Limbal Deficiency Syndrome.

The cornea, the transparent tissue of the eye, is formed by an epithelium of five distinct layers that is in continual renewal through a population of limbocorneal stem cells located in the basal layer. Its normal activity depends on a variety of intrinsic and extrinsic factors, that altered, can lead to partial or total loss of progenitor cells leading to a progressive loss of vision. This article reviews the importance of this crippling disease, constituting a major health problem. Several techniques have been developed, but the transplant of the limbus using autograft or allograft accompanied by a treatment to suppress inflammation and neovascularization is still the most widely used. At present, this procedure is being replaced by the new techniques of tissue engineering, which have multiple benefits, such as more safety, efficiency, elimination of the risks of rejection, decrease of time of treatment and lower costs. The use of limbal cells cultures has made possible to develop a more secure and refined technology. In this review we emphasize one of these techniques, which has proven to be very effective and advantageous to produce the epithelium of the cornea in vitro.

Recibido: 28-12-2011. Aceptado: 07-06-2012

INTRODUCCIÓN

La córnea es un tejido con características muy particulares que le permiten al ojo cumplir su función fundamental. Orgánicamente consiste en una lente cóncavo-convexa con una cara anterior cubierta con una película lagrimal más una cara posterior bañada por el humor acuoso (1). Estructuralmente es una membrana regular y uniforme formada por un conjunto ordenado de fibras de colágeno de estrecho diámetro y sin vasos sanguíneos, lo cual le confiere transparencia. En cuanto a las lágrimas y el humor acuosos, sus funciones son vitales al encargarse de mantener sus requerimientos fisiológicos de hidratación, lubricación, intercambio y protección. Debido a su morfología la córnea tiene una gran capacidad refractiva, actuando como un lente convergente con un poder de refracción en su cara anterior de aproximadamente 48,8 dioptrías y de 5,8 dioptrías en su superficie posterior (2). 

La córnea está cubierta por un epitelio estratificado no queratinizado que representa el 10% de su grosor, el cual contiene cinco capas en su región central y cerca de diez en la zona periférica, formando una barrera eficaz contra la entrada de patógenos y protegiendo de los factores físicos externos. Las células del epitelio son constantemente renovadas por proliferación de las células madre limbales (CML por sus siglas en español) localizadas en la región basal del epitelio. Las células más superficiales del epitelio mueren por apoptosis, se descaman periódicamente y tienen un promedio de vida de 3 a 7 días, no estando aun claros los mecanismos moleculares de su regulación (3, 4). Las evidencias acumuladas indican que su función está determinada por el microambiente que las rodea, el denominado “nicho limbal” (5-7).

Cuando las CML son lesionadas y destruidas o el nicho límbal es disfuncional, puede surgir un estado patológico conocido como “síndrome de insuficiencia limbal”, el cual puede ser definido como “la incapacidad de las células CML de mantener la integridad del epitelio de la córnea”. Con esta revisión se aporta información sobre la histología y fisiología del epitelio de la córnea tanto en condición normal como patológica, discutiéndose adicionalmente la utilización de las nuevas técnicas de Ingeniería de Tejidos como medio terapéutico avanzado y efectivo para el tratamiento del paciente con el síndrome limbal. 

I. EPITELIO DE LA CÓRNEA Y SÍNDROME LIMBAL 

Estructura del epitelio de la superficie ocular 

1) El epitelio de la conjuntiva. Es un epitelio estratificado escamoso no queratinizado y bien vascularizado que contiene células caliciformes secretoras de mucina, la cual contribuyen a mantener la capa lagrimal de la superficie ocular. Sus células madre o CM –que en inglés son las denominadas stem cell o SC– tienden a localizarse tanto en las áreas de mayor grosor como en las zonas de mayor pigmentación de este epitelio. Se ha encontrado que las células progenitoras del epitelio conjuntival son bi-potenciales, siendo precursoras tanto de células caliciformes como no caliciformes (8). En cuanto a la diferenciación de las células caliciformes, ellas parecen requerir de un medio ambiente constituido por un estroma más específico, como se demostró con estudios de células epiteliales conjuntivales sobre membrana amniótica (9). La diferencia entre los fenotipos epiteliales cornéales y conjuntivos se basa en la expresión de diferentes queratinas –mucinas–, siendo las citoqueratinas CK4 y CK13 las que se expresan en el epitelio conjuntival (10). 

2) El epitelio del limbo. Este epitelio está en la zona de transición entre el epitelio de la córnea y el epitelio de la conjuntivo, siendo morfológicamente diferente a ambos. Se diferencia del corneal por poseer melanocitos y células de Langerhans, que son dendríticas presentadoras de antígenos; en cuanto al conjuntival, carece de sus células caliciformes. Las células basales del limbo se disponen en una monocapa de células cilíndricas sobre la membrana basal a la que se une por medio de hemidesmosomas que se fijan a las fibras de anclaje de dicha membrana, compuesta por colágeno tipo VII que penetra en la estructura del estroma uniéndose a placas compuestas por colágeno tipo IV y VII. Las células de este epitelio son mitóticamente activas y sus núcleos se disponen perpendicularmente a la superficie, siendo ricas en filamentos de actina que desempeñan un papel muy importante en la migración celular. El epitelio limbal se encuentra sobre un estroma altamente vascularizado, cuyos vasos forman parte de las empalizadas de Vogt, lo que permite un contacto estrecho entre vasos sanguíneos y epitelio, aportando altos niveles de nutrientes y oxígeno (11, 12). 

La sustitución de las células de la córnea que mueren por apoptosis, manifestando un mecanismo de autorenovación semejante al que ocurre en la epidermis, el epitelio intestinal y en el mecanismo de la hematopoyesis (13, 14). En todos estos tejidos las células están jerarquizadas en tres niveles: a) holoclones, las células CM, que se encuentran localizadas en el limbo; b) paraclones, células amplificadoras transitorias (CAT), terminalmente diferenciadas; c) meroclones, consideradas “paraclones jóvenes” por su mayor capacidad proliferativa (15). Así como se ha demostrado la existencia de los holoclones en el limbo corneal, también se ha demostrado la gran mayoría de células CAT en el epitelio corneal, estando dada su importancia por tener la capacidad de constituir un tejido que se auto-renueva constantemente, lo cual es esencial, indicando su propio nombre que “amplifican cada división de las primeras”. De esta forma se reduce el número de divisiones de los holoclones, lo que significa que las células CM conservan su carga genética y se reduce la acumulación de mutaciones (16). Independientes de su localización, las CM presentan una serie de características fundamentales: una vida larga; un potencial ilimitado para dividirse; un ciclo lento de división; poca o nula diferenciación, y estar convenientemente ubicadas en sitios protegidos que aseguran su función y viabilidad (17). 

3) El epitelio de la córnea. Este epitelio utiliza como estrategia para expandir su población celular el reclutamiento de las células CM, lo cual hace posible que se produzcan más células de transito amplificadas (CTA), haciendo que aumente su tasa y eficacia de la replicación (18). Las CML se encuentran en la capa basal del epitelio limbal mientras que las CAT se encuentran en la capa basal de todo el epitelio corneal, creando un movimiento celular centrípeto que es el responsable de la regeneración del epitelio corneal central (17). Conforme las células se van moviendo de esa forma también van desarrollando características de células CAT y adquiriendo marcadores de novo, como las citoqueratinas 3 y 12, correspondientes al fenotipo diferenciado (19). La capa basal del epitelio limbal contiene tanto células CM como células CAT; mientras que el epitelio corneal está constituido por una jerarquía de las células CTA, localizadas en la periferia con capacidad de multiplicarse varias veces, mientras que las localizadas en la córnea central presentan una capacidad de división muy limitada, constituyendo colonias terminales (18). Por otra parte, las células limbocorneales no se encuentra en igual proporción alrededor de la superficie esclero-corneal, encontrándose su mayor proporción en la superficie superior e inferior en comparación a la región temporal y nasal (20).

Importancia del microambiente del estroma 

Los estudios han puesto de relieve el papel fundamental del microambiente del estroma o nicho limbal en el mantenimiento y la homeostasis tanto del limbo como del epitelio de la córnea (21). Si bien las características específicas del nicho no han sido completamente caracterizadas, este debe incluir los factores celulares y extracelulares (22), esto queda demostrado por los fibroblastos del estroma, los cuales son componentes fundamentales debido a su interacción íntima con el epitelio a través de la producción de citoquinas y factores de crecimiento (21, 23-25). También es evidente que algunos de los factores que proceden de la sangre también ayudan a mantener las células en estado indiferenciado, tal como ocurre con las pequeñas proyecciones del epitelio limbal, llamadas empalizadas de Vogt (1, 26). 

Las citoquinas se expresan de diferentes maneras tanto en el limbo como en la córnea central, estando clasificadas en tres grupos: a) citoquinas tipo I, como la interleuquina IL-1b producida por las células epiteliales corneales, la cual estimula la producción de las citoquinas III en los fibroblastos del limbo y la córnea; b) citoquinas tipo II como la TGF-b1 producidas por las células en proceso de epitelización, que inhibe la producción de citoquina tipo III por los fibroblastos del limbo y la córnea; c) citoquinas tipo III, como el factor de crecimiento de queratinocitos (keratinocyte growth factor o KGF, por sus siglas en inglés) producido por los fibroblastos del limbo y el factor de crecimiento de los hepatocitos (hepatocyte growth factor o HGF, por sus siglas en inglés), producido por los fibroblastos de la córnea; ambos controlan sinergísticamente la cicatrización de las heridas cornéales (27-30). 

Como fue mencionado, la preservación de las células CML dependen de la condiciones del medio interno y externo, por lo que su regeneración requiere condiciones específicas que solo se encuentren en el nicho donde están localizadas estas células (31). Fuera de estas condiciones ellas proliferan desarrollando una expresión gradual de diferentes marcadores celulares, por lo que durante la diferenciación se van expresando nuevos genes a la vez que se suprimen otros previamente expresados. Los estados intermedios presentan gran capacidad proliferativa, pero después de un número de replicaciones esta capacidad va disminuyendo hasta alcanzar la diferenciación terminal (32).

Marcadores histológicos de las células madre de la córnea 

Los queratinocitos oculares pueden contener todas las isoformas DN, siendo DNp63a la más abundante, presente en los holoclones del limbo, pero no en la córnea central (37). Por otra parte se reveló que ANp63a y la integrina 1b son marcadores que representan la misma población celular dentro de la epidermis humana. Se podría pensar que ANp63a controlaría la expresión de la integrina 1b, la cual a su vez podría regular señales ejercidas desde la matriz extracelular hacia la cascada de transcripcional de p63. Por otra parte, un miembro de la familia de las integrinas, la subunidad 3a, está bajo control transcripcional de las isoformas de ANp63a, lo cual provee una base molecular a la hipótesis de que la familia p63 es esencial para el control del destino de las células CM por las interacciones entre la epidermis y el mesénquima (38). 

En cultivos autólogos de células epiteliales limbales se encontró una marcada expresión de las citoqueratinas 14 y 19, más expresión elevada de p63, asociada a bajos niveles de expresión de citoqueratina 3. Estos bajos niveles de expresión confirman la baja diferenciación de este epitelio limbal, mientras que existe una co-expresión de las citoqueratinas 14, 19 y p63; lo que se asocia a un gran potencial proliferativo de las células epiteliales limbales (39-42). También se ha demostrado como la proteína transportadora ABCG2 se encuentra en la membrana celular y en el citoplasma de la mayoría de las células basales del epitelio limbal, pero no en las células epiteliales corneales. Se le considera un marcador de superficie útil en la identificación y aislamiento de las células CML, aunque su función específica es aún desconocida. Hay hipótesis que hacen referencia al papel fisiológico de ABCG2 en la protección de las células CM en la excreción de sustancias genotóxicas (5, 43, 44). En la presente revisión es importante señalar que se ha observado cómo ciertos marcadores no se expresan o lo hacen mínimamente en el epitelio basal limbar, siendo ellos la conexina 43, las citoqueratinas 3 y 12, la nestina, la caderina E y la involucrina. Algunos de estos marcadores son específicos del epitelio corneal diferenciado (1, 45). 

Es importante señalar algunas propiedades y características significativas de las CM, tales como: a) ser originadas en el ectodermo neural, lo cual se constata in vitro al haberse demostrado mediante reacciones inmuno-histoquímicas la presencia de receptores a neurotransmisores tales como gaba, dopamina o serotonina, hecho que determina las propiedades neurológicas de origen (46-48); b) en condiciones normales, la invasión corneal por parte del epitelio conjuntival vecino es impedida por las células limbares; c) la conjuntivalización corneal produce una tinción anómala con fluoresceína, la cual es tardía debido a que el epitelio conjuntival deja pasar la fluoresceína a diferencia del epitelio corneal; d) al dañarse las células limbales, el epitelio conjuntival migra sobre el estroma corneal, produciendo la conjuntivalización, que se acompaña de vascularización corneal (1). 

Patologías de la córnea y deficiencias  de las células madre limbales 

Hay algunas patologías de la córnea cuya naturaleza se asocia con las deficiencias de las CML (49). Tales deficiencias se deben a los siguientes fenómenos: 

1. Por aplasia, que es la pérdida total de las CML debida a una destrucción primaria: 

• traumáticas, por daño químico, daño térmico o inducido por lentes de contacto. 

• ]]> iatrogénicas, producidas por cirugías limbales múltiples o por medicamentos tópicos utilizados a largo plazo (toxicidad) 

• autoinmunes, producidas por el síndrome de Stevens-Johnson; por penfigoide ocular cicatricial o por querato-conjuntivitis atópica. 

2. Por hipofunción, que es la pérdida gradual de la función de las CML debido a soporte estromal insuficiente, que puede ser debida a: 

• hipofunción congénita, como lo es la aniridia, la displasia ectodérmica, el síndrome de queratitis-ictiosis-sordera y la queratitits asociada con deficiencias endocrinas múltiples. 

• hipofunción neural o isquémicas, la queratopatía neutrófica 

• ]]> hipofunción inflamatorias e infecciosas, producidas por limbitis crónica o queratitis ulcerativa corneal periférica. 

• hipofunción de otros tipos, como los producidos por el pterigión y pseudo pterigión idiopático. 

II. TRATAMIENTO DE LA INSUFICIENCIA LIMBAL 

Manejo de la insuficiencia limbal 

En el tratamiento de la insuficiencia limbal se han utilizado, como soporte, los lubricantes tópicos, los lentes de contacto terapéuticos y la tarsorrafia (50); de desarrollarse opacidad corneal grave se recurría a la queratoplastia lamelar o penetrante (51). Ya que el síndrome de insuficiencia limbal está relacionado con la deficiencia de las CML o una disfunción de éstas por las alteraciones del microambiente que las rodea, el tratamiento debe ir encaminado a repoblar el limbo y preservar la integridad esclero-corneal, siendo por tanto su objeto mantener los procesos de reparación epitelial tanto en situaciones fisiológicas como patológicas. Así, cuando la integridad del limbo se encuentre comprometida, es de suma importancia asegurar su reconstrucción anatómica y funcional con el objeto de mantener una población suficiente de las CML para poder asegurar la regeneración epitelial corneal (52, 53). A continuación hablaremos sobre los principales recursos y tratamientos que se han utilizado hasta el presente para tratar de resolver la insuficiencia limbal. 

Lágrimas artificiales. Estas no tiene ningún efecto sobre la actividad de las células CM, sin embargo suele mejorar sintomáticamente las molestias derivadas de la sequedad ocular que acompaña a estos procesos (54). 

Suero autólogo. Por sus numerosos factores activos, tales como el factor de crecimiento epitelial, la fibronectina, la vitamina A, el factor transformador de crecimiento de fibroblastos, las antiproteasas, las anticolagenasas, etc., el suero autólogo contribuye a mejorar el microambiente, y facilita los distintos mecanismos implicados en la renovación y mantenimiento celular del epitelio (55). 

Trasplante con membrana amniótica. Las membranas fetales han sido uno de los elementos biológicos más antiguos que se han utilizado en el tratamiento de diversas patologías que requieren regeneración tanto cutánea como mucosa. Entre ellas destaca la membrana amniótica, constituida por un epitelio formado por una monocapa de células con su membrana basal y una matriz estromal (56). Presenta propiedades tanto mecánicas como biológicas de importancia fundamental para la reconstrucción tisular, ya que su epitelio produce factores de crecimiento, lo cual le da un gran valor terapéutico. Particularmente la membrana basal es muy similar en su composición a la membrana basal de la córnea, actúa como buen sustrato y favorece la migración y adhesión de las células epiteliales. Adicionalmente, facilita la proliferación de las células progenitoras del epitelio corneal y promueve la diferenciación celular. La matriz estromal reduce la formación de tejido de granulación y cicatrización, además de favorecer la supresión del factor de crecimiento transformante, disminuye la noevascularización y la inflamación, la cual produce retrasos en la epitelización (57, 58). Así, cuando es usada para el tratamiento de la cornea, la membrana amniótica mejora significativamente el medio ambiente de la matriz extracelular de las células epiteliales limbales, siendo muy útil para el tratamiento de pacientes con insuficiencia limbal parcial, ya que sus distintos factores favorecen el desarrollo y expansión de las CML. Sin embargo, se ha podido demostrar que en el caso de pacientes que presentan aniridia, el tratamiento con la membrana amniótica solo ofrece resultados transitorios (59, 60). Asimismo; ya se ha demostrado que para mejorar las probabilidades de éxito, al usar implantes con la membrana amniótica, es necesario eliminar sus células para trabajar solo con la matriz de soporte, ya que ellas pueden causar rechazo inmunológico, por lo que resulta muy conveniente eliminarlas (61-63). 

1. Auto-trasplante desde un mismo ojo o del contra-lateral. Consiste en la transferencia de tejido limbal del ojo no lesionado, o menos lesionado, al más severamente dañado. Las lesiones provocadas por la toma de tejido curan rápidamente y no se observan cambios refractivos, inflamaciones crónicas, defectos epiteliales persistentes, ni neo-vascularizaciones corneales durante el postoperatorio. Previo al procedimiento siempre debería descartarse patología subclínicas que pudiera pasar inadvertida en el momento de la donación y ser motivo de complicaciones futuras (65). 

2. Trasplante de limbo alogénico. El trasplante de limbo alogénico solo se utiliza cuando el otro ojo del paciente no presenta un buen estado o cuando, por cualquier circunstancia no se considera prudente obtener tejido del ojo contra-lateral. El mismo se obtiene a través de un donante, siendo ideal la donación por parte de un familiar con compatibilidad de grupo sanguíneo. Siempre será deseable encontrar donantes menores de 50 años, ya que así se asegura una mayor cantidad de CM. Por otra parte, invariablemente, es necesario considerar, un tratamiento inmunosupresor sistémico (66). 

Trasplante con células madre. Al haberse desarrollado las técnicas para la expansión in vitro de las células progenitoras del limbo, ellas se han podido utilizar adecuadamente y eficientemente para el tratamiento de los casos de insuficiencia límbica unilateral, por lo que hoy en día el trasplante con CM es considerado la mejor alternativa terapéutica existente (67). En las investigaciones realizadas para el cultivo de las células del limbo con fines terapéuticos un aspecto crítico ha sido encontrar un soporte para que las células puedan trasplantarse de forma adecuada y segura. Tal soporte es fundamental, ya que debe ser una matriz apropiada que asegure tanto el soporte como la preservación de las propiedades de las CM. El ambiente creado debe ser óptimo para el crecimiento, ya que se debe poder producir un número de células activas suficiente a partir de la pequeña muestra del tejido donante, lo cual permitirá que tanto la caracterización como el mantenimiento de las propiedades de las células limbales cultivadas puedan usarse para cumplir con el objetivo de reconstruir adecuadamente la superficie ocular (68). 

Para desarrollar una matriz de soporte más eficiente se han realizado diversos estudios utilizando, entre otros, diversos tipos de geles, así como fibronectina y colágeno, pero los resultados obtenidos han sido limitados (69). Igualmente se han reportado el uso de soportes sintéticos realizados con polímeros, los cuales han causado fuertes procesos inflamatorios, y han presentado problemas para su degradación (70). Una novedad en cuanto a una matriz de soporte, es la utilización de un lente de contacto sobre el cual se cultiva un fragmento de limbo para posteriormente colocarlo en la superficie ocular afectada. Este procedimiento, por los resultados alcanzados con los primeros ensayos que reportan la recuperación visual de los pacientes tratados, deben ser confirmados y con el tiempo será determinada su efectividad, que bien pudiera ser exitosa o no conveniente a largo plazo (71). 

Síndrome limbal y matriz de fibrina. El éxito de las técnicas de ingeniería de tejidos reposan en crear las condiciones óptimas in vitro para el mantenimiento y diferenciación de las CM, donde destaca el papel que juega la matriz de soporte para su cultivo (72). Como ya se mencionó, la membrana amniótica ha sido la más utilizada como soporte para la expansión de las CML, pero ahora también se está recurrido a la fibrina como matriz suplente de la matriz extracelular, la cual tiene las siguientes ventajas: (a) es un sistema natural que participa en la reparación de heridas; (b) puede ser reabsorbida in vivo; (c) posee escasa antigenicidad, por lo que no desencadena rechazo inmunológico; (d) prolonga la supervivencia y capacidad de clonación de las CM; (e) promueve la diferenciación de las células epiteliales; (g) tiene propiedades antibacterianas; (h) inhibe la angiogénesis (73-76). 

Se han publicado múltiples trabajos sobre la utilización de la fibrina como soporte, destacando el trabajo pionero de Pellegrini y col. (77), quienes reportaron resultados exitosos de pacientes con patología unilateral de la superficie ocular tratados con CM obtenidos de biopsias epiteliales oculares cultivadas sobre una matriz de fibrina. Posteriormente han aparecido un gran número de publicaciones con trabajos donde se ha evaluado el efecto de diferentes variables con la finalidad de establecer las condiciones óptimas y favorables para preservar la expresión del fenotipo en las CM, destacándose diferentes medios nutritivos de cultivo, métodos de disociación, selección de ciertas regiones del limbo, crecimiento clonal, edad del donante etc. Ello ha llevado a optimizar la metodología para la expansión y mantenimiento de las células indiferenciadas, bien sea para su aplicación terapéutica inmediata o futura para conseguir la regeneración del epitelio de la córnea. Hay trabajos en los cuales, además del soporte de fibrina, se han añadido a la matriz otros componentes, destacando el uso de las células 3T3 para que actúen como capa de alimentación, bien conocidas como feeder layer o nurse cells. También se han probado diferentes concentraciones de suero y factores de crecimiento, como los EGF, TGFa y KGF, los cuales promueven y estimulan el crecimiento clonal y mantienen el fenotipo de las CM durante todo el proceso de cultivo (68, 78-80). 

Por otra parte, también se han realizado trasplantes de CML obtenidas a partir de las células multipotentes que se encuentran en la mucosa bucal de todas las personas, pudiéndolo hacer, por tanto, de los pacientes con deficiencia límbica (81). Nishide y colaboradores obtuvieron resultados positivos con trasplante de células obtenidas de la mucosa bucal autológa en el caso de deficiencia límbica de ambos ojos, para lo cual no se hizo necesario aplicar un tratamiento con inmunosupresores (82). Pacientes con queratitis corneales fueron tratados con células de la mucosa bucal autóloga y mostraron una re-epitelización y reducción del proceso de la inflamación en la zona ocular (83). Se compararon además, células del epitelio bucal con células epiteliales límbicas, las cuales morfológicamente expresaron marcadores similares tales como p63, ABCG2, la isoforma de p63 (Np63) y Mucina 1,4,16 (84). A pesar de las limitaciones existentes, como lo es no conocer definitivamente la presencia de un marcador específico que caracterice a las células del limbo, así como no conocer todavía, profundamente el funcionamiento y microambiente que rodea a las CML, esto no ha sido un impedimento para el desarrollo y aplicación de esta técnica. 

CONCLUSIÓN 

La insuficiencia limbal, problema de salud de singular importancia, puede ser invalidante para el paciente que lo sufra, teniendo consecuencias personales, sociales y económicas notables. Esta revisión pone de manifiesto la importancia de esta patología por lo que se revisó y evaluó tanto la biología de la córnea como la génesis, el manejo y los diferentes tratamientos que se ha utilizado para su solución clínica. En la actualidad las técnicas más utilizadas para tratarla están siendo sustituidas por los nuevos desarrollos realizados mediante la ingeniería de tejidos, los cuales tienen múltiples ventajas, destacando la eliminación de los riesgos de rechazo, disminución del tiempo de tratamiento y reducción de los costos. Es innegable que las células limbales en cultivo han hecho posible crear técnicas cada vez más perfeccionadas y seguras, por lo que consideramos que con ellas se podrá controlar y curar eficientemente la insuficiencia limbal. 

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