Caracterización de ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE) en cepas nosocomiales de K. pneumoniae. Sucre-Venezuela. 

Militza Guzmán^1,2 y Guillermina Alonso². 

¹Laboratorio de Bacteriología Molecular, Departamento de Bioanálisis, Universidad de Oriente. Cumaná, estado Sucre y ²Laboratorio de Biología de Plásmidos, Instituto de Biología Experimental, Universidad Central de Venezuela. Caracas, Venezuela.

Autor de correspondencia: Militza Guzmán. Departamento de Bioanálisis, Universidad de Oriente. 1er. Piso, Calle Bolívar. Antigua Escuela de Enfermeras. Cumaná, estado Sucre, Venezuela Teléfono: 0058-293-4320725. Fax: 0058-0293-4311175. Correo electrónico: miltzaguz@cantv.net

Resumen: En este estudio, 25 cepas de K. pneumoniae aisladas de pacientes con infección nosocomial durante el periodo agosto 2002 a diciembre de 2003 fueron examinadas para determinar su susceptibilidad antimicrobiana, perfil plasmídico, transferencia de determinantes de resistencia y los tipos de genes bla_TEM , bla_SHV , bla_CTX-M. Diecinueve cepas presentaron susceptibilidad disminuida a las cefalosporinas de tercera generación y al aztreonam y fueron productoras de ß-lactamasas de espectro extendido (BLEE). Todas las cepas presentaron plásmidos transferibles con una frecuencia de conjugación de 10^–3 a 10^–4 transconjugantes/célula donante. El análisis de los patrones de restricción reveló la presencia de tres tipos de plásmidos. Las cepas E. coli transconjugantes, además de ser productoras de BLEE, expresaron resistencia a aminoglucósidos y cloranfenicol. Se encontró la presencia del gen bla_TEM en todos los plásmidos transferibles y los genes bla_SHV y bla_CTX en plásmidos transferibles y no transferibles. Las enzimas identificadas fueron TEM-1, SHV-5-2a y CTX-M-2. Los plásmidos presentes en las cepas de K. pneumoniae, juegan un papel importante en la diseminación de los genes que codifican resistencia a los ß-lactámicos y otros antimicrobianos.

Palabras clave: Plásmidos, ß-lactamasas de espectro extendido, resistencia.

Characterization of extended-spectrum ß-lactamases in nosocomial strains of Klebsiella pneumoniae.

Abstract. In this study, 25 strains of K. pneumoniae, isolated from patients with nosocomial infections from August 2002 to December 2003, were examined to determine their antimicrobial susceptibility, plasmid profile, transfer capacity of resistance determinants and bla_TEM, bla_SHV, and bla_CTX-M genes. Nineteen nosocomial strains revealed a weakened susceptibility to third-generation cephalosporins and aztreonam, and were extended-spectrum ß-lactamases (ESBLs) producers. All strains presented conjugable plasmids with a conjugation frequency of 10^–3 to 10^–4 transconjugants/donor cell. The analysis of restriction patterns revealed the presence of three differents plasmids. The Escherichia coli transconjugants were ESBLs producers and expressed resistance for aminoglucosides and chloramphenicol. The bla_TEM gen was found in all transferables plasmids and the bla_SHV and bla_CTX genes were found in transferables and no transferables plasmids. The enzymes identified in the isolates were TEM-1 SHV-5-2a and CTX-M-2. The plasmids present in the K. pneumoniae strains play an important role in the dissemination of the genes encoding resistance to ß-lactams and other antimicrobial agents.

Key words: Plasmids, extended-spectrum ß-lactamases, antibiotic resistance. 

INTRODUCCIÓN 

Las b-lactamasas de espectro extendido (BLEE) son consideradas uno de los principales mecanismo de resistencia contra los b-lactámicos, especialmente en aislados clínicos de Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli (1, 2). Estas enzimas fenotipicamente se caracterizan por ser inhibidas por el ácido clavulánico u otro inhibidor de b-lactamasas y por conferir resistencia a las penicilinas, cefalosporinas de tercera, a los monobactámicos y en menor grado a algunas cefalosporinas de cuarta generación (3, 4). 

K. pneumoniae posee genes cromosomales que codifican para b-lactamasas de tipo penicilinasa (LEN-1) y espectro ampliado (TLE-2 y SHV-1), que la hace naturalmente resistente a las amino y carboxipenicilinas. Para el género Klebsiella las enzimas de la clase 2be originadas por mutaciones en la secuencia de los genes codificadores de las b-lactamasas clásicas TEM-1, SHV-1 y TEM-2 juegan un papel importante en la resistencia adquirida a los b-lactámicos (5). Actualmente existen diversos tipos de BLEE tipo TEM y SHV. Otras BLEE (CTX-M, PER, OXA, entre otras) no derivadas de TEM y SHV, se han identificado en aislados clínicos de K. pneumoniae, siendo las de la serie CTX-M las más caracterizadas en la resistencia adquirida a las cefalosporinas de tercera generación y cefepima (6). 

La resistencia a los antimicrobianos se convierte cada día en una amenaza mayor y grave para la salud pública, que se complica cuando un microorganismo presenta más de un mecanismo de resistencia y cuando tiene la capacidad de transmitirlo a su descendencia y a otras bacterias de su misma o diferente especie. La emergencia de bacilos Gram negativos portadores de genes que codifican BLEE, enzimas modificadoras de aminoglucósidos y otros mecanismos de resistencia, han complicado el tratamiento de las infecciones a nivel hospitalario, convirtiéndose en factores que ayudan a elevar las tasas de morbilidad y mortalidad, así como los costos hospitalarios (7). Inicialmente la detección de BLEE estaba limitada a cepas aisladas de pacientes hospitalarios, sin embargo, la situación se ha complicado, debido a que el mecanismo se está detectando en bacterias causantes de infecciones a nivel comunitario, lo que trae como consecuencia una complicación terapéutica desde el punto de vista clínico y agrava el problema desde el punto de vista de salud pública. 

El propósito de esta investigación fue determinar la presencia fenotípica y molecular de BLEE en cepas aisladas de pacientes con infecciones nosocomiales en diferentes áreas del servicio autónomo Antonio Patricio de Alcalá, Cumaná estado Sucre. 

MATERIAL Y MÉTODOS 

Cepas bacterianas 

Durante el período 07/08/2002 al 16/12/2003 se recolectaron 25 cepas de K. pneumoniae provenientes de pacientes con diagnóstico clínico de infección nosocomial atendidos en las diferentes áreas de hospitalización del Servicio Autónomo Antonio Patricio de Alcalá, en Cumaná, estado Sucre, Venezuela. En la selección de las cepas se mantuvo el criterio de seleccionar una cepa por paciente y que cumplieran con los criterios para considerarlas como una infección nosocomial (8). El trabajo se realizó respetando las normas de bioética para trabajos de investigación en seres humanos (9). Las muestras tomadas de los diferentes cuadros clínicos fueron procesadas mediante los protocolos de identificación para bacterias Gram negativas fermentadoras y no fermentadoras de glucosa (10). 

Susceptibilidad antimicrobiana. Las pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos se realizaron mediante el método de difusión en disco siguiendo los lineamientos del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (11). Los antimicrobianos ensayados fueron: piperacilina tazobactam (100/10 µg), cefotaxima (30 µg), ceftazidima (30 µg), ceftriaxona (30 µg), aztreonam (30 µg), imipenem (10 µg), amikacina (30 µg), kanamicina (30 µg), tobramicina (30 µg), cefoxitin (30 µg), cefepima (30 µg), gentamicina (10 µg), tetraciclina (30 µg), cloranfenicol (30 µg), ciprofloxacina (5 µg) y amoxacilina/ácido clavulánico (2:1) (30 µg). Todos marca Oxoid Ltd, Reino Unido. 

La detección fenotípica de las BLEE se realizó mediante la técnica de sinergismo del doble disco (12). 

Las cepas E. coli ATCC 25922 and K. pneumoniae ATCC 700603 fueron usadas como controles en los ensayos de susceptibilidad antimicrobiana. 

Transferencia de la resistencia 

Los experimentos de conjugación se realizaron en medio sólido bajo las condiciones establecidas por Narváez et al. (13). Como cepa receptora se empleó E. coli J62-2 (F-, his, pro, trp, lac, rif) CVCM131 (http://cvcm.ciens.ucv.ve). Las transconjugantes fueron seleccionadas en agar MacConkey suplementado con rifampicina (100 µg/mL) más ceftazidima (50 µg/mL) para las cepas resistentes a ceftazidima; y rifampicina (100 µg/mL) más ampicilina (120 µg/mL) para las cepas sensibles a ceftazidima. 

Análisis del ADN plasmídico 

Para aislar los plásmidos de las cepas donantes y transconjugantes se empleó la técnica modificada de lisis alcalina (14). Los aislamientos plasmídicos fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa/TBE, y coloreados con bromuro de etidio. Como marcador de peso molecular se empleó 1 kb ADN Ladder (Promega). El patrón de restricción de los plásmidos se realizó con la enzima EcoRI (Promega). El producto de restricción se sometió a electroforesis en gel de agarosa-TBE. Los geles se visualizaron en un equipo Gel Doc (Bio-Rad). 

Extracción de ADN 

La extracción de ADN total se realizó de acuerdo a la metodología descrita por Levesqué y col. (15). En un tubo Eppendorf se mezclaron 200 µL de un cultivo de la cepa crecido durante 18 horas con 800 µL de agua estéril, la mezcla se hirvió durante 10 minutos y se centrifugó a 12 000 g durante 3 minutos, este procedimiento se realizó para las cepas donantes. El sobrenadante con el contenido de ADN total se guardó a –20°C hasta su uso. 

Detección por PCR de los genes bla_SHV bla_TEM y bla_CTX-M 

Secuenciación de los genes bla 

La secuenciación de los genes bla se realizó en el Centro de Secuenciación y Análisis de Ácidos Nucleicos (CeSAAN), ubicado en el Centro de Microbiología del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), empleando un secuenciador Perkin-Elmer modelo ABI PRISM^TM 377, previa purificación de los productos de PCR (Promega, kit de Rapid PCR Purification System). La búsqueda de similitudes en la base de datos GenBank, se hizo vía internet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) empleando los servicios BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (19). 

RESULTADOS 

Los ensayos de susceptibilidad antimicrobiana permitieron determinar que el 76,0% (19/25) de las cepas de K. pneumoniae presentaron resistencia a las cefalosporinas de tercera generación y al monobactámico aztreonam, las concentraciones mínimas inhibitorias detectadas fueron de 32 a >256 µg/mL para ceftazidima y aztreonam y de 4 a >256 µg/mL para cefotaxima y ceftriaxona (Tabla I). Todos los aislados resistentes a las cefalosporinas de tercera generación y al aztreonam resultaron ser fenotípicamente productores de BLEE. Además de la resistencia presentada a las cefalosporinas de tercera generación y al aztreonam, las cepas presentaron resistencia a otros antimicrobianos de interés clínico, no obstante permanecieron sensibles al cefoxitin e imipenem.

La transferencia de determinantes de resistencia a los b-lactámicos, se produjo con una frecuencia de conjugación de 10^–3 transconjugantes/célula donante en las cepas resistentes a ceftazidima. Las cepas transconjugantes presentaron un perfil de resistencia compatible con el de la cepa donante e incluso fueron productoras de BLEE (Tabla II). Adicionalmente, en todas las cepas transconjugantes se observó cotransferencia de determinantes de resistencia para otros antimicrobioanos como aminoglucósidos y cloranfenicol. En las cepas sensibles a las cefalosporinas de tercera generación y al aztreonam, se obtuvieron transconjugantes con una frecuencia de 10^–3 a 10^–4 transconjugantes/célula donante. También se observó cotransferencia de determinantes para aminoglucósidos y cloranfenicol.

El análisis plasmídico en las cepas donantes reveló que el 80,0% de las cepas donantes presentan una molécula y que en todos los casos, siempre se trasfirió una molécula de elevado peso molecular. La Fig. 1 muestra los patrones de restricción obtenidos con la enzima de retricción EcoR1, se detectaron tres tipos de plásmidos de acuerdo a las similitudes de las bandas observadas. Los patrones se denominaron con las letras A, B y C. Seis cepas presentaron el patrón B, 17 el A y 2 el C. Las cepas con el patrón B no mostraron resistencia a las cefalosporinas de tercera generación ni al aztreonam.

La detección de los genes bla se realizó en los aislamientos plasmídicos de las cepas donantes y de las transconjugantes. Los genes bla_SHV se encontraron en los aislamientos plasmídicos de las cepas transconjugantes que presentaban el patrón de restricción A. Dos casos fueron detectados en plásmidos no transferibles presentes en las cepas Kp13 y Kp15 (Tabla II). El gen bla_TEM se encontró en todos los plásmidos trasnferibles. El gen bla_CTX-M se encontró en dos plásmidos transferibles y dos plásmidos no transferibles. En dos cepas (Kp13 y Kp15) se encontraron la presencia de los tres genes bla. No se encontró la presencia de los genes bla en ADN cromosomal, siempre la presencia de los genes estuvo asociada a moléculas plasmídicas, excepto en el caso del gen bla_SHV que naturalmente está codificado en el cromosoma bacteriano de K. pneumoniae. 

DISCUSIÓN 

La emergencia de cepas de enterobacterias resistentes a las cefalosporinas de tercera generación y al aztreonam, se ha convertido en un problema de salud pública a nivel mundial (20). En este estudio la búsqueda de BLEE reveló que 76,0% de las cepas de K. pneumoniae son productoras de esta enzima. Desde el punto de vista clínico, la detección de una BLEE es importante para el éxito del tratamiento, ya que a los pacientes infectados con cepas productoras de BLEE, no se les debe administrar cefalosporinas de tercera generación ni aztreonam porque conduce a un fracaso terapéutico (21). 

En los aislados de K. pneumoniae se pudo comprobar que la presencia de determinantes que median la resistencia a b-lactámicos por producción de BLEE y a otros antimicrobianos como aminoglucósidos y cloranfenicol están codificados en plásmidos transferibles, este resultado es de interés, ya que los plásmidos son elementos diseminadores de determinantes de resistencia entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae (22). Los resultados obtenidos en este trabajo coinciden con los reportados por diversos autores quienes han demostrado que las BLEE están codificadas en plásmidos transferibles, de elevado peso molecular que portan simultáneamente otros determinantes de resistencia (23-27). Este hallazgo debe ser considerado como un factor de riesgo en el centro hospitalario, ya que la alta frecuencia de conjugación y la presión selectiva facilitan la diseminación de determinantes de resistencia, e incluso pueden provocar brotes nosocomiales en otras áreas. La elevada transmisibilidad de plásmidos que portan genes que codifican enzimas capaces de hidrolizar ciertos antimicrobianos puede permitir la diseminación de la resistencia a otros patógenos, y así se ha demostrado debido a que se han encontrado enzimas de espectro extendido en cepas nosocomiales de E. coli, Klebsiella spp., P. aeruginosa¸ Citrobacter freundii y Enterobacter aerogenes. 

El perfil de restricción plasmídico encontrado en el estudio, reveló que en el centro hospitalario existen dos tipos de plásmidos circulantes, los cuales difieren en tres bandas específicamente y que debe el punto de vista fenotípico las cepas que tienen el patrón B no son productoras de BLEE, esto hace suponer que el patrón A se originó a partir del patrón B con la ganancia de algunos genes o elementos genéticos. 

Entre las b-lactamasas de localización plasmídicas que se identifican con mayor frecuencia en K. pneumoniae, se encuentran las enzimas TEM-1 y SHV-1 (BLEA), así como algunas BLEE, originadas por mutaciones en las BLEA (28). El análisis de la secuencia de los genes bla_SHV caracterizados en este trabajo reveló la presencia de la enzima b-lactamasas tipo ceftazidimasa SHV-5-2a, la cual pudiera contribuir junto con otros mecanismos no determinados en este estudio en la resistencia a este grupo de antimicrobianos. 

La enzima SHV-5-2a es una enzima que se caracteriza por presentar una mutación en los aminoácidos Gln35, Ser238 y Lys240, siendo necesarias las mutaciones en los aminoácidos 238 y 240 (las cuales permiten la rápida hidrólisis de ceftazidima) para que la enzima sea considerada una BLEE (29). Los resultados de este trabajo coinciden con los estudios realizados en Mérida-Venezuela por Araque y col. (24, 30) y en Caracas por Torres y col (31) quienes reportan la presencia de la enzima SHV-5 en cepas nosocomiales de K. pneumoniae, difiriendo sólo en que en las cepas productoras de BLEE aisladas en el oriente del país se encuentra la mutación L35Q. 

El gen bla_TEM analizado en este estudio presentó homología con el gen bla_TEM-1, el cual se ha caracterizado por conferir resistencia a las aminopenicilinas. 

La presencia del gen bla_CTX se encontró en cuatro cepas de K. pneumoniae, las cuales fenotipicamente presentaron altos niveles de resistencia a cefotaxima. La enzima CTX-M caracterizada fue del tipo CTX-M-2, la cual se encontró en 2 plásmidos transferibles y en 2 plásmidos no transferibles. Nuestros resultados coinciden con los reportados por diversos autores (6, 18, 31). 

De acuerdo al perfil de restricción de las transconjugantes y la caracterización molecular de las diferentes BLEE, se pudo observar que los tres tipos de plásmidos presentaban el mismo tipo de enzima, sin embargo, no significa que las cepas con un plásmido especifico estén relacionadas clonalmente. La transferencia horizontal de plásmidos que llevan genes codificadores de BLEE ha sido reportada en cepas no relacionadas (32) La presencia del gen bla_SHV y bla_CTX-M en plásmidos transferibles y no transferibles en las cepas de K. pneumonaie, sugiere fuertemente el papel activo de elementos genéticos móviles como integrones o transposones en la diseminación de genes codificadores de resistencia entre las cepas de K. pneumoniae, y probablemente a otras enterobacterias. 

Los resultados de esta investigación señalan que la presencia de plásmidos transferibles, que portan genes de resistencia a los antimicrobianos b-lactámicos, así como a otros agentes terapéuticos en las cepas de K. pneumoniae, constituye un factor de riesgo en la diseminación de determinantes de resistencia a otras bacterias en el Servicio Autónomo Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá”. 

Los resultados revelan la gran necesidad de impedir la diseminación mediante la detección precoz de la resistencia y aislamientos en pacientes infectados o colonizados y lo más importante, la prevención de aparición de resistencia con el uso racional de antimicrobianos. 

AGRADECIMIENTOS 

Se agradece la desinteresada colaboración de los pacientes y del personal que labora en el Laboratorio de Bacteriología del Servicio Autónomo Hospital Universitario “Antonio Patricio de Alcalá” y Ambulatorio “Dr. Arquímedes Fuentes Serrano” por apoyarnos en la realización del trabajo. El trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación de la Universidad de Oriente. Núcleo Sucre (PCI: 20401021253105) y el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad Central de Venezuela (PI-03.335417 y PG-03335416). 

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