Gina Sánchez-León¹, Andrea Vargas-Rincón¹ y Pedro Jiménez¹

^I Grupo Integrado de Investigaciones en Química y Biología, Facultad de Ciencias Básicas y Aplicadas, Universidad Militar Nueva Granada, Campus Nueva Granada. Cajicá, Colombia. e-mail:  pedro.jimenez@unimilitar.edu.co

Resumen

Los extractos obtenidos a partir de plantas han ido ganando popularidad e interés científico, dado que se ha reportado que presentan actividad antibacteriana y antifúngica. Esta actividad se ha atribuido a los diferentes metabolitos secundarios que están presentes en los extractos. En el caso de la familia Brassicaceae se ha demostrado la presencia de diferentes compuestos secundarios tales como los glucosinolatos y sus derivados (isotiocianatos), así como las fitoalexinas. Así, el objetivo del presente estudio fue evaluar in vitro el efecto antifúngico de los extractos etanólicos obtenidos de Raphanus raphanistrum sobre el crecimiento micelial y la producción de conidias de importantes fitopatógenos como son Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum y Fusarium oxysporum. Igualmente, se determinó si el morfotipo y estado fenológico de la planta (flor morada-blanca y terracota-crema) influye en la actividad que tienen los extractos sobre los hongos, a la vez que se trató de establecer si el órgano (tallos y hojas vs. frutos y semillas) de donde se obtuvo el extracto interviene en la actividad biológica que éste tiene sobre los hongos. Los resultados mostraron que el efecto de los extractos sobre los diferentes hongos es muy variable. Es posible que la variación se deba a la diferente capacidad que poseen los microorganismos para detoxificar los compuestos presentes en los extractos. El efecto de los extractos en la conidiación fue también muy variable y en muchos casos, particularmente para el hongo C. acutatum, el extracto indujo positivamente la conidiación. Igualmente, ningún compuesto mostró actividad fungitóxica y en todos los casos la inhibición fue de tipo fungistática.

Palabras clave adicionales: Botrytis cinerea, Brassicaceae, Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysporum, glucosinolatos

Evaluation of the antifungal activity of two ethanolic extracts of Raphanus raphanistrum morphotypes on three phytopathogenic fungi

Abstract

The use and the scientific interest of plant extracts have grown in the recent years since they exhibit activity against bacteria and fungi. This activity has been attributed to the different secondary metabolites present in the extracts. Plants belonging to the Brassicaceae family show different secondary metabolites such as glucosinolates and its derivates (isothiocyanates), and phytoalexins. Therefore, the main objective of this study was to assess the in vitro effect of different ethanolic extracts from the plant Raphanus raphanistrum against the mycelial growth and the conidia production of three important plant pathogens: Botrytis cinerea, Colletotrichum acutatum and Fusarium oxysporum. Additionally, we determined the possible effect of the plant phenologic phase and flower morphotype (violet-white or terracotta-beige flowers) on the activity of the extracts against fungi. Also, we tried to determine if the organ where the extract was obtained from (shoots and leaves vs. fruits and seeds) has an influence on the effect against fungi. Results showed that the effect of the extracts on fungi is highly variable. It is possible that the variability could be due to the differential capacity of the fungi to detoxify the compounds present in the extracts. The effect of the extracts on conidiation was also very variable and in particular in the case of the fungus C. acutatum, the extract activated the conidiation. None of the extracts showed a fungitoxic activity and in all cases the activity was fungistatic.

Additional key words: Botrytis cinerea, Brassicaceae, Colletotrichum acutatum, Fusarium oxysporum, glucosinolates

Introducción

Los extractos obtenidos a partir de plantas han ido ganando interés científico, dado que se ha reportado que presentan actividad antibacteriana y antifúngica (Briceño et al., 2011). Estos reportes atribuyen esta actividad a los diferentes metabolitos secundarios que están presentes en los extractos vegetales (Vig et al., 2009). Los extractos obtenidos de plantas pertenecientes a la familia botánica Brassicaceae se caracterizan por presentar diversas actividades biológicas, dentro de las cuales se encuentran propiedades antimicrobiana, antiviral, antifúngica e insecticida (Björkman et al., 2011; Mendoza-García et al., 2014). Estas cualidades se deben, entre otros, a diferentes compuestos tales como glucosinolatos, isotiocinatos (Malik, 2009) y fitoalexinas (Pedras y Ahiahonu, 2005; Ahuja et al., 2012).

En el caso de la especie Raphanus raphanistrum L. perteneciente a la familia Brassicaceae, se han identificado glucosinolatos como son glucoiberina, glucorafanina, gluconapina, glucobrassicina, glucosinalbina, gluconasturtina, progoitrina, glucoerucina, glucorafenina y glucotropaeolina (Malik, 2009). Los tres últimos conforman más del 90% de estos compuestos en esta especie, lo cual en términos de cantidad equivale a unos 5,70 mol por planta en la etapa de cotiledón, mientras que en la etapa de floración representa unos 1942,4 mol por planta. En el estado de silicua (frutos) este valor disminuye en un 35 %, lo cual equivale a 1262,56 mol por planta (Malik, et al., 2010). Estos valores resultan similares a los reportados por Brown et al. (2003) para Arabidopsis thaliana, quienes reportan altas concentraciones de glucosinolatos en los órganos reproductivos, encontrando en las inflorescencias 25-30 μmol·g^-1, en las silicuas 15-25 μmol·g^-1 y en las semillas 63 μmol·g^-1.

En la familia Brassicaceae se reporta la producción de otros metabolitos secundarios, tales como las fitoalexinas, estos son compuestos antimicrobianos de bajo peso molecular, sintetizados por las plantas como respuesta al estrés de diferente origen, incluido el ataque de patógenos (Agrios, 2005; Pedras y Ahiahonu, 2005; Ahuja et al., 2012). Sin embargo, aún no existe evidencia de producción de fitoalexinas por R. raphanistrum a juzgar por la bibliografía revisada.

En Colombia, los reportes de ataques de B. cinerea, C. acutatum y F. oxysporum sobre diversos cultivos (Rodríguez et al., 2010) y sus efectos sobre la producción agrícola son importantes (Sanabria et al., 2010). Es sabido que el control de estos patógenos, basado en el uso de productos de síntesis artificial, puede tener consecuencias sobre la aparición de resistencias y contaminación,  por esta razón, se inició el estudio de extractos etanólicos obtenidos de los frutos y la parte aérea (tallos y hojas) de R. raphanistrum (Brassicaceae). Con la intención final de evaluar su actividad antifúngica potencial, basada en afectar el crecimiento micelial y la producción de conidios de B. cinerea, C. acutatum y F. oxysporum.

Materiales y métodos

Material biológico: Muestras, consistentes de plantas completas fueron colectados en la Sabana Norte de Bogotá (04º55’ N; 74º05’ W). Luego, en el laboratorio, el material fue seccionado en raíz, tallos, hojas y frutos, antes de deshidratarlo a 25 ^oC durante 8 días (Mendoza-García et al., 2014). Una vez deshidratado el material, con excepción de la parte subterránea, fue utilizado en los posteriores procedimientos. Ejemplares completos fueron depositados en el Herbario Nacional Colombiano ubicado en la Universidad Nacional sede Bogotá D.C., bajo los números de colección 573006, 573007, 573008 y 573009. Los ejemplares fueron identificados como Raphanus raphanistrum, sin embargo difieren en el color de la flor (morada, blanca, crema y terracota). Esta característica está ligada al estado fenológico de la planta, en el caso de la flor morada esta se torna de color blanco después de la fecundación (Conabio, 2009) y para el caso de flor terracota en experimentos preliminares se observó comportamiento similar y la flor va adquiriendo un color amarillo muy leve  denominado crema (resultados no mostrados). Incluso, es posible encontrar plantas en las cuales la pérdida de color o bien no ocurre, o se verifica de manera muy lenta.

Los hongos, B. cinerea, C. acutatum y F. oxysporum, fueron obtenidos de la colección del Laboratorio de Fitopatología de la Universidad Militar Nueva Granada. Estos aislamientos fueron reactivados en Agar Papa Dextrosa (PDA) a 25 ºC.

Obtención de extractos etanólicos: Una vez seco el material para preparar los extractos se separó por color de flor y dos órganos: vástago (incluyendo hojas y tallo) y frutos, así fueron obtenidas ocho fuentes para extraer, a las cuales se les asignó un código: vástago de flor terracota: VT; fruto de flor terracota: FT; vástago de flor crema: VC; fruto de flor crema: FC; vástago de flor morada: VM; fruto de flor morada: FM; vástago de flor blanca: VB; fruto de flor blanca: FB. Este material fue triturado, utilizando un procesador de alimentos.  Se tomaron de 150 a 300 g de material molido, y se maceraron en etanol 96 % durante 72 horas, agitando vigorosamente esta mezcla dos veces al día (Ayambo, 2006). Pasado este tiempo, la mezcla fue filtrada y sometida a destilación a presión reducida a 45 ºC. El residuo obtenido se dejó secar por 24 horas a 35 ^oC y se almacenó a temperatura ambiente (21 ± 2 ºC) hasta su utilización (Colegate y Molyneaux, 2008).

El efecto sobre la producción de conidios se determinó mediante el conteo de éstos, cosechados al final del experimento de inhibición. Para colectar los conidios se procedió a desprenderlos con la ayuda de un rastrillo de vidrio, utilizando para ello tres alícuotas de 3 mL de agua, la suspensión se diluyó hasta 10^-2, y se procedió a contarlos utilizando una cámara de Neubauer. Los resultados de los conteos se utilizaron para estimar el número de conidios/cm² de la colonia fúngica.

Determinación del efecto fungicida o fungistático: Para determinar si el efecto observado era un efecto fungistático o fungicida, discos de 3 mm de diámetro y 3 mm de altura fueron tomados de los bordes de las colonias crecidas en cada uno de los tratamientos anteriores e inoculados sobre PDA a concentración completa. Estas cajas fueron incubadas a 21 ± 2 °C durante 72 horas, luego de las cuales se evaluó si ocurrió o no crecimiento de hifas (Soliman y Badeaa, 2002; Veloz-García et al., 2010). Aquellos casos en los que las hifas reactivaran su crecimiento se consideró que el efecto del extracto era fungistático, y aquellas en las que no ocurriera crecimiento se asumió que el efecto era fungicida.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria: Para establecer la concentración mínima inhibitoria se utilizó el método de dilución en agar descrito arriba, pero en este caso se implementaron concentraciones intermedias a las evaluadas en las pruebas de inhibición (0,0; 1,0; 2,5; 5,0 y 10,0 µg·mL^-1). Se utilizaron dos placas excavadas de vidrio (placas de tinción) de 12 pozos, estériles. En cada pozo, se sirvieron 150 µL de medio suplementado con los extractos, dejando homogenizar por 1 hora. Posteriormente, en cada pozo se sembró un disco de 3 mm de diámetro y 3 mm de altura obtenido de zonas de crecimiento activo de cultivos de hongos. Las placas se incubaron a 21 ± 2 °C y se evaluaron una vez que los hongos de algún tratamiento alcanzara el borde del pozo.

Todos los tratamientos de estos experimentos fueron repetidos cuatro veces, y cada vez se establecieron tres réplicas por cada tratamiento y cada una consistió de una caja de Petri.

Para el análisis estadístico se establecieron los intervalos de confianza para cada una de las diferencias con relación al control, utilizando la versión 3.0.1 del programa R (R Development Core Team, 2005).

Resultados y Discusión

Efecto de diferentes extractos sobre el crecimiento micelial de B. cinerea, C. acutatum y F. oxysporum

En el Cuadro 1 se puede notar el efecto sobre el crecimiento micelial de los 8 extractos evaluados en este trabajo. En caso de B. cinerea, cinco de los extractos ejercieron un efecto inhibitorio del crecimiento micelial cuando se utilizaron  a  la  dosis  más  alta  (10 μg·mL^-1) siendo  el  extracto  que  ejerció  la  mayor inhibición el extracto de plantas de flor morada (FM). Los extractos provenientes de plantas en etapa  fenológica  de  flor  terracota  y  flor  crema no  presentaron  efecto  inhibitorio  a  ninguna  de las concentraciones utilizadas cuando se trató de los  extractos  de  vástago,  VT  y  VC,  mientras que los provenientes de fruto, FT y FC, sí presentaron efecto inhibitorio pero sólo a la concentración más alta evaluada. Los extractos provenientes de plantas de flor morada y flor blanca, ejercieron efecto inhibitorio que se mantuvo a medida que se aumentó la concentración evaluada, con la excepción del extracto proveniente de vástago de plantas de flor blanca (VB). En este caso, su efecto a dosis intermedia y alta no muestran diferencia, estadísticamente significativa, con el obtenido en ausencia de extracto. El extracto obtenido  de  frutos  de  plantas  de  flor  morada (FM) resultó  el  único  que  ejerció  actividad inhibitoria a todas las concentraciones evaluadas.

Cuadro 1 . Intervalos  de  confianza  y significancia estadística para  las  medias  del  efecto  inhibitorio  de diferentes extractos sobre  crecimiento micelial de B. cinerea (Bc), C. acutatum (Ca) y F. oxysporum (Fox)

Los asteriscos indican diferencias significativas con relación al control (P≤0,05), *Efecto inhibitorio y **Efecto estimulatorio. Los valores 0,00 indican ausencia de diferencias significativas (P>0,05). V= vástago; F= fruto; T= flor terracota; C= flor crema; M= flor morada; B= flor blanca

El efecto inhibitorio bajo y, en algunos casos, ausente encuentra explicación en la posible resistencia a compuestos antifúngicos que podría mostrar B. cinerea. Esta resistencia ha sido explicada por la presencia de sistemas de transporte transmembranal, como los llamados transportadores ABC (ATP-binding cassette transporters) y las MFS (major facilitator superfamily). Estos sistemas pueden excretar desde el citoplasma un amplio rango de sustratos, entre ellos metabolitos tóxicos y compuestos antifúngicos químicamente heterogéneos (Elad et al., 2007). Y en el caso de comprobarse la producción de fitoalexinas por la planta, podría provenientes de plantas de flor terracota y crema (VT, FT, VC y FC) presentan efectos similares frente a cada hongo particular (Cuadro 1), lo cual pudiera en alguna forma estar asociado a la presencia de diferentes fitohormonas en la etapa fenológica correspondiente a cada color de flor. En todos los extractos, la mayor inhibición se presentó a la mayor concentración (10 µg·mL-1). Por otra parte, se esperaba que los extractos obtenidos de frutos presentaran mayor efecto inhibitorio debido a la cantidad de metabolitos secundarios que acumulan como un mecanismo de protección de los propágulos (Malik, 2009), los resultados parecen corroborar esta idea.

El efecto de los extractos sobre la producción de conidios de C. acutatum (Cuadro 2) en una clara estimulación de la producción de estos, con tres excepciones: los casos de FB a concentración baja e intermedia, y VB a baja concentración. Así a medida que aumentó la concentración de los extractos, aumentó la producción de conidios, lo cual se debe a que C. acutatum responde al estrés generado por los extractos aumentando la producción de conidios corroborando lo establecido por Osorio-Concepción et al. (2013). Adicionalmente, al contrastar los resultados obtenidos para crecimiento y producción de conidios se puede notar que los tratamientos que afectan más severamente el crecimiento son los que inducen una mayor conidiación, lo cual puede considerarse como una reafirmación de lo propuesto por Osorio-Concepción et al. (2013).

Cuadro 2. Intervalos de confianza y significancia estadística para las medias del efecto inhibitorio sobre la conidiación de B. cinerea (Bc), C. acutatum (Ca) y F. oxysporum (Fox)

Los asteriscos indican diferencias significativas con relación al control (P≤0,05), *Efecto inhibitorio y **Efecto estimulatorio. V = vástago; F = fruto; T = flor terracota; C = flor crema; M = flor morada; B = flor blanca

Para el caso de la producción de conidios de F. oxysporum (Cuadro 2), los resultados son parecidos a los obtenidos en el caso anterior. De los tratamientos que produjeron resultados que difieren de manera significativa del control, solo uno de ellos produjo reducción de la conidiación el extracto VB, todos los demás indujeron un aumento de la cantidad de conidios producidos por unidad de área. El extracto VB produjo el mayor efecto inhibitorio a concentración intermedia (1 µg·mL^-1).

Estudios previos han mostrado que la respuesta de los hongos a los estímulos externos, por ejemplo extractos vegetales y concentraciones empleadas, es variable (Espinosa-García y Langenheim, 2003). Es por esto que algunos extractos inhiben el crecimiento micelial de unos hongos y otros actúan mejor inhibiendo la producción de conidios, hecho que podría explicar el porqué los resultados obtenidos en este trabajo varían entre los tres hongos usados.

Actividad fungicida o fungistática. Se evidenció que los extractos presentaron actividad fungistática. Esto se demostró al reinocular los hongos sometidos a cada tratamiento en un medio sin complementar, y se observó crecimiento micelial después de 3 a 5 días, indicando fungistasis.

Concentración mínima inhibitoria: La concentración mínima inhibitoria de los extractos no pudo ser determinada, debido a que el micelio de los hongos mostró crecimiento, aún en la concentración más alta (10,0 µg·mL^-1) del extracto etanólico.

Conclusiones

No existe una respuesta general de los diferentes hongos ante los diversos extractos. La utilización de las mayores concentraciones de éstos indujo en la mayoría de los casos una respuesta de inhibición del crecimiento, la cual resultó  ser  de  tipo  fungistático.  Sin  embargo, debe destacarse que C. acutatum presentó ocurrencia de hormesis al menos para crecimiento micelial.

La conidiación fue particularmente estimulada por los extractos, lo cual apunta a una respuesta ante el estrés, que aun cuando ha sido reportada para uno de los hongos, B. cinerea, resultó una respuesta común en nuestros experimentos.

No es posible generalizar sobre las actividades de un extracto particular, sin embargo aunque no pudo ser calculada una CMI es posible afirmar que sí se registraron efectos los cuales ameritan posterior estudio para posibles aplicaciones prácticas.

A la Dra. Silvia Restrepo por su lectura crítica y sus aportes en la preparación final de este artículo.  A  la  Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad Militar Nueva Granada, Proyecto CIAS 940.

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