Enrique E. Pérez Pinto1 & Darjaniva Molina de Fernández2
1 Dirección General de Salud Ambiental, Ministerio del Poder integrado, considerando el saneamiento ambiental y Popular para la Salud (MPPS). Maracay, Venezuela.
2 Servicio Autónomo Instituto de Altos Estudios de Salud "Dr. Arnoldo Gabaldon", Centro de Estudios de Enfermedades Endémicas y Salud Ambiental. Ministerio del Poder Popular para la Salud (MPPS). Av. Bermúdez Sur Nº 93, Maracay, República Bolivariana de Venezuela.
*Autor de correspondencia: darja2410@gmail.com.
En el presente estudio fueron determinados los niveles de resistencia a insecticidas en larvas de Aedes aegypti de tres municipios del estado Aragua – Venezuela (Girardot, Mario Briceño Iragorri y Urdaneta), en comparación con una cepa susceptible (Rockefeller), a través del método de inmersión de la OMS. Se evaluaron los insecticidas organofosforados (malatión, pirimifos metil y temefos) y el carbamato (propoxur). Se encontró resistencia al malatión en las tres cepas, con valores de FR50 de 69,50x; 150,6x y 113,52x; para las cepas Girardot, Mario Briceño Iragorri y Urdaneta, respectivamente; sugiriendo esta diferencia en los niveles de resistencia a este insecticida, que la naturaleza del fenómeno es focal. Todas las cepas resultaron susceptibles a los organofosforados pirimifos metil y temefos, y al carbamato propoxur. Estudios con sinergistas PB y DEF demostraron que las enzimas del grupo multifunción oxidasas están implicadas en el desarrollo de la resistencia al malatión. Los resultados aportan información referencial, sobre el comportamiento de las cepas frente a insecticidas durante el periodo de estudio y deben ser tomados en consideración para la implementación de estrategias para el manejo y vigilancia de la resistencia a insecticidas a nivel local.
Palabras clave: Aedes aegypti, insecticida, resistencia, Aragua, carbamato, malatión, organofosforados.
Focal resistance to organosynthetic insecticides in Aedes aegypti (Linneaus, 1762) (Diptera: Culicidae) from different municipalities in Aragua state, Venezuela.
SUMMARY
In the present study the levels of resistance to insecticides in larvae of Aedes aegypti were determined in three municipalities of Aragua state, Venezuela (Girardot, Mario Briceño Iragorri and Urdaneta), in comparison with a susceptible strain (Rockefeller), through the WHO method of immersion. The organophosphorous insecticides (methyl malathion, pirimiphos methyl and temephos) and the carbamate (propoxur) were evaluated. Malathion resistance was found in the three strains, with values of FR50 69.50x, 113.52x and 150.6x to the strains from Girardot, Mario Briceno Iragorri and Urdaneta respectively, suggesting that differences in the levels of resistance to this insecticide, is a phenomenon of focal nature. All strains were susceptible to the organophosphate pirimiphos methyl, temephos and the carbamate propoxur. Studies with synergists PB and DEF showed that the enzymes in the group multifunction oxidases are involved in the development of resistance to malathion. The results provide reference information on the behavior of the strains compared with insecticides during the period of study and should be considered for the implementation of strategies for managing and monitoring of insecticide resistance locally.
]]> Key words: Aedes aegypti, insecticide, resistance, Aragua, carbamate, malathion, organophosphorous.Recibido el 06/12/2008 Aceptado el 09/07/2009
INTRODUCCIÓN
Entre de las principales especies transmisoras de arbovirosis se encuentra Aedes aegypti, mosquito de origen africano (Etiopía) que inició hace siglos una dispersión cosmopolita, acompañando los viajes del hombre a través del globo terrestre (Salvatella, 2005). Este insecto es un díptero perteneciente a la familia Culicidae, Sub-género Stegomyia Theobald, 1901, uno de los más estudiados en salud publica en virtud de su importancia como vector de algunos virus que constituyen serios problemas de salud, tanto al hombre como a otros vertebrados en América, África y Sureste de Asia (WHO,1986a; Tabachnik, 1991). Se encuentra disperso entre de las latitudes 45°N y 35°S, en las zonas isotermales intermedias, y es altamente susceptible a temperaturas extremas (CDC, 1980; Salvatella, 2005). Una de las principales arbovirosis que transmite éste vector es el dengue, que en nuestro continente se mantiene debido a las malas condiciones de vida que aun persisten en estos países, lo cual constituye una de las principales causas de sus reemergencias y que expone a un alto número de personas al riesgo potencial de ser afectados por esta patología con el consecuente impacto en la salud publica (Rodríguez et al., 2004).
Las estrategias o programas de control de Ae. aegypti están basadas en el concepto de control integrado, considerando el saneamiento ambiental y la educación sanitaria como herramientas principales a fin de lograr la participación comunitaria en la eliminación de criaderos positivos y potenciales de éste insecto; no obstante, a menudo es necesario el uso del componente químico para las operaciones de control (WHO, 1984; 1986a)
Uno de los principales obstáculos en la aplicación del control químico, lo constituye la resistencia que ha desarrollado este vector a una variedad cada vez más elevada de insecticidas órgano sintéticos; lo cual favorece la transmisión de la enfermedad y se transforma en una gran amenaza para la salud en el ámbito mundial (WHO,1986b).
La aparición continua de casos de dengue en el estado Aragua, Venezuela, permite especular que la situación del dengue en esta entidad es de carácter endémico, lo cual, unido al problema de la resistencia a insecticidas y al hecho de que el número de compuestos en este campo es bastante reducido, fueron factores considerados para la realización de esta investigación, la cual se propuso determinar los niveles de resistencia a insecticidas en tres municipios del estado Aragua en Venezuela, considerando como premisa fundamental que la resistencia a insecticidas es focal (Brogdon & Mc.Allister, 1998) y que su manejo debe ser específico, lo cual se traduciría en una mejor utilización de los mismos y en una mejor aplicación de los programas de control de éste vector.
MATERIALES Y MÉTODOS
Insectos
La muestra estuvo comprendida por mosquitos Aedes aegypti de los municipios Girardot (10º35’02’’N, 62º59’12’’ O), Mario Briceño Iragorri (10º35’02’’ N, 62º59’12’’ O) y Urdaneta (09º39’42”N, 66º50’04”O), colectados en fase inmadura de criaderos potenciales urbanos durante estación lluviosa en los años 2002 y 2003 entre las 8:00 y 18:00 horas y luego desarrolladas en el insectario del Centro de Estudios de Enfermedades Endémicas y SaludAmbiental (CEEESA), del Instituto de Altos Estudios en Salud “Dr. Arnoldo Gabaldon” (IAES). Como patrón susceptible a insecticidas se evaluó la cepa Rockefeller suministrada por el Centers for Disease Control (CDC), San Juan de Puerto Rico.
]]> InsecticidasFueron evaluados soluciones cetónicas de los insecticidas organofosforados: malatión (96%), pirimifos-metil (92%) y temefos en presentación grado técnico (GT), sin valor comercial, suministrados por la compañía Internacional de Insecticidas C.A. (INICA) y el carbamato propoxur, suministrado por Bayer de Venezuela. A partir de soluciones madres fueron preparadas distintas concentraciones siguiendo técnicas de volumetría.
Como sinergistas fueron utilizados: Butóxido de Piperonilo (PB) y S,S,S,- tributil fosforotritioato (DEF) inhibidores de las enzimas multifunción oxidasas y esterasas, respectivamente.
Ensayos biológicos
Los bioensayos se realizaron siguiendo el método de inmersión de la World Health organization (WHO, 1981), exponiendo las larvas de tercer estadío tardío o cuarto instar temprano a concentraciones de insecticidas que provocaron mortalidades entre 2 y 98 %. Se utilizaron vasos plásticos desechables (150 mL de capacidad) los cuales fueron llenados con 99 mL de agua de grifo y posteriormente se le añadieron 20 larvas. Se evaluaron 5 concentraciones y 5 repeticiones para cada una de ellas, aplicándoles en cada vaso 1 mL de insecticida en acetona. Para cada concentración se evaluó una repetición como grupo control al cual sólo se le colocó1mLde acetona. Una vez colocado el insecticida se registró la mortalidad a las siguientes 24 horas.
El análisis de los resultados se realizó por regresión simple a través del método Logaritmo-Probit (Raymond, 1985) y se determinó la concentración letal cincuenta (CL50) y la concentración letal noventa (CL90).
El nivel de resistencia de cada una de las cepas evaluadas se determinó a través del cálculo del factor de resistencia cincuenta (FR50) para cada insecticida, sobre la relación de la CL50 de la cepa de campo y la CL50 de la cepa patrón susceptible Rockefeller, indicando en (X) el número de veces que la cepa de campo es más resistente a un insecticida. Se utilizaron los criterios de resistencia a insecticidas propuestas por la Organización Mundial de la Salud para interpretar los resultados originados de la determinación del factor de resistencia (FR50) y establecer de esta forma, si una cepa es o no resistente a alguno de los insecticidas evaluados. Estas categorías fueron las siguientes: FR50: 0-10 = susceptible; FR50 10-20 = verificación y FR 50 >20 = resistente.
Ensayos biológicos con sinergistas
Para la determinación “in vivo” de mecanismos metabólicos, se realizaron bioensayos siguiendo la
metodología de las pruebas de inmersión similares a las descritas anteriormente (WHO, 1981). (4) horas previas a la aplicación de las concentraciones de insecticidas, se aplicó a cada vaso una dosis sub-letal (0,008mg/ L) del sinergista Butóxido de Piperonilo (PB), un inhibidor del grupo de enzimas multifunción oxidasas e igualmente una dosis sub-letal (5mg/L) del sinergista conocido como S,S,S,- tributil fosforotritioato (DEF), un inhibidor del grupo de enzimas esterasas (Rodríguez et al., 2000). Los resultados fueron registrados a las 24 horas y analizados por el método Logaritmo- Probit (Raymond, 1985) a fin de determinar la relación entre los valores de la CL50 del insecticida sólo y la CL50 del insecticida más el sin ergista, lo cual constituye el factor de sinergismo para cada insecticida; valores superiores a 1 indican el efecto sinérgicoRESULTADOS
]]> En la Tabla I se muestran los valores obtenidos al evaluar la cepa Rockefeller con los distintos insecticidas en estudio. Se observan los valores de las concentraciones que causan el 50% (CL50) y 90% (CL90) de mortalidad en esta cepa y los de las pendientes (b) de cada una de las líneas de regresión obtenidas, siendo 7.8 el valor mas alto observado, seguido de 5.09 para el pirimifos metil y 3.66 para el malatión, valores que demuestran la respuesta homogénea de la cepa frente a los insecticidas evaluados.
Los valores de concentración letal 50 (Cl50), pendiente de la recta (b) y el factor de resistencia (FR50) para los distintos insecticidas evaluados en las cepas de Ae. aegypti procedentes de los 3 municipios evaluados son mostrados en la Tabla II. En ésta se puede apreciar los altos valores de resistencia al insecticida malatión que presentan las tres cepas, muy superiores a 20x, correspondiendo el valor más elevado a la cepa Mario Briceño Iragorri con FR 150,6x.
Por el contrario las tres cepas resultaron susceptibles al pirimifos-metil y al temefos, encontrándose valores de FR50 inferiores a 10x. Situación similar fue obtenida con el insecticida propoxur observándose susceptibilidad en las tres cepas con valores de FR50 <10x.
Mediante el uso de sinergistas se evaluaron en vivo, las enzimas que pudieran estar implicados en la resistencia de las cepas Mario Briceño Iragorri y Girardot al insecticida malatión. En la Tabla III se presentan los resultados de la evaluación de ambos sinergistas utilizados con el insecticida malatión en las cepas Girardot y Mario Briceño Iragorri.
De acuerdo con el “factor de sinergismo”, podemos apreciar que la cepa Girardot con la aplicación del butóxido de piperonilo hubo una disminución de la CL50 de 2,52 veces, lo cual representa el efecto sinérgico y que involucra a las enzimas del grupo multifunción oxidasas en la resistencia detectada al malatión. Por otra parte y en virtud de los resultados, en la cepa Mario Briceño Iragorri ninguno de estos mecanismos estaría involucrado en la resistencia de la cepa frente al malatión
DISCUSIÓN
La evaluación periódica de la susceptibilidad de los vectores a los insecticidas permite tanto la identificación de los insecticidas a usar en los programas de control, como la adecuada planificación de estrategias para el manejo de la resistencia, a fin de identificar el momento oportuno para realizar cambios en los tipos de insecticidas para mantener las poblaciones de vectores susceptibles. Este trabajo evaluó el estado de susceptibilidad en lavas de Ae. aegypti de dos municipios del estado Aragua, Girardot, Mario Briceño Irragori y Urdaneta, con incidencia de dengue y/o altos niveles de infestación de este mosquito. Se determinó que las cepas fueron resistentes al malatión y susceptibles al pirimifos metil y a temefos. En tal sentido, la resistencia al malatión puede deberse al hecho de que en Venezuela este insecticida ha sido y es utilizado ampliamente en salud pública en las campañas de control de dengue e inclusive en la agricultura, lo que ha podido presionar selectivamente a esta especie y causarle los niveles de resistencia encontrados (PAHO, 1990). La presión de selección ejercida sobre los adultos se pudiera estar manifestando, como condición hereditaria en las formas larvales. A este respecto la OPS (1997) señala que la resistencia de Ae. aegypti a malatión se ha difundido por todo el Caribe y en algunos países de América Central y América del Sur. No obstante, existen reportes que Ae. aegypti de distintos lugares aún es susceptible a este insecticida (Sames et al., 1996; Bisset et al., 2003; Rodríguez et al., 2004; Sharma et al., 2004; Cardenas, 2007; Fonseca, 2008).
]]> Para aclarar el origen y la dinámica de la resistencia a insecticidas es fundamental investigar sobre los aspectos bioquímicos y genéticos de la resistencia. La identificación de los mecanismos de resistencia es básica para seleccionar con mayor seguridad los insecticidas a usar en los programas de control y evaluar el potencial de desarrollo de resistencia a insecticidas alternativos. En el caso de mecanismos metabólicos, los mismos logran evidenciarse con el uso de sinergistas, ya que estos potencian la acción de los insecticidas inhibiendo la actividad de algunas enzimas, teniendo que el sinergista S,S,S,-tributil fosforotritioato (DEF) inhibe las enzimas esterasas y GST, mientras que el sinergista butoxido de piperonilo (PB) inhibe las enzimas del grupo multifunción oxidasas.En este trabajo, se demostró con el uso de sinergista PB que las enzimas del grupo multifunción oxidasa actúan como mecanismo de resistencia frente al malatión en las cepas Girardot y Mario Briceño Iragorri, mientras que con el sinergista DEF se encontró que las enzimas esterasas participan como mecanismo de resistencia al malatión en la cepa MBI. Los resultados concuerdan con los reportados por Bisset et al. (2007) quienes han documentado la participación de las enzimas metabólicas basadas en la alta actividad de esterasas en la resistencia a insecticidas organofosforados en poblaciones naturales de Ae. aegypti en distintos países de Latinoamérica. Ahora bien, en relación al pirimifos metil, las tres cepas resultaron susceptibles ya que los valores de FR50 fueron inferiores a 10x; sin embargo, Rodríguez et al. (1999) al evaluar larvas de una cepa de Ae. aegypti de Santiago de Cuba, encontraron que la misma mostraba resistencia moderada al pirimifos– metil. Posteriormente Bisset et al.(2003), reportaron resistencia en larvas de dos cepas de Ae. aegypti de Panamá a pirimifos-metil.
Los resultados encontrados en la presente investigación sugieren la vigilancia periódica de la resistencia de las poblaciones de Ae. aegypti de los municipios evaluados a este insecticida a fin de conservar en las poblaciones el carácter susceptible a este insecticida en virtud de que resultaron resistentes al malatión e implementar la rotación de insecticidas en forma sistemática a fin prevenir una posible resistencia cruzada entre insecticidas organofosforados.
Con respecto al temefos encontramos que los valores de FR50 fueron bastante bajos en las tres cepas lo cual indica la alta efectividad que aún presenta éste insecticida para el control de poblaciones larvarias de Ae. aegypti en los tres municipios evaluados.
En Venezuela, el organofosforado temefos granulado al 1% es el principal y único larvicida químico usado por los programas de control de dengue, dado su uso continuo durante más de 40 años resulta sorprendente la susceptibilidad de las poblaciones de Aedes aegypti a este insecticida. En Venezuela solo se ha detectado resistencia muy puntual en mosquitos del estado Apure (Rodríguez et al. 2001).
Wirth & Georghiou,(1999) en las Islas Vírgenes Británicas, demostraron que Ae. aegypti tenía el potencial de desarrollar altos niveles de resistencia al temefos en virtud de la aplicación de una intensa presión de selección, pero que esta resistencia disminuía cuando se interrumpía la referida presión, sugiriendo estos autores que la resistencia al temefos es inestable en la ausencia de presión de selección por lo que señalaron esto como una posible causa de la efectividad mantenida en el tiempo del temefos. Mekuria et al., (1991), encontraron resistencia al temefos en Ae. aegypti de Santo Domingo, señalando que la misma se debía a que éste era el insecticida de elección para el uso en los criaderos domésticos y peridomésticos.
En el mundo es cada vez más frecuente encontrar registros de resistencia a temefos. En Brasil la resistencia a este larvicida está presente en varios estados, entre ellos, Río de Janeiro, São Paulo; Espíritu Santo y Goias (Braga et al., 2004). También Cárdenas (2007) y Fonseca (2008) reportaron resistencia a temefos en cepas de Ae. aegypti de Colombia.
Aun cuando en el presente estudio no se encontró resistencia al temefos, se sugiere la rotación con insecticidas biológicos o inhibidores de crecimiento como forma de conservar poblaciones susceptibles a este insecticida y preservar la vida útil de este producto. Con relación al insecticida carbamato propoxur, también las 3 cepas resultaron susceptibles, lo cual contrasta con los encontrados por Mekuria et al. (1991), quienes hicieron el primer reporte de resistencia a propoxur en Ae. aegypti en el área del Caribe. Posteriormente, Solís (2000) encontró resultados similares en poblaciones larvales de Ae. aegypti en todas las regiones y subregiones de Republica Dominicana.
La alta resistencia observada al insecticida malatión obliga a hacer cambios de insecticidas a fin de retardar el desarrollo de resistencia cruzada con otros organofosforados y carbamatos que resultarían de uso alternativo. Es conocido que ambos grupos de insecticidas ejercen su acción en el mismo sitio, el cual es la acetilcolinesterasa, causando la inhibición de la reacción y haciendo susceptible al individuo expuesto al insecticida (Georghiou & Pasteur, 1978). Existen distintos estudios que hablan de la resistencia cruzada entre los insecticidas organofosforados y los carbamatos. Hemingway et al. (1990) afirman que existe en larvas, resistencia cruzada entre insecticidas organofosforados y carbamatos a diferentes niveles en cepas de larvas de Culex quinquefasciatus, pero también señala que no se ha comprobado la manifestación del fenómeno en adultos de la misma especie frente a ambos insecticidas.
De los resultados obtenidos en el presente trabajo se concluye que existen variaciones en la respuesta frente a los insecticidas en poblaciones de mosquitos, aun dentro de un mismo estado. El estudio realizado a nivel de municipio determinó la naturaleza focal del problema de la resistencia (Brogdon et al., 1999) y debe ser tomado en consideración para la implementación de estrategias para el manejo y vigilancia de la resistencia a insecticidas. El desconocimiento de la realización de estudios sobre focalización de la resistencia a insecticidas conlleva a un mal uso de los mismos, lo que conduce inevitablemente a un manejo errado de la herramienta química en el control de vectores, originando problemas como el incremento de la resistencia a insecticidas en vectores de áreas donde pudiera haberse prevenido o retardado dicho fenómeno.
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