CARACTERIZACIÓN ELECTROFORÉTICA DE LAS GLOBULINAS

DEL GRANO FERMENTADO DE TRES TIPOS DE CACAO

Ligia Ortiz de Bertorelli, Henry Maldonado, Pablo Parra y Lucía Graziani de Fariñas

Ligia Ortiz de Bertorelli. Licenciada en Química, Universidad Central de Venezuela (UCV). Magíster en Ciencia de los Alimentos, Universidad Simón Bolívar (USB), Venezuela. Profesora, UCV, Venezuela. Dirección: Instituto de Química y Tecnología, Facultad de Agronomía, UCV. Apartado 4579, Maracay 2101. Aragua, Venezuela. e-mail: ortizl@agr.ucv.ve

Henry Maldonado. Ingeniero Agrónomo y Estudiante de Maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos, UCV, Venezuela.

Pablo Parra Gómez. Ingeniero Agrónomo y Doctor en Ciencias Agrícolas, UCV, Venezuela. Profesor, UCV, Venezuela.

Lucía Graziani de Fariñas. Ingeniera Química, Universidad de Oriente, Venezuela. Magíster en Ciencia de los Alimentos, USB, Venezuela. Profesora, UCV, Venezuela. e-mail: ticoet@net-uno.net

RESUMEN

Se caracterizaron electroforéticamente las globulinas del grano fermentado de los cacaos tipo criollo, forastero y trinitario de la localidad de Cumboto, estado Aragua, Venezuela, para lo cual fueron cosechadas mazorcas de dos plantas por cada tipo de cacao, a razón de tres frutos por planta, en las parcelas El Paraíso, La Vega de Santa Cruz y La Isleta. Mazorcas sanas de cada tipo de cacao fueron desgranadas manualmente y sometidas a un proceso de fermentación durante 5 días. A los granos fermentados se les eliminó la pulpa, y los cotiledones fueron secados en una estufa por 48h a 40ºC, seguido de un proceso de molienda. Las globulinas fueron extraídas con solución 0,5M NaCl y analizadas electroforéticamente por PAGE-SDS unidimensional en gel de placa de poliacrilamida 20%. Los resultados revelaron variaciones significativas (p<0,05) de los contenidos de proteína en el polvo desgrasado de los granos fermentados entre los tipos de cacao (17,6-20,3%) y en las parcelas (17,5-20,3%). Igualmente, la cantidad de globulinas difirió entre las parcelas (15,3-30,4%), en tanto que los valores no se diferenciaron estadísticamente entre los tipos (16,8-24,9%). El análisis electroforético de las globulinas mostró patrones con un total de 49 bandas tenues con movilidades relativas entre 0,214 y 0,971 y pesos moleculares entre 79 y 13,8kDa, los cuales variaron entre las plantas, tipos de cacao y parcelas.

SUMMARY

The globulins of the fermented grain of the criollo, forastero and trinitario cocoa types in the Cumboto area, Aragua state, Venezuela were characterized by electrophoresis. Pods from two plants, three fruits per plant, were harvested for each type of cocoa in El Paraíso, La Vega de Santa Cruz and La Isleta parcels. Healthy pods corresponding to each type of cocoa were manually flailed and underwent a fermentation process for a period of five days. The pulp was removed from the fermented grains, and the cotiledons were dried in an oven for 48h at 40ºC. This was followed by a grinding process. The globulins were extracted using 0.5M NaCl and were analyzed by unidimensional PAGE-SDS electrophoresis in a 20% poliacrilamide plate gel. The results revealed significant variations (p<0.05) in the protein contents of the degreased powder of the fermented grains corresponding to the different cocoa types (17.6%-20.3%) and the different parcels (17.5%-20.3%). The amount of globulins also differed between parcels (15.3%-30.4%). However, the values did not show a statistical differentiation between the types (16.8%-24.9%). The electrophoretical analysis of the globulins showed patterns with a total of 49 soft bands with a relative mobility ranging from 0.214 to 0.971, and molecular weights in between 79 and 13.8kDa, which varied between plants, cocoa types, and parcels.

RESUMO

Caracterizaram-se eletroforéticamente as globulinas do grão fermentado dos cacaus tipo crioulo, forasteiro e trinitário da localidade de Cumboto, estado Aragua, Venezuela, para o qual foram colhidas vagens de duas plantas por cada tipo de cacau, na razão de três frutos por planta, nos lotes El Paraíso, La Vega de Santa Cruz e La Isleta. Vagens sãs de cada tipo de cacau foram processadas manualmente para retirada dos grãos e submetidas a um processo de fermentação durante 5 dias. A polpa dos grãos fermentados foi eliminada, e os cotilédones foram secados em uma estufa por 48h a 40°C, seguido de um processo de moenda. As globulinas foram extraídas com solução 0,5M NaCl e analisadas eletroforéticamente por PAGE-SDS unidimensional em gel de placa de poliacrilamida 20%. Os resultados revelaram variações significativas (p<0,05) dos conteúdos de proteína no pó desengordurado dos grãos fermentados entre os tipos de cacau (17,6-20,3%) e nos lotes (17,5-20,3%). Igualmente, a quantidade de globulinas diferiu entre os lotes (15,3-30,4%), em tanto que os valores não se diferenciaram estatisticamente entre os tipos (16,8-24,9%). A análise eletroforética das globulinas mostrou padrões com um total de 49 bandas tênues com mobilidades relativas entre 0,214 e 0,971 e pesos moleculares entre 79 e 13,8kDa, os quais variaram entre as plantas, tipos de cacau e lotes.

PALABRAS CLAVE / Electroforesis / Fermentación / Globulinas / Proteínas / Theobroma cacao L. /

Las globulinas del cacao son proteínas vacuolares de reserva que representan el 43% de las proteínas de la semilla. Esta fracción proteica está constituida por subunidades polipeptídicas que no presentan enlaces disulfuro, siendo por lo tanto del tipo vicilina, a diferencia de la mayoría de las semillas de otras plantas que contienen solamente globulinas de reserva tipo legumina o ambos tipos, leguminas y vicilinas (Voigt et al., 1993). En estas proteínas se han observado tres polipéptidos principales con pesos moleculares de 47-46kDa el primero, 33,5-31kDa el segundo y 14,5kDa el tercero (Voigt et al., 1993, 1994; Lerceteau et al., 1999; Buyukpamukcu et al., 2001; Amin et al., 2002; Sánchez, 2002).

Durante la fermentación ocurren cambios en las proteínas relacionados con el incremento de la temperatura y de la acidez, factores que causan la muerte del embrión y la ruptura de las paredes celulares, permitiendo que las enzimas entren en contacto con sus respectivos sustratos (Cros y Jeanjean, 1995). La acción de la endoproteínasa aspártica y la carboxipeptidasa sobre las globulinas tipo vicilinas genera oligopéptidos y amino ácidos libres, compuestos considerados como precursores del aroma específico del cacao fermentado (Biehl et al., 1982; Voigt et al., 1994; Amin et al., 1997, 1998). Entre los péptidos formados han sido identificados un nonapéptido y un hexapéptido. Este hexapéptido presenta una secuencia análoga al nonapéptido, por lo que se supone se forma, en parte, a partir del nonapéptido durante el proceso fermentativo (Buyukpamukcu et al., 2001).

La digestión proteolítica selectiva de las globulinas reduce la fracción en proporciones considerables que superan el 80% (Voigt et al., 1993; Amin et al., 1997, 1998). Esta pérdida cuantitativa de las proteínas vacuolares de reserva ocasiona una disminución de la intensidad de las bandas electroforéticas correspondientes a dichas proteínas (Biehl et al., 1982; Voigt et al., 1993; Amin et al., 1997; Buyukpamukcu et al., 2001) siendo algunas veces observada una pérdida total, de modo que las bandas no son detectadas en los granos fermentados (Pettipher, 1990; Buyukpamukcu et al., 2001).

En Venezuela, las condiciones edafoclimáticas son apropiadas para el cultivo del cacao, que ha sido tradicional en el país, donde existía un cacao criollo de alta calidad. Sin embargo, la hibridización natural que ha ocurrido como consecuencia de la introducción de materiales forasteros más resistentes y productivos, ha desmejorado la calidad del cacao (Cartay, 1997), sobre todo en la Región Centro-Norte-Costera del estado Aragua, donde predominaban los mencionados cacaos. Ahora bien, sobre el cacao híbrido existente en la actualidad, el cual aún puede ser considerado de buena calidad, se dispone de poca información en cuanto a la composición proteica, la cual reviste gran importancia en los programas de mejoramiento que se están realizando en el país. El objetivo de este estudio consistió en caracterizar electroforéticamente las globulinas de granos fermentados de tres tipos de cacao de la localidad de Cumboto.

Se estudiaron las globulinas de los cacaos tipo criollo, forastero y trinitario de las parcelas La Isleta, La Vega de Santa Cruz y El Paraíso de la localidad de Cumboto, estado Aragua, Venezuela. En cada parcela se delimitó una superficie de 1ha y los árboles de cacao fueron identificados según algunos descriptores taxonómicos sugeridos por Bekele et al. (1994).

En el ensayo se empleó un diseño factorial completamente aleatorizado que consistió de 3 tipos de cacao con 2 repeticiones en 3 parcelas. La cosecha fue realizada en 2 plantas de cada tipo de cacao, recolectándose 3 mazorcas sanas y maduras por planta, para una unidad experimental de 6 mazorcas. Como criterio de madurez se aplicó el método señalado por González et al. (1999).

Las mazorcas cosechadas fueron fermentadas por 5 días, usando cajones de dimensiones 15×15×15cm, construidos con madera saqui-saqui, Bombacopsi quinata (Jacq) Dugan, con perforaciones de 0,8cm de diámetro en el fondo para permitir la salida del exudado (Graziani et al., 2003). Los cotiledones de los granos fermentados fueron separados manualmente, secados en una estufa a 40ºC por 48h y molidos finamente.

Análisis químicos

La extracción de las proteínas fue realizada siguiendo el procedimiento descrito por Voigt et al. (1993). El contenido proteico del polvo de acetona (AcDP) fue analizado por el método microKjeldahl (AOAC, 1997) y las globulinas cuantificadas según Lowry et al. (1951) usando como estándar albúmina sérica bovina. La caracterización electroforética de las proteínas se realizó de forma unidimensional en placa de gel de poliacrialamida con dodecilsulfato de sodio (PAGE-SDS) al 20% de acrilamida, de acuerdo con el método propuesto por Laemmli (1970). La determinación del peso molecular de los polipéptidos de las globulinas se calculó por comparación de las movilidades relativas (Mr) de las bandas de los patrones electroforéticos de las muestras con las de proteínas estándares (fosforilasa b, albúmina sérica bovina, ovoalbúmina, anhidrasa carbónica, inhibidor de tripsina, lisoenzima), determinadas ambas Mr en igualdad de condiciones (Ortiz de Bertorelli y Ramírez, 2000). La movilidad relativa fue calculada por la ecuación usada por Robard et al. (1971). Para comparar los contenidos proteicos se aplicó un análisis de varianza complementado con una prueba de comparación de medias de Duncan (SAS, 1998).

Contenido proteínico

En el polvo desgrasado del cotiledón de los tres tipos de cacao fermentado, los porcentajes de proteína total difirieron entre sí (p<0,05) y la prueba de comparación de medias de Duncan (Tabla I) indicó que la menor concentración correspondió al trinitario. En cambio, entre las globulinas no se observaron diferencias significativas.

En los tres tipos de cacao, las globulinas se encontraron en cantidades mayores que los 18mg/gAcDP señalados por Voigt et al. (1993) y 10,5mg/gAcDP por Amin et al. (1998) para cacaos fermentados de otros países, diferencia posiblemente debida a los materiales analizados y al uso de una metodología distinta.

Al comparar con los resultados obtenidos (30,3% de globulinas en el cacao criollo, 25,4% en el forastero y 24,5% en el trinitario) por Sánchez (2002) para el cacao fresco de Cumboto, se observó que los valores de este estudio son inferiores, lo cual reveló una reducción de esta fracción durante la fermentación. La disminución de la concentración de las globulinas en el proceso fermentativo del cacao también ha sido observada por Voigt et al. (1993), quienes encontraron un descenso de 197 a 18mg globulinas/gAcDP. Así mismo, Amin et al. (1998) detectaron una reducción del 88,8% en dicha fracción, ocasionada por la acción enzimática de la endoproteasa aspártica, que divide las cadenas proteínicas para formar oligopéptidos hidrófobos, sobre los cuales actúa la carboxipeptidasa produciendo oligopéptidos hidrofílicos y aminoácidos hidrofóbicos, compuestos responsables de la formación de los precursores del sabor del cacao fermentado (Voigt et al., 1994; Amin et al., 1997, 1998).

La prueba de medias de Duncan también demostró diferencias significativas (p<0,05) entre los contenidos proteicos del cacao de las tres parcelas (Tabla II), presentando el de El Paraíso menor porcentaje de proteínas totales en la harina desgrasada, en tanto que en las globulinas, la proporción fue mayor en La Isleta.

La concentración total de las proteínas del cacao está relacionada con los factores ambientales y ecológicos. Sin embargo, el contenido proteico del cacao de El Paraíso fue más bajo que el de las otras dos parcelas, a pesar que desde 1999 esa parcela se ha venido manejando con un patrón tecnológico que involucra riego, poda y un cierto control de plagas y enfermedades (González, 2001), mientras que en La Isleta las prácticas agronómicas aplicadas han sido escasas, por lo que en este caso la deficiencia en proteína podría ser adjudicada a las muestras analizadas, en las cuales posiblemente haya ocurrido una hibridación natural con materiales de baja calidad, hibridización que es señalada por Motamayor (1995) y Parra et al. (2002).

PAGE-SDS de las globulinas

En todos los cacaos analizados la banda mas intensa y de mayor anchura fue la de Mr de 0,829 y PM 19,8kDa en la planta 1 (Figuras 1 y 3) y 0,809 y 21kDa en la planta 2 (Figuras 2 y 3), la cual supuestamente corresponde a las albúminas, mientras que las restantes fueron bandas tenues. La presencia de dichas albúminas, en las globulinas de todas las muestras de cacao, también ha sido observada por varios investigadores (Amin et al., 1997, 2002) y ha sido atribuida a contaminación, que incluso ha sido detectada en globulinas parcialmente purificadas (Amin et al., 2002), debido a que las proteínas de reserva son difíciles de purificar por su insolubilidad y su tendencia a formar complejos (MacDonald et al., 1994).

El número de bandas de las globulinas varió entre los tipos de cacao, entre las plantas y entre las parcelas (Figura 3). Al excluir la banda considerada como correspondiente a las albúminas (19,8-21kDa) y tomando en cuenta la similitud señalada de algunas bandas, se notó que entre los tipos de cacao el mayor número le correspondió al tipo criollo (24 bandas). En cuanto a las plantas se observó que en la planta 1, el número más alto lo mostró el tipo forastero (15 bandas) y en la planta 2 el criollo (18 bandas). En las parcelas se encontró que la mayor cantidad de bandas la presentaron los patrones del cacao tipo criollo de El Paraíso (17 bandas) y de La Isleta (23 bandas), y en La Vega de Santa Cruz los del tipo forastero (20 bandas). El número de bandas encontrado es mayor que el indicado para las proteínas de reserva del cacao fermentado de otros países (Biehl et al., 1982; Voigt et al., 1993; MacDonald et al., 1994; Amin et al., 1997, 1998; Lerceteau et al., 1999; Buyukpamukcu et al., 2001), lo cual podría deberse al método de análisis usado y/o a los tipos de cacao existentes en la zona de Cumboto. Por otra parte, las bandas con PM de 46,8; 31 y 14,5kDa coinciden con las detectadas por varios investigadores en globulinas de granos frescos de cacao genéticamente indefinido (Voigt et al., 1993, 1994), de genotipos denominados Forastero (Amelonado), Criollo (Kraton) y Trinitario (DR2) (Amin et al., 2002) y de los mismos tipos analizados en este estudio (Sánchez, 2002), así como en granos fermentados de cacao Amelonado (Buyukpamukcu et al., 2001) y del clon Forastero Amazónico IMC67 (Lerceteau et al., 1999).

En cuanto a las bandas comunes de los cacaos estudiados (Figura 3), se puede observar que la de PM 64,5-65kDa se encontró en todos los patrones electroforéticos de los tres tipos de cacao, la de 79kDa en los zimogramas de la planta 1 de las tres parcelas, mientras que en la planta 2 las bandas comunes fueron las de 46,8 y 14,5kDa. Igualmente, en todas las parcelas el cacao tipo criollo mostró 6 bandas comunes en las plantas 1 y 2; el forastero 8 en la planta 1 y 5 en la planta 2 y el trinitario 8 en la planta 1 y 7 en la planta 2.

Por otra parte, las bandas que diferenciaron los tipos de cacao fueron las de PM 77; 72; 70; 68; 63; 62,5; 54-53; 46; 45; 44; 39; 16,2; 15,5; y 13,8kDa, las cuales sólo aparecieron en las globulinas del tipo criollo, las de PM 75; 57; 48; 42; 40,5; 36; 35,5; 34,2; 31; 28; 24; y 14kDa en el forastero y las de PM 52; 50,5; 33; 26; 17; 16; y 15,8kDa únicamente en el trinitario, de forma tal que las proteínas del tipo criollo se distinguieron, principalmente, en los polipéptidos de PM más alto (77-62,5), las del forastero en los PM intermedios (42-28) y los del trinitario en los de PM más bajo (17-15,8).

Entre las parcelas, el cacao tipo criollo de El Paraíso discrepó del de las otras dos en que no mostró las bandas de 77; 72; 70; 68; 46; 36,8; y 29kDa. Así mismo, las bandas de 45; 44; 41; 37; y 13,8kDa no se detectaron en el criollo de La Vega de Santa Cruz ni la banda 15,5kDa en el de La Isleta, lo que indica que las globulinas del cacao criollo del Paraíso difirieron en los polipéptidos de PM más alto (77-68kDa), el de La Vega de Santa Cruz en los de PM intermedio (45-37kDa) y los de La Isleta en el de PM más bajo (15,5kDa). Por su parte, el cacao tipo forastero de El Paraíso no presentó las bandas de 42; 40; 36; 35,5; 34,2; y 24kDa, ni el de La Isleta las de 75; 40; y 37kDa, diferenciándose las proteínas del cacao de estas dos parcelas en las subunidades de PM intermedio. Igualmente, el cacao trinitario se distinguió entre las parcelas en los polipéptidos de PM intermedio, de manera que en el de El Paraíso no aparecieron las bandas de 41; 36,8kDa y en el de La Vega de Santa Cruz la de 52kDa.

Sánchez (2002) observó la presencia de bandas intensas con PM de 49,5; 44,5; 41; 33 y 31kDa en las globulinas de muestras frescas de cacao de Cumboto, por lo tanto la ausencia de algunas de estas bandas o su presencia como bandas tenues en las globulinas del grano fermentado, reveló degradación de los polipéptidos predominantes de estas proteínas en la fermentación, los que son preferentemente afectados en dicho proceso, debido a una digestión proteolítica selectiva (Biehl et al., 1982; Voigt et al., 1993; Amin et al., 1997, 1998). Estos resultados coinciden con los obtenidos por varios investigadores (Biehl et al., 1982; Pettipher, 1990; Voigt et al., 1993; Amin et al., 1997, 1998), quienes observaron que al fermentarse el grano de cacao las proteínas vacuolares de reserva disminuyen y las bandas electroforéticas correspondientes se observan muy tenues o desaparecen. Por otra parte, Buyukpamukcu (2001) señala que posiblemente las proteínas se degradan, durante la fermentación, a componentes con masas menores a los 14kDa, puesto que los polipéptidos de peso molecular entre 46 y 14kDa no se incrementaron.

Los autores agradecen al Vicerrectorado Académico de la UCV y a la FUNDACITE Aragua el aporte económico otorgado.

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