María Victoria Méndez¹, Cristy León², Arnelly Escalona², Edgar Abadia², Omaira Da Mata³, Jacobus de Waard³ y Howard Eugene Takiff².

¹ Universidad de Carabobo-Sede Aragua, Maracay, Venezuela.

² Laboratorio de Genética Molecular, Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC), Caracas, Venezuela.

³ Instituto de Biomedicina-Universidad Central de Venezuela, Caracas, Venezuela.

Autor de Correspondencia: María Victoria Méndez. Universidad de Carabobo-Sede Aragua. Maracay, Venezuela. Telef. 00584144748241. Correo electrónico: mvmendezster@gmail.com.

Resumen. La técnica de espoligotipaje y el método de unidades repetitivas micobacterianas interdiseminadas y número variable de repetidos tándem (MIRU-VNTR) 24 loci se emplean para estudiar la epidemiología molecular de tuberculosis. En el presente trabajo evaluamos la discriminación del método MIRU-VNTR 24 loci solo y en asociación con espoligotipaje en aislados clínicos de M. tuberculosis en Venezuela, la diversidad alélica de los 24 loci, y el poder discriminativo para la combinación de 24 y 15 loci, 12 loci tradicionales (12t), aquellos con más alta diversidad alélica y una nueva combinación que denominamos 12 inv. Se estudiaron 104 cepas de diferentes linajes y 431 cepas de la familia Latin-America y Mediterráneos (LAM). Los loci 4052, 2163b, 424 y 2996 presentaron la más alta diversidad alélica. Las tasas de agrupamiento de MIRU-VNTR 24 loci, espoligotipaje y MIRU-VNTR combinado con espoligotipaje para 104 aislados fueron de 18,27%, 71,15% y 14,4%, respectivamente, mientras que para cepas LAM fue de 43,2%, 95,8% y 37,4%. Las combinaciones de 15, 12inv y 4 loci MIRU-VNTR mas discriminativos, fueron más discriminatorios que 12t. Las tasas de agrupamiento para 15 y 12inv MIRU VNTR acoplados a espoligotipaje en los 104 aislados fueron de 21% y 23%, mientras que para cepas LAM fue de 52% y 46% respectivamente. El número de patrones diferentes fue similar para 12inv y 15 loci. Se propone el uso de un número reducido de loci MIRU-VNTR informativos acoplado a espoligotipaje para estudios de la transmisión de la tuberculosis en Venezuela.

Palabras clave: tuberculosis; epidemiología molecular; MIRU-VNTR; espoligotipaje.

Evaluation of discriminatory power of molecular epidemiology techniques in Mycobacterium tuberculosis Venezuelan isolates.

Abstract. The techniques of spoligotyping and mycobacterial interspersed repetitive unit and variable-number tandem repeat typing with 24 loci (MIRU-VNTR-24), have been used to study the molecular epidemiology of tuberculosis. The aim of this study was: to evaluate the discriminative power of MIRU-VNTR 24 loci alone and in association with spoligotyping in clinical isolates of M. tuberculosis in Venezuela; the allelic diversity of the 24 loci; and the discriminative power for the combination of 24 and 15 loci, 12 traditional loci (12t), those with higher allelic diversity and a new combination named 12inv. We analyzed one set of 104 strains of different lineages and a second set of 431 strains belonging to the Latin-America and Mediterranean lineage (LAM) that is predominant in Venezuela. The determination of allelic diversity showed that 4052, 2163b, 424 y 2996 are highly discriminative. Clustering rates of MIRU-VNTR 24 loci, spoligotyping and MIRU-VNTR combined with spoligotyping for 104 isolates were 18.27%, 71.15% and 14.4%, respectively, whereas with the 431 LAM strains the values were 43.2 %, 95.8% and 37.4%. MIRU-VNTR combinations of 15, 12inv and 4 loci were more discriminatory than 12t. Clustering rates for MIRU-VNTR 15 and 12inv loci coupled with spoligotyping in the 104 isolated was 21% and 23%, while for LAM strains was 52% and 46% respectively. The number of different genetics patterns for 15 and 12inv loci were similar. In conclusion, we propose the use of a small number of informative loci MIRU-VNTR coupled to spoligotyping to investigate the transmission of tuberculosis in Venezuela.

Recibido: 24-11-2014. Aceptado: 12-11-2015

INTRODUCCIÓN

La tuberculosis (TB) continúa siendo un problema de salud pública a nivel mundial. La Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que cada año se producen 9 millones de casos y mueren 1,7 millones de personas (1,2). La incidencia de TB en Venezuela es moderada, con aproximadamente 33 casos por cada 100.000 habitantes por año (1,2).

El entendimiento de la dinámica de la transmisión de la TB se ha logrado gracias a la aplicación de diferentes técnicas de epidemiología molecular (EM). Entre las técnicas más utilizadas, se encuentra aquella basada en el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción, conocida como RFLP IS6110. El método fue considerado el estándar de oro por su alta capacidad de discriminación, a pesar de tener como desventajas el ser laborioso, no generar formatos digitales que faciliten la interpretación de los resultados y las comparaciones intra e interlaboratorios, además de requerir de mucho ADN de excelente calidad (3, 4).

En los últimos años, dos métodos alternativos basados en PCR han sido utilizados: el espoligotipaje y el análisis de Unidades Repetitivas Micobacterianas Interdiseminadas basado en el Número Variable Repetidos Tandem conocida como MIRU- VNTR. La técnica de espoligotipaje se fundamenta en la amplificación por PCR del locus de repetidos directos (DR) (4,5) que pertenece a la familia de repetidos cortos palindrómicos interdiseminados regularmente (CRISPR) (6). La técnica ha sido útil ya que el polimorfismo presente en la región DR ha permitido la asociación de linajes con regiones geográficas a nivel mundial. Sin embargo, su principal desventaja radica en que es poco discriminatoria, por lo que no es útil para detectar brotes ni cadenas de transmisión (7).

El método MIRU-VNTR está basado en la amplificación por PCR de múltiples loci con secuencias repetidas que están presentes en el genoma de M. tuberculosis, y permite determinar el número de repetidos en cada locus. Inicialmente, se empleó un sistema denominado ¨tradicional¨, que utilizaba 12 loci para estudios epidemiológicos (8), pero su discriminación no era comparable con el método RFLP IS6110 (7). Finalmente, se propuso un formato estandarizado de 24 loci con una discriminación comparable al método RFLP IS6110 y superior a espoligotipaje y un subgrupo de 15 loci para estudios epidemiológicos (9, 10). Por su capacidad discriminatoria, MIRU-VNTR 24 loci es actualmente considerado el método estándar de oro para la tipificación genética de M. tuberculosis (11).

Adicionalmente, en diferentes estudios se ha demostrado una variabilidad en el nivel del polimorfismo de los loci MIRU-VNTR que puede atribuirse al origen geográfico de la cepa y a diferencias entre los linajes genéticos (9, 6). Por otra parte, basados en la diversidad alélica de los diferentes loci MIRU-VNTR, existen evidencias previas que sugieren, que el número y la combinación de loci MIRU-VNTR a utilizar para discriminar entre los genotipos, puede adaptarse a la población de cepas M. tuberculosis encontradas en el área en estudio (13, 14).

En Venezuela, un estudio previo en una población amerindia de alta incidencia de TB conocida como Waraos, constató que el 78% de los aislados de M. tuberculosis presentaban similitud genética, por lo que se encontraban agrupados en clusters, pero además demostró que MIRU-VNTR 15 loci combinado con espoligotopaje, así como MIRU-VNTR 24 loci, tienen la suficiente discriminación para reemplazar el método RFLP IS6110 (15). Otra investigación previa a gran escala en Venezuela, en el que se aplicó espoligotipaje, demostró que los linajes más predominantes fueron Latin América-Mediterráneos (LAM) en 53%, seguido del genotipo T (10,6%) y Haarlem (5%). Los cinco espoligotipos más frecuentes fueron los tipo compartidos o SIT 17 (18,6%), 93 (9,9%), 605 (7,2%), 42 (6,5%) y 53 (4,1%) (16).

Aunque estudios previos han sugerido que MIRU-VNTR 24 loci posee mejor discriminación que el método de espoligotipaje, fue en el presente estudio que por primera vez se aplicaba la técnica a gran escala con los diferentes genotipos encontrados en Venezuela por la técnica de espoligotipaje. Es por lo antes expuesto, que el objetivo de la investigación fue evaluar la discriminación del método MIRU-VNTR 24 loci solo y en asociación con espoligotipaje en aislados clínicos de M. tuberculosis en Venezuela. Además, nos propusimos determinar la diversidad alélica de los 24 loci y comparar su poder discriminativo con el set de 15 loci (10), los 12 loci tradicionales (12t) (8), y un set de loci seleccionados que presentaran la más alta diversidad alélica en la población de cepas de M. tuberculosis en Venezuela. Por otra parte, se determinó la capacidad de la técnica de designar los aislados de M. tuberculosis venezolanos en su linaje correspondiente.

Cepas micobacterianas: Se analizaron un total de 469 aislados clínicos de M. tuberculosis provenientes de diferentes regiones de Venezuela (Distrito Capital, Carabobo, Delta Amacuro, Sucre, Apure y Aragua), previamente caracterizados por espoligotipaje: 352 aislados LAM, 7 Haarlem, 3 S, 25 T, 1 Beijing, 76 del ST 605 y 5 aislados únicos (16), para evaluar la capacidad del método MIRU-VNTR 24 loci en la designación de los aislados dentro de su linaje correspondiente. Posteriormente, para los estudios de discriminación, se seleccionaron al azar un total de 104 cepas pertenecientes a diferentes linajes (Tabla I). Finalmente, el análisis de discriminación se complementó con 431 cepas pertenecientes exclusivamente al linaje LAM (STs 17, 93, 42, 60, 64, 130, 216, 960, 1367, 1694, 1691, 1696, 1698, 1702 y 0,817/LAM) y al ST 605.

Extracción del ADN: Las cepas de M. tuberculosis fueron recuperadas de muestras congeladas en glicerol y sembradas en medio de Lowenstein Jensen, incubadas a 37oC por 3 a 4 semanas. El ADN fue extraído usando la técnica de muerte celular por calentamiento. Se resuspendieron las colonias de M. tuberculosis obtenidas del medio de cultivo Lowensten Jensen en 200 μl buffer TE (Tris-HCl 10 mM/EDTA 1mM pH 8,0), en tubos Eppendorf de 1,5 ml con tapa de seguridad. Se incubaron a 80oC-85oC por 20 a 30 min. usando un horno o en baño de María. Posteriormente, se procedió a centrifugación por 2 a 3 min. a 15000 rpm. Finalmente, se tomó el sobrenadante que contenía el ADN genómico y se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf. El ADN concentrado se preservó a -20oC hasta su uso (6,17).

Técnica de espoligotipaje: Fue realizada de acuerdo al protocolo internacional estandarizado (5). Las secuencias espaciadoras contenidas en el locus repetido directo se detectaron por hibridación en membranas comerciales o preparadas en el laboratorio (5). Los ADN de M. tuberculosis H37Rv y de M. bovis BCG fueron utilizados como controles positivos. El patrón de hibridación de las 43 secuencias espaciadoras fue transcrito del film a un formato Excel. Posteriormente, los espoligotipos obtenidos fueron comparados con la base de datos internacional SITVITWEB. Finalmente, los aislados fueron asignados en linajes y familias de acuerdo a las bases de datos internacionales (18).

Técnica MIRU-VNTR: Los 24 loci fueron amplificados usando multiplex PCR con los cebadores y las especificaciones del protocolo estandarizado por Supply y col. (10). Los productos de la amplificación fueron analizados por electroforesis capilar en un secuenciador ABI 3130xl (Applied Biosystems), utilizando un marcador de peso molecular de 1000 bp marcado con el fluoróforo ROX (Bioventures). El tamaño de los amplicones y el número de repetidos se determinó con el programa Gene Mapper (PE Applied Biosystems).

Análisis de diversidad alélica y discriminación: La diversidad alélica (h) de cada locus MIRU-VNTR se calculó de acuerdo a lo publicado por Sola y col., 2003 (19). Los perfiles genéticos de MIRU-VNTR y espoligotipaje, se analizaron con el programa MIRU-VNTR plus (20), disponible en la página web: http://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index. faces. Los dendogramas se construyeron utilizando la opción ¨categorical¨ y unweighted pair group method (UPGMA). La discriminación de las técnicas se evaluó con la fórmula de tasa de agrupamiento (c) (21).

RESULTADOS

Evaluación del método MIRU-VNTR 24 loci en la designación de aislados en su linaje correspondiente.

El análisis del dendograma arrojó una amplia diversidad genética entre los 469 aislados. En ese sentido, se encontraron 276 patrones diferentes, que para efectos del presente trabajo serán denominados “mirutipos”, que incluían 230 mirutipos únicos, no asociados a clusters y 46 mirutipos que agruparon 239 aislados. El tamaño de los clusters oscilaba desde 2 hasta 53 cepas.

Análisis de la diversidad alélica:

Los resultados obtenidos sugieren que existen diferencias entre la capacidad discriminatoria de los diferentes loci MIRU-VNTR en las cepas analizadas. La diversidad alélica más alta fue encontrada en el locus 4052 (QUB 26), seguido de los loci 2163b (QUB11b), 2996 (MIRU26) y 424 (Mtub04). De acuerdo con los valores de discriminación (h), se observó que estos cuatro loci fueron altamente discriminatorios en ambos grupos de cepas analizados. En los dos grupos, fue posible observar que los loci 154 (MIRU02), 577 (ETRC), 802 (MIRU40), 1644 (MIRU 16), 2461 (ETRB), 3171 (Mtub34) y 3192 (MIRU 31) resultaron ser moderadamente discriminatorios, mientras los loci 580 (MIRU04), 2059 (MIRU20), 2347 (Mtub29), 2687 (MIRU24) y 3007 (MIRU27) mostraron ser poco discriminatorios, y el locus 2687 (MIRU24) presentó una diversidad alélica nula. Adicionalmente, se encontraron diferencias en la diversidad alélica entre el grupo de 104 aislados y el grupo de cepas LAM y el ST 605. En ese sentido, mientras los loci MIRU-VNTR 2531 (MIRU23), 3690 (Mtub39), 1955 (Mtub21), 2165 (ETRA), 2401 (Mtub30), 960 (MIRU10), presentaron moderada discriminación en los 104 aislados de diferentes linajes, en el grupo de 431 aislados LAM y del ST 605 que representan la mayoría de los genotipos en Venezuela, se encontró poca discriminación (Tabla II).

Análisis de las tasas de agrupamiento, discriminación y comparación con la técnica de espoligotipaje:

Los resultados mostraron que MIRU-VNTR con 24 loci es más discriminatorio que la técnica de espoligotipaje en ambos grupos (Tabla III), detectando un mayor número de patrones genéticos diferentes. Por otra parte, MIRU-VNTR 24 loci, espoligotipaje y la combinación MIRU VNTR 24 loci y espoligotipaje, mostraron mayor discriminación en el grupo de 104 aislados que en el grupo de 431 cepas LAM y ST 605, según los valores de la tasa de agrupamiento, el porcentaje de aislados no agrupados y el porcentaje de aislados agrupados. Finalmente, fue posible evidenciar que la combinación de MIRU-VNTR 24 loci con espoligotipaje incrementó ligeramente la diferenciación genética, evidenciándose una disminución en la tasa de agrupamiento, y un aumento en el número de genotipos distintos detectados en los dos grupos de cepas estudiadas.

Evaluación de diferentes combinaciones de loci MIRU-VNTR

DISCUSIÓN

Para un método de epidemiología molecular, el hecho de asignar genotipos en el linaje correspondiente es importante, dado que sugiere que la técnica puede ser aplicada a estudios de evolución y análisis filogeográficos. Los resultados demostraron una excelente consistencia en la clasificación por linajes empleando el método MIRU-VNTR 24 loci comparado con espoligotipaje. Hallazgos similares han sido reportados previamente y han sugerido que la asignación de linajes por MIRU-VNTR 24 loci posee correspondencia con espoligotipaje, Polimorfismo Nucleótido Sinónimo (PNS) y Largas Secuencia de Polimorfismo (LSP) (20, 22, 23). Con respecto a los miembros del linaje T, no se encontró buena concordancia, lo cual también ha sido reportado con anterioridad (20). Estudios previos con marcadores genéticos como PNS sugieren que los miembros del linaje T constituyen cepas genéticamente heterogéneas, y pueden encontrarse asociados a diferentes grupos genéticos, entre ellos, el linaje LAM y Haarlem (24).

El análisis de la diversidad alélica reveló que los loci 4052 (QUB26), 2163b (QUB11b), 2996 (MIRU26), 424 (Mtub04) son los más polimórficos, lo que podría indicar que evolucionen de manera más rápida entre los linajes de M. tuberculosis incluidos en el presente estudio. Resultados similares fueron publicados previamente (10). Sin embargo, se encontraron diferencias en el polimorfismo del resto de los loci MIRU-VNTR con respecto a otras publicaciones (10, 22). En la presente investigación se observó que los loci 2347 (Mtub29), 4348 (MIRU39) y 580 (MIRU04), son poco discriminatorios, contrario a los estudios de Supply y col.(17) y Valcheva y col.(25), quienes demostraron que son moderadamente discriminatorios. Otras diferencias fueron observadas cuando se obtuvo moderada discriminación en los loci 154 (MIRU02), 2461 (ETRB), 3192 (MIRU31) y 3171 (Mtub34), diferente a las observaciones halladas por los estudios anteriormente citados, donde encontraron que cada uno de ellos generaba poca discriminación. Los loci 802 (MIRU40), 577 (ETRC), 2531 (MIRU23), 3690 (Mtub39), 1955 (Mtub21), 2165 (ETRA), 2401 (Mtub30) y 960 (MIRU10), han sido reportados como altamente discriminatorios (7, 17, 22, 26), sin embargo, los resultados del presente estudio indican que poseen una discriminación moderada.

En ese sentido, es posible inferir que las discrepancias encontradas podrían estar relacionadas al origen geográfico del aislado, al genotipo circulante en un área geográfica específica, y la variabilidad existente entre los diferentes grupos genéticos. En el estudio de Valcheva y col. (25) realizado en Bulgaria, la mayoría de los aislados pertenecían al Linaje S. En el caso de la investigación de Supply y col. (10), estudiaron una población de 824 aislados de diferentes regiones geográficas y representantes de los principales linajes en el mundo, lo que explicaría el alto grado de polimorfismo encontrado en su investigación. En el presente estudio, se hallaron diferencias en la diversidad alélica entre el grupo de las 104 cepas analizadas y el grupo de 431 aislados en los loci MIRU-VNTR 2531 (MIRU23), 3690 (Mtub39), 1955 (Mtub21), 2165 (ETRA), 2401 (Mtub30), 960 (MIRU10). Los resultados podrían estar relacionados a la diversidad genética del grupo de los 104 aislados, quienes estaban representados por varios linajes, mientras que, el grupo de 431 aislados clínicos pertenecían principalmente al linaje LAM predominante en el país y al ST 605 o cepa Carabobo, único en Venezuela (16).

La presencia de genotipos únicos aislados en regiones geográficas específicas de Venezuela, como el caso de los STs 1691, 1696, 1698, 1702 y la cepa Carabobo, así como el predominio de los STs 17, 93, 42 y 53 previamente descritos (16), indujo a evaluar la discriminación de espoligotipaje, MIRU-VNTR 24 loci y la combinación de ambos en un grupo de aislados con diversidad genética y otro grupo que representara una distribución de genotipos similar a los descritos en Venezuela. En ese orden de ideas, la técnica de espoligotipaje mostró ser menos discriminatoria con respecto a MIRU-VNTR 24 loci como ha sido descrito anteriormente (3, 10, 24, 27), y cuando espoligotipaje fue acoplado a MIRU-VNTR 24 loci, en el grupo de 104 aislados con diversidad genética, la detección en el número de clusters apenas se incrementó ligeramente, como ha sido demostrado en investigaciones previas (9, 10, 27-29). Sin embargo, cuando la combinación de ambas técnicas fue utilizado en el análisis de 431 cepas, el número de patrones diferentes mejoró considerablemente, debido principalmente a la subdivisión por espoligotipaje en ciertos clusters definidos por MIRU-VNTR 24 loci. Se pudo constatar, que espoligotipaje subdividió únicamente 2 clusters de MIRU-VNTR 24 loci. Las cepas de los ST1698 y ST 605 conformaron un cluster por MIRU-VNTR 24 loci, pero el uso adicional de la técnica de espoligotipaje las subdividió, ya que la cepa 1698 posee un espaciador adicional en la posición 15. Un caso similar se presentó con otro cluster, conformado por aislados del ST1696 y ST93, idénticas por MIRU-VNTR 24 loci, donde la subdivisión generada por espoligotipaje se debió a la diferencia en 3 secuencias espaciadoras adicionales (posiciones 4,5 y 6) en los aislados del ST1696.

Con base a este hallazgo, inicialmente fue posible sugerir la aplicación de la combinación de MIRU-VNTR 24 loci y espoligotipaje en estudios epidemiológicos en Venezuela, con el fin de lograr un mayor grado de diferenciación y así definir con mayor certeza posibles brotes y transmisión de la TB. Además, el presente estudio demostró que la combinación de 15 loci detectó menos genotipos que el formato de 24 loci, como ha sido reportado previamente (27, 28). Sin embargo, todas las combinaciones de loci MIRU-VNTR ensayadas, incluyendo los 4 loci más discriminativos, resultaron ser más discriminatorios que la combinación 12t, como fue demostrado en un estudio previo (10). Este resultado permitió proponer una nueva combinación de 12 loci MIRU-VNTR (12inv) para los genotipos circulantes en el país, basado en los 4 loci con mas alta diversidad alélica, acoplados con otros 8 loci moderadamente discriminativos, que juntos proporcionaron una discriminación similar a los 15 loci MIRU-VNTR propuestos por Supply y col., en el 2006 (10) y superior al formato 12t propuesto en el año 2001 (8). Por otra parte, la adición de espoligotipaje a cada combinación MIRU-VNTR mejoró la diferenciación genética.

Estos últimos resultados, sugieren que la combinación 12inv acoplado a espoligotipaje, pudiese ser utilizado para la detección de brotes y transmisión, ya que los valores obtenidos para la diferenciación de patrones genéticos y tasas de agrupamiento son próximos a los obtenidos para el formato de 15 loci acoplado a espoligotipaje. Investigaciones previas, han propuesto el uso de un reducido numero de loci MIRU-VNTR, para discriminar genotipos particulares según la región geográfica del aislado, como lo son el caso de Shamputa y col., en Korea (29), y Zhou y col., en China (30), aplicados todos al genotipo Beijing que circula principalmente en el continente Asiático. Recientemente, Asante-Poku y col. (31), propusieron el uso de un total de 8 loci MIRU-VNTR con la suficiente discriminación para los estudios de EM de los linajes 4 y 5 de M. africanum en Ghana.

Finalmente, quedó demostrado que el uso de un número reducido de loci MIRU-VNTR acoplado a espoligotipaje, en este caso 12 inv loci MIRU VNTR, permitirá investigar la transmisión de la TB, reducir tiempo y costos, y plantea el uso apropiado de las técnicas de EM para estudios de M. tuberculosis en Venezuela, por lo que adicionalmente, se sugiere que en regiones geográficas con distribución de genotipos particulares, sean evaluadas las diversidades alélicas para así optimizar el uso de las combinaciones de loci MIRU-VNTR.

Al Dr. Philip Supply y Eve Willeri del Instituto Pasteur de Lillé-Francia por su invalorable aporte en el entrenamiento de la técnica MIRU-VNTR 24 loci. Al Centro de Análisis de Secuencias Nacional (Cesaan)-Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas. A los entes financiadores, FONACIT, Programa Alma Mater, CDCH UC, y FONACIT Proyecto G-2005000393.

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