mejoramiento por esta vía es difícil debido al largo período juvenil del árbol (Gómez Lim, 1999).
Mediante la variación somaclonal que existe durante varios ciclos de cultivo en un sistema de cultivo de células y de tejidos in vitro pueden obtenerse variantes genotípicas y fenotípicas. Sin embargo, no han sido reportadas en mango, pero sí en otros frutos perecederos tales como plátano, fresas y cítricos (Nehra et al., 1992; Starrantino et al., 1998; Ramage et al., 2004).
]]> Por otro lado, la selección in vitro de líneas de mango resistentes a Colletotrichum gloeosporoides fue reportado por Litz et al. (1991) y por Mathews y Litz (1992). En 1995, Jayasakar (1995) reportó que cultivares embriogénicos Hindi y Carabao sujetos a selección en presencia de cultivo filtrado purificado y parcialmente purificado de una cepa virulenta de C. gloeosporoides inhibieron el crecimiento del hongo debido a la presencia de dos hidrolasas extracelulares (quitinasas y beta-1,3-glucanasa).El mango tiene la característica de ser un producto altamente perecedero y por lo tanto con corta vida de almacenamiento, por lo que debe ser consumido en un período corto después de su cosecha. Es un fruto climatérico en donde el etileno juega un papel mayoritario durante la maduración. La estrategia común para extender la vida poscosecha y su disponibilidad es almacenar los frutos a bajas temperaturas y después exponerlos a etileno para su maduración (Lizada, 1993).
Genes de la ACC oxidasa, enzima involucrada en la producción del etileno y la oxidasa alterna, han sido clonados (Gómez-Lim, 1997) y podrían utilizarse para el control de la maduración del mango. La transformación genética con algunos de estos genes utilizando el mRNA en antisentido ha sido efectiva para bloquear la maduración de los frutos. Cruz-Hernández y Litz (1997) transformaron embriones de mango Hindi con A. tumefaciens LBA4404 que contenía genes en antisentido en un vector binario pBI121: ACC oxidasa, ACC sintetasa y la oxidasa alterna. Sin embargo, la maduración y la regeneración del material no fue eficiente.
Otras técnicas moleculares, relacionadas con marcadores moleculares y bioquímicos, han sido utilizadas también en estudios biotecnológicos de mango. En el caso de marcadores de proteínas, las isoenzimas son muy utilizadas como marcadores bioquímicos. Degani et al., 1992 utilizó isoenzimas para identificar el posible parentesco entre cultivares. Schenell y Knight (1992) reportaron que el cultivar Keitt no tenía ningún parentesco con Mulgoba, al cual se le atribuía su origen, gracias a un análisis de bandeo con IDH (isocitrato deshidrogenasa). En el caso de marcadores de ADN, Schenell et al., (1995) usaron análisis con marcadores de ADN usando RAPD ("Rapid Amplified Polimorfic ADN") para identificar cultivares de mango y determinar la relación genética entre cultivares. En 1997, López-Valenzuela et al. estimaron la diversidad genética entre 15 cultivares de mango utilizando marcadores de ADN (RAPD).
Potencial Biotecnológico para el Mejoramiento del Mango
La biotecnología mediada por la ingeniería genética tiene potencial para contrarrestar los siguientes problemas durante la producción del mango.
Alternancia. Se ha reportado que la actividad en el meristemo de la flor del gen LEAFY de Arabidopsis causó inicio en la floración en álamo transgénico (Weigel y Nilsson, 1995), por lo que puede ser posible sobrellevar los problemas de alternancia utilizando este gen bajo un apropiado promotor de desarrollo.
Talla del árbol. Mediante la introducción del gen rolC en plantas transgénicas de mango es posible generar plantas de menor tamaño. El gen rolC de Agrobacterium rhizogenes ha sido reportado con potencial para el control del tamaño de árbol y generar plantas pequeñas (Oono et al., 1987; Koshita et al., 2002; Boase et al., 2004).
Control de la maduración de frutos. Esto puede ser realizado mediante la utilización de estrategias del antisentido con genes tal como la ACC oxidasa con promotores dirigidos para su expresión en fruto.
Control de enfemedades. La transformación genética del mango con genes de defensa (defensinas y magaininas) así como los genes de quitinasas y glucanasas podrán conferir resistencia contra enfermedades ocasionada por bacterias y hongos.
]]> Control de insectos. Es posible realizar la transformación genética del mango con algunos de los genes Bt y las proteinas insecticidas X-endotoxinas, las cuales han sido utilizadas para el control de insectos en varias plantas.Selección de genotipos. Mediante el uso de los marcadores de ADN es posible seleccionar genotipos especiales los cuales servirían para reducir el número de cruzas utilizados en los procedimientos tradicionales para mejorar características específicas.
Conclusión
La biotecnología tiene potencial para proveer soluciones alternativas a los problemas que angustian a los productores de mango. Los sistemas de regeneración in vitro pueden ser refinados para cada cultivar y ser utilizados en la propagación clonal de cultivares comerciales y en la conservación de germoplasma, así como durante la transformación genética. La transformación genética del mango puede generar plantas resistentes a enfermedades y plagas, resolver o minimizar problemas de precosecha y poscosecha. Esto ciertamente es una promesa, donde es necesario trabajar para el perfeccionamiento de los protocolos biotecnológicos y así poder solventar dichos problemas.
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