Diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori por PCR en jugo gástrico y biopsias gastroesofágicas de pacientes dispépticos.
Ligia Abrante 1, Nelson Reyes 1, M. Alexandra García-Amado 1, Paula Suárez 2, Roberto Romero 3, Fabián Michelangeli 1 y Mónica Contreras 1.
1 Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal, Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC).
2 Laboratorio de Organismos Acuáticos, Departamento de Biología de Organismos, Universidad Simón Bolívar (USB).
3 Servicio Oncológico Hospitalario del Instituto Venezolano de los Seguros Sociales (IVSS). El Cementerio, Caracas. Venezuela.
Autor de correspondencia: Mónica Contreras V. Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal, Centro de Biofísica y Bioquímica, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC). Caracas 1020A, Venezuela. Correo electrónico: mocontre@ivic.gob.ve. Teléfono: 58-212-5041855. Fax: 58-212-5041093.
Resumen.
Helicobacter pylori es el principal agente bacteriano implicado en lesiones gastroduodenales inflamatorias en humanos y una de las bacterias patógenas más comunes, con una alta prevalencia en Venezuela. El diagnóstico de la infección por H. pylori se realiza frecuentemente en biopsias gástricas mediante PCR; sin embargo, el jugo gástrico y las biopsias esofágicas podrían también ser utilizadas como muestras alternativas para determinar la infección. En el presente trabajo se evalúo la infección por H. pylori en diferentes muestras del tracto digestivo superior de pacientes dispépticos, mediante la detección por PCR de genes esenciales (glmM y ureA) y de virulencia (cagA). De los 104 pacientes estudiados, H. pylori fue encontrado en 53,8; 69,2 y 58,7% de las muestras de jugo gástrico y biopsias gástricas y esofágicas, respectivamente, con una predominancia de cepas tipo I (cagA+) en jugo y biopsias gástricas y cepas tipo II (cagA-) en biopsias esofágicas. La detección de H. pylori en jugo gástrico y biopsias esofágicas mostró una alta sensibilidad y especificidad en relación a la detección en biopsias gástricas, lo cual sugiere que ambos tipos de muestras pueden ser utilizados eficazmente para un diagnóstico seguro de la infección por H. pylori.
Palabras clave: jugo gástrico, biopsias gastroesofágicas, PCR, H. pylori
]]> Diagnosis of Helicobacter pylori infection by PCR in gastric juice and gastroesophageal biopsies from dyspeptic patientsAbstract.
Helicobacter pylori is the main bacterial agent implicated in human gastroduodenal inflammatory pathologies; being one of the most common bacterial pathogens, with a high prevalence in Venezuela. The diagnosis of H. pylori infection is performed primarily in gastric biopsies through PCR; however, string-absorbed gastric juice and esophageal biopsies could be also used as alternative specimens to determine the infection. In this study the H. pylori infection was assessed in different specimens of the upper tract digestive of dyspeptic patients, though the detection by PCR of essential genes (glmM and ureA) and genes encoding virulence factors (cagA). Of 104 patients studied, H. pylori was found in 53.8, 69,2 and 58,7% of gastric juice, and gastric and esophageal biopsies, respectively; with predominance of the strains type I (cagA+) in juice and gastric biopsies, and strains type II (cagA-) in esophageal biopsies. The detection of H. pylori in gastric juice and esophageal biopsies showed high sensitivity and specificity, in comparison with the detection in gastric biopsies, suggesting that both types of specimens may be used efficiently for a secure diagnosis of H. pylori infection.
Keywords: gastric juice, gastroesophageal biopsies, PCR, H. pylori.
Recibido: 09-12-2011. Aceptado: 07-06-2012
INTRODUCCIÓN
Helicobacter pylori es una bacteria genéticamente diversa, implicada en numerosas enfermedades gastroduodenales tales como gastritis crónica, úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico y linfoma de tipo MALT (tejido linfoide asociado a la mucosa, por sus siglas en inglés) (1). Su capacidad para sobrevivir y adaptarse a las condiciones fisiológicas excepcionales de la mucosa gástrica, le permite colonizar y persistir en el estómago durante años (2). A nivel mundial se ha reportado una alta prevalencia de infección por H. pylori, con un alto porcentaje de casos asintomáticos, por lo que es considerada una de las más comunes en humanos con alta morbilidad y baja mortalidad (3). En países desarrollados, se encuentra infectada menos del 30% de la población; mientras que en países en vías de desarrollo, la prevalencia oscila entre el 50 y 90% (4, 5). En Venezuela, estudios recientes han revelado una alta prevalencia de la infección tanto en niños y adolescentes (65%) como en adultos sintomáticos y asintomáticos (46-95%) (6-8). Sin embargo, son pocos los estudios reportados en pacientes asintomáticos a nivel epidemiológico.
En vista de la clara asociación entre esta bacteria y un número importante de enfermedades gastroduodenales, se han desarrollado diversos métodos diagnóstico, de los cuales las técnicas moleculares son las más aplicadas en laboratorios de investigación y clínica, principalmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), debido a su alta sensibilidad y especificidad (9). A diferencia de otras técnicas como la histología y/o la serología, la PCR permite la rápida detección de genes específicos que contribuyen al diagnóstico y tratamiento adecuado de la infección (10).
A pesar de que H. pylori se desarrolla principalmente en la mucosa gástrica, recientemente se ha encontrado en otros sitios del tracto digestivo superior tales como jugo gástrico y mucosa esofágica; la colonización en esta última es inducida principalmente por el reflujo del jugo gástrico como consecuencia de una hipersecreción ácida del estómago (11). De manera que su presencia ha sido también implicada en patologías severas del esófago, aunque esto no ha sido claramente demostrado (12). No obstante, en Venezuela no hay antecedentes de estudios dirigidos a la validación del uso de biopsias esofágicas para el diagnóstico de la infección por H. pylori.
La detección de H. pylori en el jugo gástrico se ha determinado mediante el uso de la prueba del hilo (o cápsula Entero-test pediátrica), empleada inicialmente para el diagnóstico de parásitos gastroduodenales tales como Giardia lamblia y bacterias como Salmonella enterica serovar Typhi y Mycobacterium tuberculosis (13). Es un método fácil, seguro y poco invasivo para la población general, tanto a nivel clínico como epidemiológico, es altamente sensible y específico con particular valor en niños menores de 3 anos para determinar el comienzo de la infección (10,13).
]]> El diagnóstico por PCR para detectar directamente H. pylori en muestras clínicas provee una sensibilidad tan alta como el cultivo para la detección de la infección (13). Este método puede ser realizado mediante la amplificación de genes esenciales y de virulencia. Los genes esenciales están presentes en todas las cepas y definen el estatus de la infección como glmM que codifica para la enzima fosfoglucosamina mutasa (14) y ureA de la ureasa A (15). Los genes de virulencia definen el grado de patogenicidad de la bacteria de acuerdo al tipo de cepa presente, el gen A asociado a la citotoxina (cagA) es el más estudiado como factor de virulencia de H. pylori (16, 17). De acuerdo al grado de patogenicidad se han definido 2 tipos de cepas, tipo I cagA (+) y tipo II cagA (–) (17). Así mismo, el gen ARN ribosomal 16S ha sido ampliamente usado en estudios taxonómicos y filogenéticos para la detección e identificación de especies del género Helicobacter (18).En el presente estudio se determinó la prevalencia de la infección por H. pylori en muestras de jugo gástrico y biopsias gastroesofágicas de pacientes dispépticos, mediante la amplificación por PCR de genes esenciales y de virulencia (glmM, ureA y cagA) propios de la bacteria a fin de diagnosticar la infección en muestras de distintas procedencias en el tracto gastroduodenal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Pacientes
Participaron en el estudio 104 pacientes voluntarios dispépticos (con síntomas en el tracto digestivo superior como ardor o acidez, presión abdominal, gases estomacales o flatulencia, náuseas o vómitos y reflujo) (19), con edades comprendidas entre 17 y 70 años, que acudieron por primera vez a consulta médica en el Servicio Oncológico Hospitalario-IVSS de Caracas (antiguo Hospital Padre Machado) entre Octubre del año 2008 hasta Marzo del 2010. En cumplimiento con los requerimientos éticos, todos los pacientes incluidos fueron informados sobre el estudio y firmaron un consentimiento escrito. El criterio de inclusión utilizado fue no haber recibido antibióticos, sales de bismuto o inhibidores de la bomba de protones por al menos un mes previo a la toma de las muestras. El protocolo del estudio fue revisado y aprobado por el Comité de Bioética del Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) y del Servicio Oncológico Hospitalario-IVSS.
Tipos de muestras
Antes de realizar la endoscopia, el paciente en ayunas ingirió una cápsula Entero-test pediátrica o prueba del hilo (HDL Corp., USA), que consistió en un hilo de nylon absorbente (90 cm) enrollado dentro de una cápsula de gelatina para facilitar su deglución, de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Una vez ingerida la cápsula, el extremo superior del hilo se fijó a un lado de la boca del paciente y 1 hora después se retiró. Posteriormente, el médico tratante, tomó biopsias gastroesofágicas, durante la endoscopia. De cada paciente se tomaron dos biopsias, una en la región antral del estómago y otra en la mucosa esofágica (tercio inferior y/o 2 cm de la línea Z). Las muestras de hilo con el jugo gástrico absorbido y las biopsias gastroesofágicas fueron transportadas al Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal y conservadas a –80°C hasta su procesamiento.
Extracción del ADN
El hilo con el jugo gástrico absorbido se colocó en un tubo de centrífuga de 15 mL que contenía 10 mL de solución salina (0,9%), se agitó vigorosamente con vórtex y se retiró el hilo. La suspensión se centrifugó a 12000g durante 20 minutos, de acuerdo con el protocolo estandarizado en el Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal (10). El ADN genómico del precipitado del jugo gástrico y de las biopsias gastroesofágicas fue extraído utilizando el estuche Mini DNA Qiamp QIAGEN de acuerdo al protocolo del fabricante (QIAGEN, Valencia, CA, USA).
Análisis de PCR específico para el género Helicobacter y especie H. pylori
]]> Se realizaron cuatro reacciones de PCR por cada muestra de jugo gástrico y biopsias (gástrica y esofágica) de cada paciente. La primera reacción de PCR se realizó para determinar el género Helicobacter, utilizando cebadores que amplifican una región específica del gen ARNr 16S de 399 pb (20) y tres reacciones posteriores para detectar la especie, H. pylori, con cebadores que amplifican dos genes específicos, glmM de 294 pb (21) y ureA de 491 pb (22), y un gen de virulencia, cagA de 128 pb (23). Las reacciones de PCR (PCRs) fueron realizadas mediante el estuche “PCR Master Mix” (Promega Corporation, Madison, USA), en un termociclador modelo GeneAMP PCR System 9700 (Applied Biosystems, Hayward, CA) y con las mismas condiciones de ciclos de amplificación para cada par de cebadores, descritas previamente por los autores. Cada reacción contenía todos los componentes de PCR, más 1 a 6 µL de ADN, 3 µL de la mezcla de cada par de cebadores (concentración final 5 µM) y agua estéril para completar un volumen final de 25 µL. El control negativo de la reacción se realizó sin ADN, mientras que el control positivo correspondió a 1 µL de ADN de una cepa de referencia de H. pylori (Hp26695). Posteriormente, 15 µL de cada reacción de PCR (o amplicon) se visualizó por corrida electroforética con el tampón de carga y bromuro de etidio en un gel de agarosa TBE al 2% permitiendo la detección del producto amplificado.Análisis estadístico
Las comparaciones de detección entre tipos de muestras para cada gen y prevalencias en la población estudiada fueron realizadas usando pruebas Chi-cuadrado, con el programa estadístico R2.9.2. Para evaluar el grado de concordancia entre los resultados de detección de los genes de H. pylori, se utilizó el Índice de Kappa. La sensibilidad y especificidad de las muestras usadas fue determinada mediante pruebas diagnósticas simples con un 95% de confianza. Ambas pruebas se realizaron con el programa estadístico Epidat3.1 y tomando como regla dorada la detección en biopsias gástricas.
El gen ARNr 16S, perteneciente al género Helicobacter spp., se detectó en 56 (53,8%) de las muestras de jugo gástrico de los 104 pacientes estudiados, 71 (68,3%) de biopsia gástrica y 59 (56,7%) de biopsia esofágica (Tabla I). Los genes glmM y ureA, específicos de H. pylori, se encontraron en proporciones similares a la detección del ARNr 16S, como se indica en la Tabla I. Mientras que el gen cagA se detectó en 32 (30,8%), 38 (36,5%) y 22 (21,2%) de las muestras de jugo gástrico, biopsia gástrica y biopsia esofágica, respectivamente. Este último fue el más variable por ser un gen que puede o no estar presente en el ADN genómico de H. pylori. Al comparar la detección de cada uno de los genes entre tipos de muestras, no se observaron diferencias significativas.
TABLA I. DETECCIÓN DE GENES ESENCIALES Y DE VIRULENCIA DE H. pylori EN MUESTRAS DE JUGO GÁSTRICO, BIOPSIA GÁSTRICA Y BIOPSIA ESOFÁGICA DE PACIENTES SINTOMÁTICOS
| Genotipo | Tipo de Muestra | p | |||||
| ]]>
Jugo Gástrico (n=104) | Biopsia Gástrica (n=104) | Biopsia Esofágica (n=104) | |||||
| N° | % | N° | % | ]]> N° | % | ||
| ARNr 16S | 56 | 53,8 | 71 | 68,3 | 59 | 56,7 | N.S. 1 |
| ]]> glmM | 54 | 51,9 | 67 | 64,4 | 53 | 51,0 | N.S. |
| ureA | 54 | ]]> 51,9 | 69 | 66,3 | 53 | 51,0 | N.S. |
| cagA | 32 | 30,8 | 38 | ]]> 36,5 | 22 | 21,2 | N.S. |
Método estadístico usado: Pruebas diagnósticas simples. IC: 95%. 1N.S.= Diferencia no significativa.
Dos de los genes de H. pylori utilizados ampliamente para definir el estatus de la infección son el glmM y el ureA. En los 104 pacientes estudiados se encontró que estos dos genes estaban presentes en la mayor parte de las muestras Helicobacter spp. positivas (Tabla I), con una concordancia muy buena en la detección de ambos genes tanto en jugo como en biopsia gástrica (Kappa=0,92 y 0,87; respectivamente) y buena en biopsia esofágica (Kappa= 0,77).
En los tres tipos de muestras estudiadas hubo una alta detección de H. pylori con una prevalencia promedio del 59,6%. Al estudiar la detección de cepas en la población, se encontró una predominancia de cepas tipo I en las muestras de jugo y biopsia gástrica (57,1 y 53,5%, respectivamente) y de cepas tipo II en biopsia esofágica (62,7%). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en la detección de los tipos de cepas entre muestras (Tabla II).
TABLA II. DETECCIÓN DE CEPAS DE H. pylori SEGÚN EL TIPO DE MUESTRA
| Tipo de Cepa | ]]> Tipo de Muestra | p | |||||
| Jugo Gástrico (n=104) | Biopsia Gástrica (n=104) | Biopsia Esofágica (n=104) | |||||
| N° | % | ]]> N° | % | N° | % | ||
| Tipo I (cagA+) | 32 | 57,1 | 38 | 53,5 | 22 | ]]> 37,3 | N.S.1 |
| Tipo II (cagA–) | 24 | 42,9 | 33 | 46,5 | 37 | 62,7 | N.S. |
| ]]> Negativos | 48 | 46,2 | 33 | 31,7 | 45 | 43,3 | N.S. |
Método estadístico usado: Pruebas diagnósticas simples. IC: 95%. 1N.S.= Diferencia no significativa.
Los resultados obtenidos de las PCRs en biopsias gástricas se tomaron como criterio absoluto o “regla dorada” para la evaluación de la infección por H. pylori en las muestras de jugo y biopsia esofágica. La sensibilidad de las PCRs en estos tipos de muestras fue de 79 y 83%, respectivamente, mientras que la especificidad fue del 100% en ambas (Tabla III).
|
| Biopsia Gástrica (n=104) | Sensibilidad (%) | Especificidad (%) | |||
| + | ]]> – | Total | ||||
| Jugo Gástrico (n=104) | + | 56 | 0 | 56 | 79 | 100 |
| - | ]]> 15 | 33 | 48 |
| ||
| Total | 71 | 33 | 104 |
| ||
| Biopsia Esofágica (n=104) | ]]> + | 59 | 0 | 59 | 83 | 100 |
| - | 12 | 33 | 45 | ]]> | ||
| Total | 71 | 33 | 104 |
| ||
Método estadístico usado: Pruebas diagnósticas simples. IC: 95%.
DISCUSIÓN
En los tres tipos de muestras estudiadas hubo una alta detección de H. pylori, lo que demuestra un diagnóstico seguro de la infección en el tracto digestivo superior. El hilo gástrico permite la recolección de bacterias presentes en el jugo gástrico para la obtención de ADN o de cepas bacterianas, con una mínima incomodidad para el paciente, durante en el proceso y una alternativa viable para el diagnóstico de la infección por H. pylori (10, 13). La toma de muestras de jugo gástrico para detectar H. pylori es poco empleada en Venezuela, a pesar de que es una técnica fácil de realizar. Se basa en la adhesión de las bacterias circulantes en el jugo gástrico a un hilo de nylon, que llega hasta la primera porción del duodeno (10). Los inconvenientes asociados a este método se presentan por contaminación u obtención insuficiente de muestra debido a una baja concentración bacteriana y poco jugo gástrico presente, así mismo, al realizar este tipo de muestreo no se puede establecer el nicho exacto de la bacteria, por lo que es probable que la detección provenga del estómago, esófago, u otro lugar a lo largo del tracto gastroduodenal (8).
Las biopsias gástricas, por su parte, son ampliamente usadas para la detección de H. pylori o cepas bacterianas (13), aun cuando son obtenidas por un método invasivo y representan una molestia para el paciente. Este es el primer estudio, del conocimiento de los autores, en el que se utilizan biopsias esofágicas para la detección de H. pylori en pacientes sintomáticos venezolanos. Su uso a nivel mundial con fines diagnóstico está dirigido principalmente al papel que juega la bacteria en patologías del esófago, como esofagitis por reflujo o enfermedad por reflujo gastroesofágico, esófago de Barrett y carcinoma esofágico (25, 26), hecho que aun sigue siendo controversial y que no ha sido claramente establecido. Sin embargo, hasta el presente no se conocen estudios previos sobre la validación de esta técnica como prueba diagnóstica de la infección en las muestras clínicas. Estudios recientes en el laboratorio han mostrado una alta prevalencia de H. pylori en la mucosa gastroesofágica (86%) de pacientes dispépticos, lo cual sugiere que la existencia de esta bacteria en el esófago es probablemente una consecuencia de la infección gástrica, mas no es la especie residente dominante (24).
En el presente estudio, se utilizó una región interna conservada del gen ARNr 16S como marcador para la detección del género Helicobacter spp. La alta detección encontrada en la mucosa gástrica, indica una mayor prevalencia de H. pylori en el estómago aunque esta diferencia no fue significativa. Los genes glmM y ureA fueron encontrados en el 100% de las muestras Helicobacter spp. positivas, lo cual sugiere la ausencia de especies de Helicobacter no-pylori en las muestras estudiadas.
En Venezuela, la prevalencia reportada de la infección gástrica por H. pylori es alta, en un rango de 45 a 95% en la población sintomática (9-10, 27-29), lo cual coincide con lo encontrado en este estudio. Asimismo, la prevalencia de la infección en jugo gástrico por PCR fue similar a la reportada en un estudio previo en Venezuela (48,9%) (10) y menor a la encontrada en Perú (64,8%), otro país latinoamericano en vías de desarrollo (13).
El gen cagA, que codifica para una proteína altamente inmunodominante, denominada CagA, es un gen variable cuya presencia está asociada con un mayor grado de patogenicidad de la bacteria (30-33). En este estudio se encontró que la prevalencia de cepas tipo I (cagA+) en jugo y biopsia gástrica es similar y en biopsia esofágica es menor, mientras que la prevalencia de las cepas tipo II (cagA-) es mayor en biopsia esofágica en relación con el jugo y biopsia gástrica. Esta predominancia de cepas por tipo de muestra sugiere que existe una multi-infección de H. pylori en el tracto digestivo superior. La prevalencia de cagA en los 3 tipos de muestras se encuentra dentro del rango reportado en estudios previos en Venezuela y en otros países (32 a 77%), utilizando diferentes técnicas diagnósticas como serología y ensayo de sonda lineal (Line probe assay) (28-29, 34-37).
Finalmente, el estudio de PCR mostró una detección de H. pylori similar en jugo y en biopsias esofágicas con una alta sensibilidad y especificidad al ser comparados con biopsias gástricas, lo cual indica que ambos tipos de muestras pueden ser utilizados eficazmente para un diagnóstico seguro de la infección, empleando genes esenciales y de virulencia propios de la bacteria.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo fue financiado por Misión Ciencia, Proyecto de Investigación y Desarrollo en Red Nº 2007001442. Sub-proyecto Bacterias, sub-objetivo 1.3.2. H. pylori.
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