ASTO TITERS AND BETAHEMOLYTIC STREPTOCOCCI FREQUENCY IN 10 TO 15 YEARS OLD STUDENTS FROM MUNICIPALITY FRANCISCO LINARES ALCANTARA, ARAGUA STATE, VENEZUELA
Clara Nancy Gutiérrez1, María Zoiret Chacón1, Luis Manuel Pérez-Ybarra1,2, Nurys Alejandra Guzmán1, Yuccely Andreína González3, Juan Jesús Luis-León1
Universidad de Carabobo, Sede Aragua, Facultad de Ciencias de la Salud, Departamento de Microbiología, Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas “Dr. Carlos Palacios”,
2Departamento de Ciencias Básicas, Maracay, Venezuela, 3Industrias Kellogg´s, Laboratorio de Calidad y Seguridad Alimentaria, Maracay, Venezuela. E-mail: claranancy88@hotmail.com / claranancy@gmail.com
RESUMEN
Los estreptococos betahemolíticos de los grupos A (EBHGA, Streptococcus pyogenes), C (EBHGC) y G (EBHGG) inducen la producción de anticuerpos antiestreptolisina O (ASTO) en individuos infectados. En Venezuela, las pruebas más utilizadas para medir estos anticuerpos son las de neutralización de toxinas bacterianas y aglutinación (pasiva) indirecta con partículas de látex. Los individuos colonizados por las bacterias mencionadas pueden permanecer como portadores asintomáticos. El propósito de la presente investigación fue determinar los títulos de ASTO y la frecuencia de estreptococos betahemolíticos en 203 estudiantes de 10 a 15 años del municipio Francisco Linares Alcántara. Los títulos de ASTO se determinaron mediante neutralización y aglutinación (pasiva) indirecta; la frecuencia de EBH se determinó a través del cultivo de exudado faríngeo, el cual se realizó en agar sangre de carnero al 5%. Se encontró que 88,6% (180/203) y 53,2% (108/203) de los individuos tuvieron títulos normales por el método de neutralización y aglutinación, respectivamente. El EBH más frecuentemente aislado perteneció al grupo G (42%), seguido del B (26%), A (11%) y C (5%). Hubo una discrepancia elevada entre los resultados del cultivo y las pruebas serológicas. La prueba exacta de Fisher no encontró diferencias significativas entre las proporciones de títulos elevados para los grupos de pacientes sanos y portadores asintomáticos. Estos resultados indican que el comportamiento de los títulos de ASTO fue similar en ambos grupos.
Palabras clave: ASTO, Streptococcus pyogenes, exudado faríngeo, prueba de neutralización, prueba de aglutinación.
ABSTRACT
Beta-hemolytic streptococci of groups A (EBHGA, Streptococcus pyogenes), C (EBHGC) and G (EBHGG) induces the production of anti-streptolysin O antibodies (ASTO) in infected individuals. In Venezuela, the most common tests used to measure these antibodies are bacterial toxins neutralizing and indirect (passive) agglutination with latex particles. Individuals colonized by the aforementioned bacteria can remain as asymptomatic carriers. The purpose of this study was to determine ASO titers and frequency of beta-hemolytic streptococci in 203 students 10-15 years old from the municipality Francisco Linares Alcantara. The ASO titers were determined by neutralization and indirect (passive) agglutination tests; EBH frequency was determined through the throat swab culture, which was performed on blood agar at 5%. It was found that 88.6% (180/203) and 53.2% (108/203) of the individuals had normal titers by the method of neutralization and agglutination, respectively. The most frequently isolated EBH belonged to G group (42%), followed by B (26%), A (11%) and C (5%) groups. There was a large discrepancy between the results from culture and serology. The Fisher exact test found no significant difference between the proportions of high titers for groups of healthy patients and asymptomatic carriers. These results indicate that the behavior of the ASTO titers is similar in both groups.
]]> Key words: ASTO, Streptococcus pyogenes, throat swab, neutralization test, agglutination test.Recibido: enero 2015. Aprobado: abril 2015.
Versión final: junio 2015
INTRODUCCIÓN
La antiestreptolisina O (ASTO) es una prueba de laboratorio que mide los anticuerpos que se producen en un individuo como respuesta a una infección por Streptococcus pyogenes (estreptococo betahemolítico del grupo A, EBHGA) (Shet y Kaplan 2002, Winn et al. 2008, 2010). Estas bacterias son cocos Gram positivos, catalasa negativa que se agrupan en cadenas (Winn et al. 2008). Por muchos años se le ha atribuido a Streptococcus pyogenes los cuadros de faringoamigdalitis bacteriana en niños y adultos y como agente que desencadena secuelas postestreptocócicas como la fiebre reumática y glomerolunefritis (Martin et al. 2004, Sevenic y Enoz 2007, Sitkiewicz y Hryniewicz 2010). En los últimos años han adquirido importancia clínica los estreptococos de los grupos C y G, sobre todo como productores de faringoamigdalitistis bacteriana (Lindbaek et al. 2005, Winn et al. 2008, Bramhachari et al. 2010, Little et al. 2012, Lopardo 2013).
Todos los seres humanos son igualmente susceptibles a la infección estreptocócica, sin importar el género, la edad y la raza. Sin embargo, se ha observado que la edad es un factor importante en la etiología microbiana de la faringitis y amigdalitis; así se observa que en niños y adolescentes es muy frecuente las afecciones mencionadas, aunque los virus son los agentes etiológicos más comunes, tanto en niños como en adultos. El EBHGA causa 37% de las faringoamigdalitis aguda en niños mayores de 5 años y el 10% en los adultos (Romero et al. 2002, Regoli et al. 2011).
Los individuos infectados por EBGA y otros estreptococos betahemolíticos pueden permanecer como portadores asintomáticos. La tasa de colonización varía con la edad, estación del año y ubicación geográfica, siendo los niños en edad escolar el grupo poblacional más importante con relación al estado de portador asintomático, aunque esta condición también se ha encontrado en la población adulta (Maekawa et al. 1981, Romero et al. 2001, 2002).
Los estreptococos betahemolíticos de los grupos A, B, C y G pueden colonizar el tracto respiratorio alto, tanto en individuos asintomáticos como en pacientes con faringoamigdalitis. Como dato importante, cabe mencionar que los portadores asintomáticos no experimentan elevación del título de anticuerpos contra el estreptococo cuando se comparan con los títulos obtenidos en la fase aguda y convaleciente de la enfermedad. Es difícil diferenciar entre el estado de portador e infección aguda mediante un cultivo positivo sobre todo cuando hay síntomas. Hay que determinar los títulos de ASTO para lograr la diferencia entre uno y otro estado (Kaplan et al. 1971, Shet y Kaplan 2002).
El propósito de la presente investigación fue determinar los títulos de ASTO y la frecuencia de estreptococos betahemolíticos en 203 estudiantes de 10 a 15 años del municipio Francisco Linares Alcántara. Además, se determinó la concordancia entre los títulos de ASTO y el cultivo de exudado faríngeo, así como también se compararon las proporciones de portadores y no portadores para la presencia de títulos altos para ASTO.
MATERIALES Y MÉTODOS
]]> La presente investigación fue de tipo descriptivo y corte transversal. La población en estudio estuvo constituida por 906 individuos inscritos en cuatro instituciones educativas, dos públicas y dos privadas del municipio Francisco Linares Alcántara del estado Aragua, para el periodo escolar 2011-2012. Para la selección de la muestra se utilizó un método de muestreo no probabilístico de tipo intencional. La muestra estuvo constituida por individuos voluntarios que manifestaron su participación en el estudio. Se utilizaron como criterios de inclusión, individuos con edades comprendidas entre los 10 y 15 años, sin síntomas de infección faríngea actual, sin tratamiento con antibióticos actual o que no hayan recibido tratamiento con antibióticos en los últimos 15 días. En esta investigación se consideró un portador asintomático, aquel individuo que tenía un cultivo positivo para EBH y no presentaba síntomas de faringitis (Gianelli y Posse 2007).Respetando las normas éticas concordantes con la Declaración de Helsinki de 1964, enmendada en 2008 y del Código de Ética para la Vida del Ministerio del Poder Popular para la Ciencia, Tecnología e Industrias Intermedias (República Bolivariana de Venezuela) del año 2011, se solicitó el consentimiento informado a todos los padres y representantes de aquellos estudiantes incluidos en la investigación y además se les entregó el propósito de la investigación. La muestra estuvo constituida por 203 individuos.
Se extrajo una muestra de sangre en un tubo sin anticoagulante para la obtención del suero, el cual se utilizó para la determinación de los títulos de ASTO por el método de neutralización y aglutinación (pasiva) indirecta, siendo la metodología a seguir la recomendada en el inserto de los kits comerciales Wiener Lab y Teco Diagnostics, respectivamente. Para este trabajo se consideraron como valores referenciales o normales los indicados en los insertos de los kits comerciales; para neutralización un título inferior o igual a 166 Unidades Todd/mL y para aglutinación títulos inferiores a 200 UI/ mL.
El exudado faríngeo se realizó de la forma convencional utilizando un hisopo estéril, el cual se Título de antiestreptolisina O y frecuencia de estreptococos... incubó en caldo Todd-Hewitt a 35°C durante 4 horas previo a la siembra en agar sangre de carnero al 5% ( 2014). Las placas se incubaron a 35°C en microaerofilia (5%-10% de CO2) durante 24 a 48 horas. A las colonias betahemolíticas sospechosas se les realizó la coloración de Gram, prueba de la catalasa, y sensibilidad a la bacitracina y trimetropim-sulfametoxazol. Para la identificación definitiva de los serogrupos se utilizó la prueba de aglutinación pasiva (indirecta) reversa, basada en la detección de antígenos polisacáridos de la pared celular correspondientes a los grupos A, B, C, D, F y G utilizando un kit comercial (Oxoid Streptococcal Grouping Kit, USA) y siguiendo sus instrucciones.
Se elaboraron gráficas de distribución de frecuencias relativas para los grupos de estreptococos aislados. Adicionalmente, se construyeron tablas de contingencia con las frecuencias absolutas para los resultados de neutralización y aglutinación. Para verificar si hay concordancia entre los resultados de las pruebas de aglutinación y neutralización con los cultivos de exudado faríngeo, y por ende, concordancia entre la presencia del microorganismo y los títulos de ASTO, se aplicó la prueba de concordancia κ de Cohen. Se aplicó la prueba exacta de Fisher para verificar si la presencia de títulos altos estaba asociada con la pertenencia a los grupos de portadores y no portadores. Los datos se procesaron utilizando el programa estadístico Statxact 9.0 bajo ambiente de Windows.
RESULTADOS
En este estudio hubo un ligero predominio del género femenino, con la participación de 122 hembras (60%) y 81 varones (40%). El promedio general de las edades fue 12 ± 1,5 años. Asimismo, hubo preponderancia de individuos con 12 años (n = 49/203; 24,1%) con respecto al total de individuos incluidos en la investigación (datos no mostrados en tablas ni figuras).
La distribución porcentual de los títulos de ASTO hallados mediante la prueba de neutralización, reveló que un total de 180 (88,6%) de los 203 individuos incluidos en el análisis presentaron títulos iguales o menores a 166 Unidades Todd/mL (Fig. 1). Asimismo, en la Figura 2 se representa la distribución porcentual de los títulos de ASTO determinados a través de la prueba de aglutinación con partículas de látex. En la misma, se puede observar que 53,2% (108/203) de los sujetos examinados presentaron títulos menores a 200 UI/mL.
En la Figura 3, se presenta la distribución de los estreptococos betahemolíticos aislados en personas de las diferentes instituciones educativas del municipio Francisco Linares Alcántara, en la cual se observó un predominio de estreptococos betahemolíticos del grupo G (EBHGG, 8/19; 42%), seguido del grupo B (EBHGB, 5/19; 26%), A (EBHGA, 2/19; 11%), F (EBHGF, 2/19; 11%) y C (EBHGC, 1/19; 5%).
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Las Tablas 1 y 2 presentan las frecuencias absolutas bivariadas para los resultados del cultivo y las pruebas de neutralización y aglutinación, respectivamente; en las mismas se observa que hay una discrepancia elevada entre los resultados del cultivo y las pruebas serológicas, en ese sentido, el coeficiente κ de Cohen mostró que no existió vinculación entre los aislamientos positivos en los cultivos de agar sangre y los títulos positivos determinados a través de las técnicas de neutralización (κ = -0,0081; p = 0,9076) o aglutinación con partículas de látex (κ = 0,0646; p = 0,1333), hallándose que no hay concordancia estadísticamente significativa entre ambas pruebas y el aislamiento de estos microorganismos por los métodos empleados.
Para los resultados de la prueba de neutralización se encontró que 10,5% (2/19) de los estudiantes con cultivo positivo presentaron títulos altos de ASTO, este mismo resultado se obtuvo en 11,4% (21/184) de los estudiantes con cultivo negativo; la prueba exacta de Fisher mostró que esta diferencia de proporciones no fue estadísticamente significativa (p = 1,0000); un resultado análogo se obtuvo para la prueba de aglutinación, en la cual 63,2% (12/19) de los estudiantes con cultivo positivo presentaron títulos altos de ASTO, mientras que en el grupo de los estudiantes con cultivo negativo los títulos altos estuvieron presentes en 45,1% (83/184), esta diferencia de proporciones tampoco fue estadísticamente significativa (p = 0,1528) según la prueba exacta de Fisher. Estos resultados indican que para esta población y para cualquiera de las pruebas, las proporciones de presencia de títulos altos de ASTO son homogéneas, es decir, la presencia de un título alto de ASTO no es condición suficiente para declarar al estudiante como portador asintomático por cuanto que las proporciones de presencia de títulos altos fueron homogéneas en ambos grupos.
DISCUSIÓN
Los estreptococos betahemolíticos del grupo A (Streptococcus pyogenes), C y G producen y secretan la hemolisina inmunogénica estreptolisina O, por lo que cuando una persona se infecta produce los anticuerpos denominados ASTO. Estos anticuerpos pueden ser medidos por diversas pruebas de laboratorio como la neutralización, aglutinación (pasiva) indirecta y nefelometría (Díaz et al. 2008, 2010).
Cuando se analizaron los sueros por neutralización, 88,6% resultaron con títulos inferiores o iguales a 166 Unidades Todd/mL, valor referencial recomendado en el inserto del kit; este porcentaje es diferente al obtenido en el departamento de Antioquia en Colombia (Cardona et al. 2002), en el que 55,6% de 506 estudiantes de 6 a 14 años resultaron con títulos inferiores o iguales a 160 Unidades Todd/mL, valor referencial del estudio. Por otra parte, en un estudio llevado a cabo en Ciudad Bolívar, Venezuela (Villarroel et al. 1983) se encontró que 63% de 100 sujetos de 6 a 14 años tenían títulos inferiores o iguales a 166 Unidades Todd/mL. En la presente investigación, por aglutinación con partículas de látex 53,2% de los individuos analizados tuvieron títulos por debajo de 200 UI/mL, valor referencial recomendado en el inserto del kit, este porcentaje difiere de otra realizada en el municipio de Laranjal, estado del Paraná en Brasil (Prestes-Carneiro et al. 2005), donde estudiaron a 411 individuos de 6 a 16 años de edad y obtuvieron que 86,4% de estos individuos tenían títulos inferiores a 200 UI/mL, también valor referencial de la investigación.
En este estudio se aisló Streptococcus pyogenes o estreptococo betahemolítico del grupo A en 11%, porcentaje que difiere de una investigación realizada Título de antiestreptolisina O y frecuencia de estreptococos... en Cádiz, España con individuos de 12 a 18 años, en donde encontraron 17,64% (Miranda 2012). También difiere de otro estudio llevado a cabo con escolares de dos instituciones educativas en Venezuela, estado Zulia donde aislaron a esta misma bacteria en 16,03% (Romero et al. 2002). La importancia de encontrar a esta bacteria en el presente estudio radica en el hecho de que habitualmente se asocia con la faringitis estreptocócica. El grupo B se aisló en un porcentaje importante (26%) siendo muy semejante a lo observado en una investigación llevada a cabo en dos instituciones educativas del estado Zulia con 28,24% (Romero et al. 2002) y difiere de otros estudios como los de Gianelli y Posse (2007), Chávez et al. (2008) y Miranda (2012), en los cuales se recuperó a este microorganismo en porcentajes 11%, 5,88% y 3,77%, respectivamente. Este microorganismo es el principal agente causal de sepsis y meningitis neonatal precoz, así como de infecciones puerperales, sin embargo, esta bacteria puede colonizar las vías respiratorias altas y causar faringitis en niños y adultos (Chávez et al. 2008, Guevara et al. 2008). Es ampliamente conocido desde hace varios años la implicación del estreptococo betahemolítico del grupo C en casos de faringitis estreptocócica, tal como lo reportan diversos autores (Zaoutis et al. 2004, Lindbaek et al. 2005, Shah et al. 2007, Bramhachari et al. 2010, Little et al. 2012, Lopardo 2013), incluso ha sido implicado en un caso de queratouveitis post-faringitis en un individuo de 24 años de edad (Nataneli et al. 2011). Con relación al estado de portador del estreptococo del grupo C, el porcentaje encontrado en esta investigación (5%) es diferente al de un estudio realizado en Cádiz, España (Miranda 2012) donde se aisló en 14,71%.
Con relación al estreptococo betahemolítico del grupo F se puede comentar que este grupo ha adquirido importancia clínica puesto que en un estudio constituyó 6,2% de aislamientos de dicha bacteria en 177 pacientes con faringitis aguda en la ciudad de Hilla, en Irak (Al- Charrakh et al. 2011). Un reporte presenta la identificación de esta bacteria en un caso de otomastoiditis crónica colesteatomatosa en un niño de 8 años de edad, patología comúnmente originada por bacterias Gram negativas y anaeróbicas (Álvarez et al. 2009).
El estreptococo del grupo G representó el grupo más aislado de esta investigación representado por 42%, porcentaje que difiere del obtenido por Devi et al. (2011) quienes lo reportan en 19,81%, mientras que Miranda (2012) y Romero et al. (2002) lo hacen en 17,64% y 19,85%, respectivamente. Este microorganismo fue considerado poco común y no patógeno para el humano, sin embargo Sylvetsky et al. (2002) refieren que se han descrito infecciones serias causadas por el estreptococo betahemolítico del grupo G, incluyendo en piel y tejidos blandos, tales como: otitis media, faringitis, neumonía, meningitis, peritonitis, endocarditis, artritis y sepsis puerperal y neonatal, y han observado un incremento en las bacteriemias que sobrepasa a las causadas por Streptococcus pyogenes, sobre todo en personas mayores con infección de la piel. Jiménez et al. (2013), reportaron un caso de fascistis necrosante ocasionada por este microorganismo. Todas estas implicaciones le dan importancia a esta bacteria desde el punto de vista clínico. La proporción de portadores asintomáticos por estreptococos betahemolíticos cambia según el país, estación del año, humedad, ambiente y edad. Estudios realizados en diversos países indican una baja prevalencia del grupo A y una alta prevalencia de los grupos C y G en países tropicales y subtropicales, siendo esta la posible razón por la que en esta investigación se observa este predominio del grupo G (González-Lama et al. 2000, Romero et al. 2002, Giannelli y Posse 2007).
Cuando se compararon los cultivos positivos en agar sangre de carnero al 5% con los títulos altos de ASTO por el método de neutralización y aglutinación con partículas de látex se encontró que no existen diferencias estadísticamente significativas, considerándose en este estudio, que la detección de títulos positivos a las pruebas de neutralización y aglutinación con partículas de látex no presenta asociación con el aislamiento de estreptococos betahemolíticos en un portador asintomático. Estos hallazgos se corresponden con la definición de portador asintomático de Shet y Kaplan (2002), según la cual, el portador asintomático es aquel individuo que teniendo un cultivo positivo no evidencia una serología con títulos aumentados de anticuerpos de ASTO, es decir los portadores asintomáticos se relacionan con títulos normales de ASTO. Se pudiera decir que en los pacientes asintomáticos, los estreptococos betahemolíticos se comportan como flora o microbiota normal. Sin embargo, en un estudio realizado en Turquía (Ozturk et al. 2004) se encontraron títulos de ASTO aumentados en 34 de 91 escolares con Streptococcus pyogenes y en 27 de 260 no portadores de esta bacteria. Cuando compararon ambos grupos encontraron diferencias estadísticamente significativas, indicando que un título elevado de ASTO junto con un aislamiento positivo puede ser utilizado para identificar un portador asintomático, pero aclaran que el título de ASTO no puede ser usado solo para identificar a estos portadores.
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIÓN
]]> En esta investigación 88,6% (180/203) y 53,2% (108/203) de los individuos tuvieron títulos normales por los métodos de neutralización y aglutinación, respectivamente; no existe concordancia entre los títulos de ASTO y los cultivos de exudado faríngeo, y adicionalmente, no hubo diferencias estadísticamente significativas para la proporción de títulos altos en los dos grupos de individuos para las pruebas realizadas, lo cual indicó que el comportamiento de los títulos de ASTO para los portadores asintomáticos fue análogo al de los individuos sanos. Se hace necesario realizar más estudios que incluyan otros grupos etarios y municipios del estado Aragua a fin de seguir evaluando el comportamiento de los títulos de ASTO en esta región.AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresar su agradecimiento a los estudiantes y representantes, así como al personal docente de las diferentes instituciones académicas que colaboraron e hicieron posible el desarrollo de esta investigación. Este trabajo fue financiado por el Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico de la Universidad de Carabobo (CDCH-UC), Proyectos: CDCH-UC N° 2012-003 y PI-M 173-11.
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