Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiología

Rafael Rangel: Un sabio olvidado

Cándida G. Díaz Rivero

AmpC type betalactamases: Generalities and phenotype detection methods

Las AmpC son serin-betalactamasas pertenecientes al grupo 1 de la clasificación de Bush-Jacoby-Medeiros, presentes de forma natural en diversas enterobacterias y en bacilos gramnegativos no fermentadores como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter baumannii. Estas enzimas son capaces de resistir la inhibición por ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam. Aunque para la detección de AmpC no existen métodos estandarizados por el CLSI, se han diseñado diversas técnicas con elevada sensibilidad y especificidad. Las betalactamasas AmpC están asociadas a elevada mortalidad y, a nivel de laboratorio, con falsos reportes de susceptibilidad antimicrobiana. Por lo tanto, es de vital importancia su investigación de rutina en los laboratorios de microbiología. En la presente revisión se describe el contexto de las betalactamasas AmpC y algunos métodos disponibles para su detección fenotípica.

AmpCs are serine-betalactamases belonging to group I of the Bush-Jacoby-Medeiros classification that occur naturally in diverse enterobacteria and non-fermenting gram negative bacilli such as Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii. These enzymes are capable of resisting clavulonic acid, sulbactam and tazobactam inhibition. Even though there are no standardized methods for detecting AmpC by CLSI, various techniques with high sensitivity and specificity have been designed. AmpC betalactamases are associated with high mortality and, at a laboratory level, with false antimicrobial susceptibility reports. Therefore, its routine investigation is vitally important in microbiology laboratories. In the present review we describe the AmpC context and some methods available for their phenotype detection.

Enteropathogenic bacteria in the añu ethnic community from Laguna de Sinamaica, Zulia State, Venezuela

Los estudios poblacionales sobre prevalencia de enteropatógenos bacterianos son escasos, particularmente en comunidades indígenas. En el presente estudio se investigó la prevalencia de bacterias enteropatógenas en muestras de materia fecal correspondientes a 378 individuos de la etnia añu, de diferente edad y género, residentes en la Laguna de Sinamaica, estado Zulia. Se realizó el cultivo bacteriológico convencional, excluyendo las categorías diarreogénicas de Escherichia coli. Se obtuvieron 71 cultivos positivos (18,8%), con predominio de las infecciones por un solo agente (58 casos, 81,7%), aunque también se detectaron asociaciones entre dos o tres especies (15,5% y 2,8%, respectivamente). En total se aislaron 86 cepas bacterianas, cuya distribución fue la siguiente: Aeromonas spp.: 34 aislamientos (39,5%), Vibrio spp.: 27 (31,4%), Shigella spp.: 11 (12,8%), Campylobacter spp.: 9 (10,5%), Plesiomonas shigelloides: 3 (3,5%) y Salmonella enterica: 2 (2,3%). V. parahaemolyticus resultó la especie predominante (15/86; 17,4%). El riesgo de infección por bacterias enteropatógenas resultó 2,6 veces superior para niños lactantes y preescolares (p < 0,01). La mayoría de los individuos participantes negó presentar sintomatología gastrointestinal. Los resultados demuestran una alta prevalencia de enteropatógenos bacterianos entre la población añu estudiada, con una distribución mayoritaria de las especies que habitualmente forman parte de la microbiota normal de las aguas.

Population studies on prevalence of enteropathogenic bacteria are few, especially in indigenous communities. In the present study we investigated the prevalence of enteropathogenic bacteria in feces samples corresponding to 378 individuals from the añu ethnic community with various ages and gender, living at the Laguna de Sinamaica, Zulia State. A conventional bacteriological culture was done, excluding Escherichia coli diarrheogenic categories. Seventy one positive cultures were obtained (18.8%) with predominance of single agent infections (58 cases, 81.7%), even though associations between two or three species were also detected (15.5% and 2.8% respectively). A total of 86 bacterial strains were isolated, with the following distribution: Aeromonas spp, 34 (39.5%) isolates; Vibrio spp, 27 (31.4%); Shigella spp, 11 (12.8%); Campylobacter spp, 9 (10.5%); Plesiomonas shigelloides, 3 (3.5); and Salmonella enterica, 2.3%). V. parahaemolyticus turned out to be the predominant species (15/86, 17.4%). The enteropathogenic bacterial infection risk was 2.6 higher for lactating and preschool children (p< 0.01). Most of the participating individuals denied presence of gastrointestinal symptoms. The results showed a high prevalence of bacterial enteropathogens in the añu population studied, with a mayor distribution of the species which habitually are part of normal water microbiology.

Classification and identification of Actinomyces species: A comparative phenotype study

Las pruebas fisiológicas y bioquímicas constituyen dos de las principales metodologías utilizadas, principalmente en los laboratorios de microbiología, para la identificación y diferenciación de los actinomicetos. La finalidad de este trabajo fue comparar y evaluar los métodos fenotípicos que son utilizados de manera rutinaria en la identificación de estos microorganismos. Se estudiaron setenta y tres cepas de actinomicetos provenientes de tres laboratorios de microbiología de Venezuela. El comportamiento fisiológico y bioquímico de las cepas en estudio fue evaluado mediante pruebas de descomposición de diferentes sustratos. Los resultados obtenidos permitieron observar diferencias en la identificación preliminar de las cepas realizada por estos laboratorios, conduciendo algunas veces a una nueva identificación de las mismas, gracias a la utilización de estos sustratos. Se pudo observar que la metodología empleada permitió la reclasificación taxonómica de casi todas las cepas estudiadas, lo que sugiere que es necesario estandarizar la metodología de identificación para los actinomicetos.

Physiologic and biochemical tests constitute two of the main methodologies, mainly used in microbiology laboratories, for the identification and differentiation of actinomyces. The purpose of this work was to compare and evaluate the phenotypic methods used routinely for the identification of these microorganisms. The study included seventy three actinomyces strains from three microbiology laboratories in Venezuela. The physiologic and biochemical behavior of the strains was evaluated through decomposition tests using different substrates. The results obtained showed differences in the preliminary identification of the strains done in the various laboratories, leading occasionally to a new identification arisen from the use of these substrates. It was seen that with the methods used it was possible to taxonomically reclassify almost all the strains studied, suggesting that it is necessary to standardize the methods for the identification of actinomyces.

Sanitary conditions of hand-made telita type cheese in Upata, Bolivar State, Venezuela

En este trabajo se investigaron microorganismos indicadores de calidad sanitaria en queso artesanal tipo telita de Upata, municipio Piar, estado Bolívar. Se analizaron 60 muestras y se investigaron estafilococos coagulasa positivos (Staphylococcus aureus) según Norma Venezolana COVENIN 1292-89 como indicador de manipulación; bacterias coliformes según Norma Venezolana COVENIN 1104-96 y presencia de Escherichia coli como indicador de contaminación fecal. Todos los crecimientos bacterianos correspondieron a estafilococos coagulasa negativos con recuentos de hasta 10(4) diluciones decimales. Coliformes totales mostraron recuentos de hasta ≤10(5) NMP/g y coliformes fecales en concentración ≤10(4) NMP/g. Escherichia coli estuvo presente en 43,3% de los quesos. Se concluyó que el queso artesanal tipo telita que se expende en los alrededores de Upata, estado Bolívar, evidencia fallas en la manipulación e higiene posterior a su elaboración; y por no cumplir con los criterios que establece el Reglamento Centroamericano de Criterios Microbiológicos de los Alimentos Procesados, se considera un producto que podría representar un alto riesgo microbiológico para el consumidor.

This study investigated microorganisms indicators of sanitary conditions in hand-made telita type cheese in Upata, Piar Municipality, Bolivar State. Sixty cheese samples were analyzed, and coagulase-positive staphylococci (Staphylococcus aureus) were investigated according to Venezuelan COVENIN Regulation 1292-89 as indicator of manipulation, coliform bacteria according to the Venezuelan COVENIN Regulation 1104-96 and presence of Escherichia coli as fecal contamination indicator. All bacteria growths corresponded to coagulase-negative staphylococci with counts up to 10(4) decimal dilutions. Total coliforms showed counts of up to ≤10(5) NMP/g, and fecal coliforms in concentrations of ≤10(4) NMP/g. Escherichia coli, appeared in 43.3% of samples. It was concluded that the hand-made telita type cheese that is sold in the surroundings of Upata, Bolivar State, shows evidences of faulty manipulation and hygienic conditions after its production , and that it does not fulfill the criteria established by the Central American Regulation of Microbiological Criteria For Processed Foods, and is considered as a product which could represent a high microbiological risk for consumers.

Antifungal activity of Burkholderia cepacia isolated from yellow corn (Zea mays L.) under different culture conditions

Se evaluó la actividad antifúngica in vitro de 4 cepas de Burkholderia cepacia aisladas de rizósfera de maíz amarillo (Zea mays L.) de diferentes plantaciones del municipio Montes, estado Sucre, Venezuela, contra hongos fitopatógenos. Se comparó la actividad antagónica con una cepa control de origen ambiental CVCM 626 (ATCC 25416) y un aislado clínico CVCM 1282, empleando el método directo de enfrentamientos duales y un método indirecto de difusión con discos de agar. Las pruebas se realizaron por triplicado, se midió el diámetro de los halos de inhibición formados y se aplicó un análisis de varianza de una vía, así como la prueba Tukey. Las cuatro cepas aisladas (SR2, ER3, LG12 y N10) mostraron una actividad antifúngica similar sobre Trichoderma viride y ocasionaron una inhibición total o parcial de la esporulación en hongos como Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Aspergillus niger y Penicillium expansum. Los mayores halos de inhibición fueron producidos por la cepa control CVCM 626, observándose un promedio de 9,9 mm. No se evidenció ningún nivel de antagonismo utilizando el aislado clínico CVCM 1282. B. cepacia mostró un aumento de la actividad antagónica en presencia de algunas fuentes de carbono como xilosa, maltosa, manosa y fructosa y de aminoácidos como cistina, valina y leucina, en un rango de pH ácido (4 a 5,5), y a una temperatura de 35 ºC.

The antifungal activity against phytophatogenic fungi of four Burkholderia cepacia strains isolated from yellow corn (Zea mays L.) from different plantations at the Montes Municipality, Sucre State, Venezuela, was evaluated in vitro. The antagonist activity was compared by using a control strain of environmental origin CVCM 626 (ATCC 25416) and one clinical isolate CVM 1282, with the direct dual confrontation method, and an indirect method with agar-diffusion disks. The tests were done in triplicate, measuring the inhibition halos that occurred, and applying a one way variance analysis, as well the Tukey test. The four isolated strains (SR2, ER3, LG12 and N10) showed similar antifungal activity over Trichoderma viride and produced a total or partial inhibition of sporulation of fungi such as Fusarium moniliforme, Fusarium solani, Aspergillus niger and Penicillium expansum. The largest inhibition halos were produced by the control strain CVCM 626, with a 9,9 mm average. There was no evidence of any antagonism level using the clinical isolate CVCM 1282. Burkholderia cepacia showed an increase of antagonist activity in presence of some carbon sources such as xilose, maltose, mannose, and fructose and of amino-acids such as cystine, valine and leucine, in an acid pH range (4 to 5.5), and a 35ºC temperature.

Lactoserum alcoholic fermentation by Kluyveromyces marxianus and organic solvents as extractants

Las fermentaciones alcohólicas son realizadas a bajas concentraciones de azúcares, para evitar la inhibición por productos o substratos. La fermentación alcohólica extractiva es utilizada en procesos limitados por la concentración de etanol final. Se estudió la fermentación alcohólica del lactosuero evitando la inhibición del Kluyveromyces marxianus, con la adición de solventes de extracción (ácido oleico, hexadecano, butil laurato y aceite de soja) como extractantes del etanol. Se evaluó la biocompatibilidad, cinética de extracción de los solventes, consumo de sustrato, producción de etanol, crecimiento celular (sin solventes y con solventes seleccionados como mejores extractantes y biocompatibles) y rendimientos globales. El ácido oleico y el aceite de soja fueron los mejores solventes de extracción. La velocidad específica de crecimiento se incrementó con el uso de solventes, siendo mayor con el uso de aceite de soja. La lactosa consumida fue de 97 g/L para la fermentación extractiva con ácido oleico, 81,2 g/L con aceite de soja, y 64 g/L para la fermentación convencional. Se obtuvieron 53 y 44 g/L de etanol con ácido oleico y aceite de soja respectivamente, y 35 g/L de etanol con la fermentación convencional. Queda demostrado que la fermentación alcohólica usando acido oleico puede ser usada para reducir la concentración de etanol en el medio y evitar la inhibición de la levadura en el proceso, lo que conlleva a la posibilidad de usar un substrato con altas concentraciones de azúcares, produciendo un incremento en la productividad del sistema.

Alcoholic fermentations are done under low sugar concentrations to avoid product or substrate inhibition. Extractive alcoholic fermentation is used in processes limited by the final ethanol concentration. Lactoserum alcoholic fermentation avoiding the inhibition of Kluyveromyces marxianus by the addition of extraction solvents (oleic acid, hexadecane, butyl laureate and soy oil) as ethanol extractants was studied. Biocompatibility, extraction kinetic of the solvents, substrate use, ethanol production, cell growth (without solvents and with solvents selected as the best extractants and biocompatible), and global yield were evaluated. Oleic acid and soy oil were the best extraction solvents. Specific growth speed was increased by the use of solvents; the greatest increase was obtained with soy oil. Lactose consumption was 97 g/L for oleic acid extractive fermentation, 81.2 g/L for soy oil, and 64 g/L for conventional fermentation. The ethanol yield was 53 and 44 g/L with oleic acid and soy oil fermentation respectively, and 35 g/L with conventional fermentation. This study demonstrates that oleic acid alcoholic fermentation can be used to reduce the ethanol concentration in the medium and to avoid the inhibition of the yeasts during the process, which entails the possibility of using substrates with high sugar concentrations, obtaining an increase in the productivity of the system.

Structure and ultrastructure of Pythium insidiosum in canine gastrointestinal pythiosis

La pitiosis es una enfermedad granulomatosa que se presenta en humanos y en otros mamíferos, causada por Pythium insidiosum, un pseudohongo clasificado en el reino Straminipila. En Venezuela se han diagnosticado casos de pitiosis en perros con diarrea hemorrágica crónica, sin embargo, las características estructurales y ultraestructurales de las lesiones han sido poco estudiadas. Se planteó como objetivo describir, a través de microscopia electrónica de barrido y de transmisión, la estructura y ultraestructura de P. insidiosum y las lesiones que produce en el tracto gastrointestinal de los perros. Se procesaron para microscopia electrónica muestras de tejido procedentes de caninos con diagnóstico de pitiosis gastrointestinal, referidos al Hospital Veterinario de la Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado. Las muestras examinadas mostraron tejido necrótico, trombosis vascular y numerosas hifas de P. insidiosum, caracterizadas por ser largas, onduladas, de paredes aplanadas, de 3 a 5 µm de diámetro, ramificadas en ángulo de 90° y externamente rodeadas por un material granular electrón denso en forma de incrustaciones, sugestivo del fenómeno de Splendore-Hoeppli. Se concluyó que la pitiosis en caninos cursa con lesiones granulomatosas y trombóticas, donde se observa que el agente etiológico mantiene su integridad, a pesar de estar íntimamente relacionado con células fagocíticas.

Pythiosis is a granulomatous disease that occurs in humans and other mammals, produced by Pythium insidiosum, a pseudofungus classified in the Straminipila kingdom. In Venezuela, pythiosis cases have been diagnosed in dogs with chronic hemorrhagic diarrhea; nevertheless, the structural and ultrastructural characteristics of the lesions have not been studied in depth. The objective set for this study was to describe, through scanning and transmission electron microscopy, the structure and ultrastructure of P. insidiosum, and the lesions it produces in the gastrointestinal tract of dogs. Tissue samples from canines with a gastrointestinal pythiosis diagnosis, referred by the Veterinary Hospital of the Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado, were processed for electron microscopy study. The samples examined showed necrotic tissue, vascular thrombosis and numerous P. insidiosum hyphae, characterized by being long, ondulating, with flattened walls, 3 to 5 µm in diameter, ramified in a 90º angle, and externally surrounded by an electron dense granular material in the form of inlays, suggestive of the Splendore-Hoeppli phenomenon. It was concluded that canine pythiosis evolves with granulomatous and thrombotic lesions, which show that the etiologic agent maintains its integrity, in spite of being intimately related with phagocytic cells.

Entamoeba gingivalis and tricomonas tenax in the oral cavity of patients from the integral adult clinic of the faculty of odontology, Maracaibo, Venezuela

Para determinar la prevalencia de Entamoeba gingivalis y Trichomonas tenax en cavidad bucal, se analizaron 50 muestras de la cavidad bucal de individuos de ambos géneros que acudieron a la Clínica Integral del Adulto de la Facultad de Odontología de la Universidad del Zulia. Se dividieron en dos grupos, de 25 individuos cada uno. Grupo 1, con manifestaciones clínicas de enfermedad (enfermedad periodontal y/o caries dental) al cual se le tomaron muestras de caries dental, placa y cálculo dental y grupo 2 o control con cavidad bucal sin manifestaciones clínicas de enfermedad, al cual se le tomó muestras de saliva y placa dental. Las muestras fueron analizadas microscópicamente a través del examen directo y con coloración permanente de hematoxilina férrica. Se observó una prevalencia de protozoarios bucales de un 10%; la especie predominante fue Entamoeba gingivalis en 5 casos, seguida de Trichomonas tenax en 1 caso. El estrato de 20 a 39 años fue el más afectado con un 10% de los casos. Al realizar el análisis estadístico resultó significativo (p=0,011) para las variables parasitismo y cavidad bucal enferma. El presente estudio pone de manifiesto una baja prevalencia de los protozoarios bucales en la población estudiada.

Fifty samples from the oral cavity of individuals of both genders who attended the Integral Adult Clinic of the Faculty of Odontology of Universidad del Zulia were analyzed to determine Entamoeba gingivalis and Trichomonas tenax prevalence. The patients were divided into two groups of 25 individuals each: Group 1, with clinical disease manifestations (periodontal disease and/or dental caries) from which we took samples from dental caries, plaque and dental calculus; and Group 2 or control, who had no clinical disease manifestations, from which we took saliva and dental plaque samples. All samples were analyzed microscopically through direct examination and with a ferric hematoxilin stain. There was a 10% prevalence of oral protozoa; the predominant species was Entamoeba gingivalis in 5 cases followed by Trichomonas tenax in 1 case. The 20-39 years age group was the most affected with 10% of cases. The statistical analysis was significant (p=0.011) for the parasitism and diseased oral cavity variables. The present study shows a low prevalence of oral cavity protozoa in the population studied.

Study of human hepatic fasciolosis and intestinal parasitosis in the Mesa Arriba Village, Carache Municipality, Trujillo State, Venezuela

Se realizó un estudio clínico epidemiológico para determinar la ocurrencia de fasciolosis hepática humana y parasitosis intestinales en el caserío Mesa Arriba, municipio Carache. estado Trujillo, Venezuela, zona descrita como endémica para fasciolosis bovina, donde dos casos aislados, se han reportado en humanos. Se estudiaron 98 personas previo consentimiento informado, a quienes se les realizó una encuesta epidemiológica, examen físico, hematología, aminotransferasas, estudio coproparasitológico y serológico: ELISA con antígeno de excreción-secreción de adultos de Fasciola hepatica (AFhES) y Western blot(WB). Con base en los datos obtenidos, se conoció que el 88,8% de los participantes había consumido berro silvestre (Rorippa nasturtium aquaticum) y 59,2% tuvo contacto con ganado vacuno. En el estudio coproparasitológico se encontró que el 47,9% presentó algún tipo de parásito intestinal, 20,4% correspondió a helmintos, 15,3% a protozoarios y 12,2% a infecciones mixtas. No se encontraron huevos de Fasciola hepatica. El 18,4% de las personas mostró eosinofilia. Se obtuvo un suero positivo por el método de ELISA, con bandas inespecíficas al WB-AFhES. Se administró tratamiento específico para parásitos intestinales. No se demostró fasciolosis humana en este trabajo, a pesar de encontrar factores favorables a la infección, pero el mismo representó una aproximación a su estudio epidemiológico en el estado Trujillo.

A clinical-epidemiological study to determine the occurrence of human hepatic fasciolosis and intestinal parasitosis was done at the Mesa Arriba Village, Carache Municipality, Trujillo State, Venezuela, area which has been described as endemic for bovine fasciolosis and where two isolated cases have been reported in humans. The study included 98 persons who, after previously signing an informed consent form, answered an epidemiological survey and were physically examined and submitted to the following laboratory tests: complete hematology, aminotransferase, and coproparasitology and serology; ELISA using Fasciola hepatica adult excretion-secretion antigen (AFhES) and Western Blot (WB). Based on the results obtained, it was found that 88.8% of participants had consumed wild watercress (Rorippa nasturtium aquaticum) and 59.2% had contact with bovine cattle. The coproparasitological study showed that 47.9% had some type of intestinal parasite: 20.4% corresponded to helmints, 15.3% to protozoa, and 12.2% mixed infections. There were no Fasciola hepatica eggs; 18.4% of the individuals showed eosinophilia. The ELISA test gave one positive serum with non-specific WB-AFhES bands. Specific anti-intestinal parasite treatment was indicated. Human fasciolosis was not demonstrated in this study, in spite of finding favorable factors for this infection, but is represents and approximation to its epidemiological study at Trujillo State.

Infection by Hymenolepis diminuta in a child from the Maracaibo Municipality, Zulia State, Venezuela

Se presenta el primer caso descrito en el estado Zulia de un individuo infectado por Hymenolepis diminuta. El hallazgo fue fortuito, al realizar exámenes coproparasitológicos a un grupo de niños que viven en una comunidad de bajos recursos. Sus familiares refieren que, en vista de la frecuencia de síntomas digestivos del niño de 6 años (dolor abdominal y diarrea), recibía regularmente medicamentos antiparasitarios como piperazina, por parte del personal médico del programa Barrio Adentro. Al examen microscópico se observaron huevos de H. diminuta, Blastocystis hominis y quistes de Endolimax nana. Las condiciones higiénico-sanitarias de la vivienda, así como la referencia de presencia de ratas en el sector, confirman la posibilidad de la infección; a pesar de ello, ningún otro miembro del grupo familiar presentó huevos de esta especie en sus heces. Luego de recibir tratamiento específico con albendazol, no se detectaron huevos de H. diminuta en las heces.

The first case of an individual infected by Hymenolepis diminuta in Zulia State is presented. The finding was fortuitous, when doing coproparasitological examinations in a group of children living in a low income community. His family members refer that due to the frequency of digestive symptoms of the 6 year-old child (abdominal pain and diarrhea) he had been regularly prescribed anti-parasite drugs such as piperazine by the Barrio Adentro program medical staff. In the microscopic examination he showed H. diminuta and Blastocytis hominis eggs, and Endolimax nana cysts. The sanitary-hygienic conditions of the household, as well as the reference of rats in the area, confirming the possibility of this infection; in spite of that, no other member of the family group showed eggs from this species in their feces. After receiving specific treatment with albendazol, no H. diminuta were found in his feces.

**Evaluation of the nested PCR technique for Pneumocystis jirovecii diagnosis**

Se realizó un estudio comparativo entre las técnicas de inmunofluorescencia directa (IFD) y la reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCRa) en 62 muestras del tracto respiratorio inferior, con la finalidad de evaluar la técnica de PCRa para el diagnóstico de Pneumocystis jirovecii. Al comparar ambas técnicas, la PCRa obtuvo valores de sensibilidad 100%; especificidad 79,2%; valor predictivo positivo 58,3%; valor predictivo negativo 100% y una concordancia de 84% con la técnica de IFD. La PCRa para el diagnóstico de neumocistosis predice con éxito la ausencia de la enfermedad cuando el resultado es negativo. Ante un resultado positivo, debe tomarse en cuenta la condición clínica del paciente, ya que la prueba no es capaz de discriminar entre colonización e infección.

A comparative study between the direct immunofluorescency technique (DIF) and the nested polymerase chain reaction (nPCR) was carried out in 62 samples taken from the lower respiratory tract in order to evaluate the nPCR technique for Pneumocystis jirovecii diagnosis. When comparing both techniques, nPCR showed 100% sensitivity, 79.2% specificity, 58.3% positive predictive value, 100% negative predictive value, and 84% of agreement with the DIF technique. nPCR used for pneumocystosis diagnosis successfully predicts absence of disease when the result is negative. With a positive result, the clinical condition of the patient should be taken into account since the test is not capable of discriminating between colonization and infection.